Introduction
حظيرة صخبا الإنسان، التي تتألف من طبقة الطلائية، الصفيحة المخصوصة (LP) والعضلات الصوتية، هو الأنسجة الرخوة المتخصصة الذي يحول تدفق الهواء من الرئتين إلى موجات الصوتية لإنتاج الصوت. 1 الطيات الصوتية تتذبذب بشكل منتظم خلال معالجة حكمية العادية، اظهار سلالات تصل إلى 30٪ عند ترددات الأساسية تتراوح 100-300 هرتز. 2 الكبار الصوتية أضعاف LP هو بنية التدرج تتألف من سطحية (SLP)، والمتوسطة (ILP) وعميقة (DLP) طبقة. مجموعات تصنيف مزيد من الظهارة وSLP كطبقة الغشاء المخاطي، ويجمع بين ILP وDLP في الرباط الصوتية. 3 يحتوي على طبقة SLP أساسا مصفوفة غير متبلور مع ألياف كولاجيني فرقت قليلة، في حين يتم تخصيبها في الرباط مع الكولاجين وألياف الإيلاستين ناضجة لتوفير قوة كافية. 4 هيكل وآليات الطيات الصوتية حديثي الولادة تختلف كثيرا عن نظرائهم ناضجة. على الرغم من أن آليةلا تزال غير مفهومة و تنظيم التنمية أضعاف صخبا والنضج الكامل، وأشارت الأدلة التجريبية إلى الأدوار المميزة للإجهاد الناجم عن النطق.
العديد من الظروف الطبية، بما في ذلك الإساءة صوت، والالتهابات، والمهيجات الكيميائية العمليات الجراحية، يمكن أن تلحق الضرر أضعاف صخبا. اضطرابات أضعاف الصوتية تؤثر على ما يقدر ب 3-9٪ من سكان الولايات المتحدة. طرق العلاج الحالية لاضطرابات أضعاف صخبا تقتصر 5 وبرز نهج هندسة الأنسجة القائمة على الخلايا الجذعية باعتبارها استراتيجية واعدة لاستعادة وظيفة أضعاف صخبا. الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) هي بديل مناسب للالليفية أضعاف صخبا صخبا الرئيسي لهندسة الأنسجة أضعاف. يتم بوساطة 6-9 مصير الخلايا الجذعية مواصفات والتنمية الأنسجة لاحق من مكانة محددة يقيمون في، منها الحالة الميكانيكية هو عامل حيوي 10 القوات الميكانيكية والمنظمين أساسيا من الأنسجة التشكل والثانية التوازن، وخاصة بالنسبة الأنسجة التي تتعرض بشكل روتيني لتحميل 11 من منظور هندسة الأنسجة، فقد ثبت أن التعرض لمن الناحية الفسيولوجية ذات الصلة بالتحفيز الميكانيكي يعزز تمايز الخلايا الجذعية والأنسجة محددة مصفوفة إعادة عرض. 12-15
تم تصميم المفاعلات الحيوية زراعة الأنسجة لمحاكاة البيئة الفسيولوجية المطلوب لنمو الخلايا أو الأنسجة في المختبر. لصخبا هندسة الأنسجة أضعاف، فمن الأهمية بمكان وخاصة لإعادة البيئة الميكانيكية من الطيات الصوتية phonating. مثالية الصوتية أضعاف مفاعل حيوي يجب أن يدلي نحو فعال العظة اهتزازي إلى خلايا الثقافة، والسماح التحكم السهل على التردد، السعة ومدة الاهتزازات. Titze وزملاء العمل وضعت مفاعل حيوي الصوتية أضعاف (T1 مفاعل حيوي) 16 الذي يجمع بين تمتد ثابت مع ارتفاع وتيرة (20-200 هرتز) التذبذبات لتحفيز إنتاج البروتينات الخلوية المصفوفة. النقيبز هذه مفاعل حيوي، ودرس ويب وزملاؤه 17 من آثار 10 يوما، الاهتزازات 100 هرتز على الخلايا الليفية الجلدية مثقف في حمض الهيالورونيك (HA) على أساس هيدروجيل. يبني يتعرض للاهتزاز عرضت تعبير مرتفعة من سينسيز HA-2 (HAS2)، decorin، fibromodulin ومصفوفة الفلزي-1 (MMP1)، نسبة إلى ضوابط ثابتة. تم العثور على آثار تنشيطية ليكون الوقت قد حان التابعة. في الآونة الأخيرة، وتجميعها لدينا مجموعة 18 مفاعل حيوي أضعاف الصوتية (J1 مفاعل حيوي) باستخدام مكبر للصوت السلطة، ومولد وظيفة، وهو المتكلم بصوت عال المغلقة وغشاء السيليكون الراسية محيطي التي تنقل الهواء تتأرجح إلى الخلايا المرفقة. وتعرض الخلايا الليفية القلفة حديثي الولادة المزروعة في مفاعل حيوي J1 إلى 1 ساعة من الاهتزاز عند 60، 110 أو 300 هرتز، مع الضغط في الطائرة تصل إلى 0.05٪. اقترح نتائج QPCR أن التعبير عن بعض الجينات ECM تم تغيير معتدلة ردا على الترددات الاهتزازية متنوعةوسعة.
هذه التصاميم مفاعل حيوي، في حين فضول، لديها العديد من القيود. على سبيل المثال، يتطلب النظام T1 عدد كبير من الروابط والقضبان لاقتران الميكانيكية، والحد الأقصى للترددات يمكن بلوغه. علاوة على ذلك، قد يتعرض لخلايا غير مرغوبة الميكانيكية التحريض والسوائل الاضطراب التي تعقد تفسير البيانات. مفاعل حيوي J1، من ناحية أخرى، يسلك منخفضة نسبيا كفاءة تحويل الطاقة وليس سهل الاستعمال. بالإضافة إلى ذلك، في كثير من الأحيان الاهتزاز يفصل يبني خلايا لادن من غشاء السيليكون الأساسية. وJ2 أضعاف صخبا مفاعل حيوي ذكرت هنا، والمصممة على أساس المبدأ نفسه كإصدار J1، هو الأمثل من أجل التناسق والتكاثر. يتم إنشاء الاهتزازات محاكاة معالجة حكمية ديناميكية هوائية في غرف الاهتزاز تركيبها بشكل فردي حيث MSC-بالسكان بولي الليفية (ε-caprolactone) (PCL) السقالات هي فعاليهتأمين اعل. الليزر دوبلر Vibrometry (LDV) يسمح للمستخدم للتحقق من البيانات الشخصية اهتزازي للجمعية الغشاء / السقالة. في مظاهرة لدينا، ويتعرض اللجان الدائمة إلى 200 هرتز الاهتزازات الجيبية مع (من) نمط 1-HR-على-1-HR-قبالة ليصبح المجموع 12 ساعة يوميا لمدة 7 أيام. يتم التحقيق في الاستجابات الخلوية لمنبهات اهتزازي فرض منهجي. وعموما، فإن أضعاف صخبا J2 يوفر معظم ميزات سهلة الاستخدام، مما يسمح لإجراء دراسات ثقافة الخلية الحيوية في إنتاجية عالية والأزياء استنساخه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الجمعية تفاعلات الاحيائية (فيديو 1)
- جعل العفن الألومنيوم (يموت دائرية + فاصل دبوس) مع الأبعاد الداخلية والخارجية محددة سلفا (الشكل 1).
- باستخدام قالب من الخطوة 1.1، افتعال غشاء السيليكون (قطر: 42 مم، سماكة: 1.5 مم، الشكل 1) مع الأكمام الراسخة (قطر: 12 مم، سماكة 0.25 مم ~، التي شكلتها دبوس الفاصل في الشكل 1) في منتصف باستخدام المتاحة تجاريا السيليكون عدة المطاط الصناعي.
- جعل زوج من كتل الاكريليك (الشكل 2 (4، 5)) مع فتحة دائرية (قطر: 24 مم) في الوسط، نقش أعلى (1.8 سم) وأسفل (0.9 سم) مع كتل مطابقة التلال والأخاديد 10
- ساندويتش غشاء السيليكون بين الكتل الاكريليك المقترنة. تأمين التجمع مع أربعة مسامير الزاوية باستخدام مفك البراغي عزم الدوران الدقيقة تعيين إلى قوة ثابتة (35 CN · م). ونتيجة لذلك، ضيق في الماء، 24 ميتم إنشاء مترا و 18 مم غرفة الاهتزاز العميق (الشكل 2C).
- جبل 3 "مجموعة موسعة مصغرة مكبر الصوت (الشكل 2D، 8 Ω/20 W) تحت غرفة الاهتزاز من خلال مجموعة أخرى من مسامير الزاوية على كتلة الاكريليك القاع. عند هذه النقطة، يتم تجميعها وحدة اهتزاز الفردية.
- تكرار سبع وحدات إضافية الاهتزاز. يضعوا أربعة منهم إلى واحد من اثنين من قضبان الألومنيوم ثابتة (40 سم × 10 سم × 2.5 سم) من خلال وضع قواعد مكبر الصوت في فتحات دائرية متباعدة بشكل متساو (الإطارات: 7 سم، وسمك: 2 سم) يقتطع من القضبان. استقرار لكل متكلم عن طريق إدخال المسمار من خلال الجانب من شريط الألمنيوم في كل حفرة دائرية.
- السيطرة بشكل فردي عن طريق مكبرات الصوت المتكلم محدد. ربط مكبرات الصوت الفردي إلى محدد عن طريق ربط أسلاك إلى المدخلات الإيجابية والسلبية على الجسم المتكلم ثم إلى النواتج المقابلة على محدد. يسمح محدد المتكلم الإشارة من روقال انه وظيفة مولد، بعد مروره عبر مكبر للصوت السلطة، للوصول إلى جميع المتحدثين ثمانية في آن واحد (الشكل 2E).
- وضع اثنين من صفائف غرفة، محدد المتكلم والإلكترونيات المرتبطة في ضميمة مكافحة الرطوبة. إيواء التجمع بأكمله في المجال التجاري حاضنة الثقافة الخلية.
- تغذية الكابلات الرئيسية (من خلال أنابيب PVC الصف الطبية) الذي يربط السلطة مكبر للصوت المتكلم ومحدد من خلال التجميع مرشح في الجزء الخلفي من الحاضنة.
2. تصنيع وتوصيف سقالة
- حل الكريات PCL في الكلوروفورم بتركيز 15٪ بالوزن. تحميل الحل في حقنة 10 مل توج مع 21 G-كليلة العضوية الإبرة.
- قفل الحقنة على مضخة المحاقن برمجة وضبط معدل التدفق في 1 مل / ساعة.
- وضع الألمنيوم المغطاة احباط جامع على الجانب الآخر من الإبرة أفقيا، مع إبرة مسافة طرف إلى هواة جمع ~ 18 سم.
- المشبك المعلى إيجابيةمقطع التمساح إلى منتصف الإبرة، والتمساح كليب الأرض إلى مجمع الألومنيوم، ثم تعيين الجهد على الجهد العالي امدادات الطاقة في 15 كيلو فولت. تنبيه: عالية الجهد، والحفاظ على مسافة واحدة من الإبرة.
- بدوره بالتتابع على ضخ حقنة وإمدادات الطاقة؛ بسرعة نظيفة / إزالة حل البوليمر المتبقية المحيطة غيض من إبرة باستخدام منشفة ورقية جافة قبل طائرات الألياف مستقرة وتتشكل تايلور مخروط 19.
- تسمح للألياف تتراكم على جامع آل إلى سمك 250-300 ميكرون ~ (~ 7 ساعة في ظل الظروف الحالية الغزل). تخزين السقالات الناتجة في مجفف فراغ لمدة 1-2 أيام لإزالة أي المذيبات المتبقية.
- صورة السقالات، تفل المغلفة بالذهب، وذلك باستخدام مجهر المسح الإلكتروني لتظهر مورفولوجيا الألياف متسقة. 10
3. الجمعية تفاعلات الاحيائية وتوصيف
- لكمة قرص اسطواني (قطر: 8 ملم) مع أربعة أذرع (طول: 2مم) من PCL حصيرة (الشكل 2A)، ونسج من قبل أول استخدام 12 ملم خزعة قطر لكمة لخفض القطر الخارجي للقرص. ثم استخدم في الثانية، 8 ملم خزعة لكمة لتقديم أربعة 2 مم الشقوق طويلة متباعدة بشكل متساو في جميع أنحاء شفرة دائرية ليسجل أين هي الأسلحة إلى قطع. بعد أن سجل مع 8 مم لكمة، واستخدام شفرة مشرط لقطع حواف الأسلحة إلى الخارج. إدراج السقالة في أخدود من غشاء السيليكون عن طريق الأسلحة الموسعة (فيديو 1). تتسطح السقالة إدراجها عن طريق الضغط بلطف على سطح مسطح الرأس باستخدام الملقط.
- نعلق قطعة صغيرة رقيقة آل احباط (8 مم × 2 مم، شكل متعامد الشكل 2B) لالسقالة PCL لمساعدة انعكاس الليزر.
- تأمين السيليكون الغشاء / السقالة PCL تجميعها (كما هو موضح في الخطوة 1.4) في غرفة الاهتزاز. إضافة 1.5 مل من الماء في غرفة من أجل ترطيب السقالة PCL قبل الاهتزاز.
- باستخدام مولد وظيفة، وإدخال علامة الاهتزازالمرض (على سبيل المثال، 200 هرتز موجات جيبية مع الجهد الذروة إلى الذروة، بي بي، من 0.1 V) إلى غرفة تقع الاكريليك. استخدام الفولتميتر لقياس بدقة الجهد في كل المدخلات المتكلم. ملاحظة: سوف قراءات بي بي من مولد وظيفة تختلف عن الجهد في نهاية المطاف تسليمها للمتكلم.
- تجميع LDV نقطة واحدة وتأمين الليزر رئيس جهاز استشعار الألياف البصرية لترايبود رئيس عموم إمالة. زاوية رئيس مجس بحيث يشير عمودي على الطاولة. ربط رئيس جهاز استشعار LDV إلى وحدة جمع البيانات عن طريق كابل متحد المحور ثم وحدة للمحمول عن طريق USB.
- تركيز شعاع الليزر عموديا على مختلف النقاط المحددة سلفا على غشاء السيليكون (الشكل 2B والشكل 3).
- باستخدام برنامج الحصول على البيانات، وتسجيل تشريد منتصف الغشاء. انقر على زر "إعدادات اقتناء" من القائمة "خيارات"؛ ثم تغيير وضع قياس ل"الاتحاد الفرنسي للتنس221؛ المقبل، انقر فوق "القياس المستمر" في شريط الأدوات الرئيسي ثم انقر فوق الذروة التي تشكل على التردد المختار (الشكل 6D) لتسجيل النزوح.
- رسم العادي النزوح منتصف الغشاء (ث 0) بوصفها وظيفة من الوضع النسبي عبر الركيزة. بناء خارطة الألوان 3D من التشكيل الجانبي اهتزازي السطح باستخدام البرمجيات المنشأ تحليل البيانات 8.5.
4. الاهتزازي خلية ثقافة
- اللجان الدائمة المشتقة من نخاع العظام ثقافة فرعية الإنسان في T150 قوارير زراعة الأنسجة في كثافة البذر الأولي من 4،000-5،000 خلية / سم 2 في وسائل الإعلام MSC الصيانة.
- بعد 7-8 أيام من خلية ثقافة (ل~ 85٪ confluency)، يعرض للتريبسين الخلايا مع كاشف تفارق الخلية مثل accutase، عد باستخدام عدادة الكريات، الطرد المركزي (440 x ج لمدة 5 دقائق)، وإعادة تعليق بيليه خلية في وسائل الإعلام الجديدة الصيانة MSC بتركيز 4.5 × 10 6 خلية / مل.
- تزج scaffo PCLدينار في الايثانول 70٪ O / N. بعد يبخر المذيب، وتعريض الجانبين من السقالة لضوء الأشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم (254 نانومتر) ل5-8 دقيقة.
- نقع السقالة PCL في حل فبرونيكتين 20 ميكروغرام / مل عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إدراج السقالة المغلفة فبرونيكتين في غشاء السيليكون. تجميع مفاعل حيوي على النحو المفصل في الخطوة 1.
- توزيع 40 ميكرولتر من تعليق الخلية بالتساوي على السقالة PCL المضمون. تسمح للخلايا لنعلق ل1-1.5 ساعة قبل إضافة إلى 1.5 مل إضافية وسائل الإعلام الجديدة إلى غرفة الاهتزاز.
- ثقافة السقالة-MSC لادن PCL بشكل ثابت لمدة 3 أيام، وتحديث وسائل الإعلام عند الانتهاء من ثقافة ساكنة.
- فرض أنظمة الاهتزاز المحددة إلى بنيات الخلوية. ملاحظة: وكمثال على ذلك، تتعرض الخلايا إلى 1-HR-على-1-HR-إيقاف (OF) اهتزاز عند 200 هرتز مع فصيل عبد الواحد 0 من ~ 40 ميكرون لمدة 12 ساعة في اليوم لمدة تصل إلى 7 أيام. يتم تعيين بنيات تعرض للالتحفيز اهتزازي كعينات VIB وتلك cultuأحمر ثابت في غرف الاهتزاز متطابقة خدمة ضوابط ثابتة مثل (ستات).
5. التقييم البيولوجي
- جمع 200 ميكرولتر الخلية سائل الإعلام والثقافة من كل غرفة كل يوم (يوم 1 و 3 و 5 و 7) وتجميع مأخوذة من نفس العينة معا (800 ميكرولتر لكل منهما).
- تحديد إنتاج الخلوية من مصفوفة الفلزي-1 (MMP1) وHA باستخدام عدة MMP1 ELISA التنمية وحمض الهيالورونيك تنافسية ELISA عدة، على التوالي، في أعقاب إجراء الصانعين. وفي الوقت نفسه، مقايسة إنتاج الإيلاستين للذوبان السلائف باتباع الإجراء ELISA ذكرت سابقا. 8
- عند الانتهاء من دورة اهتزاز مشاركة في اليوم 7، وإزالة بسرعة يبني الخلوية من غرف الاهتزاز باستخدام الملقط حادة وشطف لهم مع الفوسفات مخزنة المالحة الباردة (PBS، 4 ° C) لفترة وجيزة.
- ل/ تلطيخ ميتة حية، واحتضان يبني مع يوديد propidium (1:2،000 في برنامج تلفزيوني) وSyto-13 (1:1،000 في برنامج تلفزيوني) في وقت واحد لمدة 5 دقائق على RT. صورة بنيات ملطخة المجهر multiphoton متحد البؤر.
- بشكل منفصل، الأداة الإضافية تجميد البنى الخلوية PBS تشطف على الثلج الجاف واستخراج الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية التالية بروتوكول ذكرت سابقا لتحليل الجينات. 9
- التحقق من كمية ونوعية الحمض النووي الريبي المستخرج باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيز. وتستخدم عينات الحمض النووي الريبي مع A260/A280 وA260/A230 نسب 1.8-2.2 لتحليل QPCR اللاحقة.
- عكس نسخ الحمض النووي الريبي (500 نانوغرام / عينة) في [كدنا] باستخدام مجموعة النسخ العكسي متاحة تجاريا.
- نفذ تفاعل PCR على الوقت الحقيقي نظام الكشف عن تسلسل باستخدام المتاحة تجاريا مزيج الرئيسي PCR باتباع الإجراء بالتفصيل سابقا. 8
- تحليل النتائج باستخدام QPCR التجارية برمجيات تحليل البيانات QPCR. لضمان موثوقية من تحليل البيانات، ويعمل جينات مرجعية متعددة (YWHAZ، TBP، PPIA) ك intضوابط ernal، والتباين من الكفاءة التمهيدي محددة يتم أخذها بعين الاعتبار. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
السقالات PCL ملفقة من قبل electrospinning تحتوي على مسام ميكرون الخلالي الحجم والألياف عشوائيا متشابكا مع متوسط قطرها 4.7 ميكرون (الشكل 4A). في التكبير العالي، الأخاديد النانو والمسام واضحة على ألياف الفردية (الشكل 4B). طلاء من السقالات مع فبرونيكتين يحسن hydrophilicity ويسهل التصاق الخلية الأولي / نشر على منصة الاعدام PCL (المراقبة غير منشورة).
يتم تقديمها: (0-،125 V بي بي) للمتكلم تحت كل غرفة الاهتزاز، والهواء محصورة بين الجزء السفلي للغشاء السيليكون ورقة مخروط من الطول الموجي جيبية مع التردد المطلوب (و، 100-300 هرتز) والجهد والدافع مصغرة مكبر الصوت في التذبذب. يتم تسليم التذبذب الهواء إلى السقالة PCL مع أو بدون الخلايا. يستخدم LDV لتحليل الخصائص اهتزاز السقالة و في معين وبي بي،مع مراعاة معامل انكسار الماء (1.33) يظهر 20 الشكل 5 تشريد العادي (ث 0) في مركز السقالة PCL بوصفها وظيفة من بي بي وو. ويتم اختيار الترددات الاهتزاز لتعكس الترددات الأساسية يتحدث الإنسان. 21 هناك علاقة خطية بين ث 0 و بي بي في نطاق 0-،125 V لجميع الترددات التي تم اختبارها. في بي بي معين، ث 0 النقصان مع زيادة و 100-300 هرتز.
يتم اختيار حالة معينة الاهتزاز (و = 200 هرتز، بي بي = 0.1 V) لمزيد من التحليل. الملف الشخصى السرعة بوصفها وظيفة من الوقت (الشكل 6A) يدل على أن إشارة جيبية قدم للمتكلم يتم التقاطها بواسطة السقالة PCL مع الدقة العالية. مركز السقالة PCL تتأرجح طوليا مع سرعة ذروة 52 ملم / ثانية، تسارع الذروة من 66 م / ثانية 2 (~ 6.7g) والنزوح الطبيعي لل~ 40 ميكرون. إشارات التوافقي في 100، 300، 400 و 500 هرتز على الأقل أمر من حجم أقل من تلك التي في التردد الأساسي (200 هرتز). ومع ذلك، إذا كانت قيمة بي بي عالية جدا (0.15 V)، تم الكشف عن قمم التوافقي متعددة من كثافة مماثلة لتواتر الأساسية (الشكل 7). يتم إنشاء الملف الشخصى الاهتزاز عبر السقالة من خلال رصد النزوح الطبيعي من إجمالي 73 نقطة ممثلة على الاتجاهات شعاعي من سطح PCL (الشكل 3). وخارطة الألوان 3D (الشكل 8) يدل على أن الكشف عن اهتزاز على سطح الغشاء هو axisymmetrical نسبة إلى مركز والمواقف يستريح فيها. تم العثور على النزوح الطبيعي أن ينخفض مفردة النغمة من المركز إلى الحافة حيث يتم تأمين الغشاء.
اللجان الدائمة مثقف على السقالات PCL يتم تربيتها في ظروف الاهتزاز المحدد. خلايا تعرض ل7 داذ من التحفيز الحفاظ على استمرارية وانتشار مماثلة الخصائص كما الضوابط ثابت (الشكل 9)، مؤكدا أن السقالات ليفية كانت cytocompatible ونتج عن الاهتزاز تطبق في عدم فقدان قدرتها على البقاء. ويتم فحص الاستجابات الخلوية إلى التحفيز اهتزازي في مستويات مرنا من حيث التعبير عن البروتينات أضعاف صخبا ECM الأساسية، مثل الإيلاستين (جيش التحرير الوطني)، حمض الهيالورونيك سينسيز-1 (HAS1)، Col3A1 وMMP1 (الشكل 10). والاهتزاز يؤدي إلى زيادة 2.3 أضعاف في جيش التحرير الوطني في التعبير يوم 7، نسبة إلى ضوابط ثابتة. كما زادت التحفيز اهتزازي التعبير Col3A1 معتدلة. من الجدير بالذكر أن التعبير عن الانزيمات ECM إعادة عرض رئيسية، HAS1 وMMP1، ويجري تضخيم كبير من إشارات الاهتزاز. على وجه التحديد، أدى العلاج الحيوي في زيادة حظيرة ~ ~ 1.7 و 16.3 لHAS1 وMMP1 التعبير (سواء ع <0.05)، على التوالي، أكثر من الضوابط ثابتة لهم في يوم 7. وعموما، تم تعزيز تأثير استقرائي من الاهتزازات على HAS1 وMMP1 من يوم 3 إلى يوم 7.
لمزيد من إثبات نتائج QPCR، وكميا إنتاج الخلوية من HA، القابلة للذوبان والإيلاستين MMP1 بواسطة ELISA على المستوى متعدية (الشكل 11). الخلايا المستزرعة حيوي تنتج 4.2 ± 0.1 ميكروغرام / ملغ (لكل الجافة الوزن السقالة) الإيلاستين للذوبان بعد 7 أيام من الاهتزازات، في حين أن ضوابط ثابتة تتراكم فقط 2.7 ± 0.2 ميكروغرام / ملغ) الإيلاستين. في المتوسط، لمدة 7 أيام من الاهتزازات يؤدي إلى 2.2-وزيادة 4.7 أضعاف في HA وإفراز MMP1، نسبة إلى ضوابط ثابتة المقابلة.
الفيديو 1: محاكاة 3D تبين تجميع مفاعل حيوي J2. تم إنشاء الفيديو Autodesk 3ds ماكس التصميم (بالإذن من Congfei شيه).
"FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما ">
. الشكل 1 صورة توضح البعد من العفن آل المستخدمة في تصنيع غشاء السيليكون مع الراسخة كم Ø: قطر، د: سمك / العمق، ح: ارتفاع الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 2 مخطط انسيابي يبين التجمع مفاعل حيوي (A) صورة لأربعة الذراع على شكل سقالة PCL؛ (B) وهناك صورة تظهر السقالة PCL المضمون في غرفة الاهتزاز وركز على الجزء السفلي من الغرفة الليزر vibrometer؛ ( C) A-المقطع العرضي عرض آل من الغرفة الاهتزاز. 1: سقالة PCL (الحمراء)؛ 2: سيليكون غشاء (السماوي)؛ 3: آل شريط ثابتة؛ 4: أعلى كتلة الاكريليك؛ 5: كتلة الاكريليك أسفل؛ 6: مصغرة مكبر الصوت؛ (D) عرض الجانب من وحدة الاهتزاز؛ (E) وهناك صورة تظهر التجمع بأكمله. تم تعديل هذا الرقم من تونغ وآخرون 10 حقوق الطبع والنشر عام 2013، ماري آن ليبرت، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. توضيحات من علامة شعاعيا غشاء السيليكون لقياسات LDV نقطة واحدة. تم تعديل هذا الرقم من تونغ وآخرون 10 حقوق الطبع والنشر عام 2013، ماري آن ليبرت، وشركة
ن = صفحة "دائما"> 
الشكل 4. الصور SEM السقالات PCL في تكبير مختلفة. (A) 600X، (B) 7،000 X. تم تعديل هذا الرقم من تونغ وآخرون 10 حقوق الطبع والنشر عام 2013، ماري آن ليبرت، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5. تشريد الطبيعي في مركز للغشاء السيليكون (ث 0) بوصفها وظيفة من وتيرة تطبيق (100 و 200 و 300 هرتز) والجهد القيادة (بي بي = 0-،125 V)، وقد تم تعديل هذا الرقم من تونغ وآخرون 10 حقوق الطبع والنشر عام 2013، ما راي آن ليبرت، وشركة
الرقم 6. خصائص الاهتزاز الكشف في مركز للغشاء السيليكون مع و = 200 هرتز والتشكيل بي بي = 0.1 خامسا (A) سرعة بوصفها وظيفة من الوقت. (B) ملف سرعة كدالة للتردد. (C) تسارع بوصفها وظيفة من التردد. (D) النزوح عادي (ث 0) كدالة للتردد. تم تعديل هذا الرقم من تونغ وآخرون 10. حقوق التأليف والنشر عام 2013، ماري آن ليبرت، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
/ 51594fig7highres.jpg "/>
الرقم 7. التهجير عادي الكشف في وسط الغشاء (ث 0) كدالة للتردد عند عرض موجة جيبية 200 هرتز إلى مكبر الصوت مصغرة في بي بي = 0.15 V.
الرقم 8. 3D مخطط الألوان التي شيدت من قبل gridding السطح باستخدام البيانات التي تم جمعها من النزوح العادي جميع المواقع المحددة على السقالة PCL. تم تعديل هذا الرقم من تونغ وآخرون 10 حقوق الطبع والنشر عام 2013، ماري آن ليبرت، وشركة
الرقم 9. بقاء الخلية، تصور من قبل الحية / تلطيخ الموتى، بعد 7 أيام من الاهتزازات. تم تعديل هذا الرقم من تونغ هر آل 10 حقوق الطبع والنشر عام 2013، ماري آن ليبرت، وشركة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 10. الاستجابات الخلوية إلى التحفيز اهتزازي من حيث التعبير عن أضعاف صخبا ذات الصلة، الجينات ECM. والتعبير الجيني النسبي (أضعاف تغيير) هو تطبيع للضوابط ثابتة في كل يوم 3 ويوم 7 (خط الأساس متقطع). **: فروق معنوية (P <0.05) بين يوم 3 و 7، #: تغيرت بشكل ملحوظ (ع <0.05) نسبة إلى خط الأساس. تمثل البيانات يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM، ن = 4). يتم استخدام اختبار t الطالب الذيل اثنين لتحليل احصائى، مع ع <0.05 يجري اعتبار كبير ديfference (نفس أدناه). تم تعديل هذا الرقم من تونغ وآخرون 10 حقوق الطبع والنشر عام 2013، ماري آن ليبرت، وشركة
الرقم 11. الكمي الكيمياء الحيوية من HA (A)، قابل للذوبان جيش التحرير الوطني (ب) وMMP1 (C) التي تنتجها اللجان الدائمة مثقف على منصة الاعدام تحت PCL ستات وVIB الظروف لمدة 7 أيام. المبلغ الإجمالي للجزيئات ECM في الوزن الجاف سقالة (ملغ) تتمثل يعني ± SEM، ن = 4 من المحاكمة ممثل #: تعزيز معنويا (P <0.05) مقارنة مع الضوابط ستات. تم تعديل هذا الرقم من تونغ وآخرون 10 حقوق الطبع والنشر عام 2013، ماري آن ليبرت، وشركة
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الهندسة ناجحة للأنسجة أضعاف صخبا وظيفية في المختبر يتطلب الترفيه من مثل أضعاف المكروية الصوتية للتوسط في سلوك خلايا متعددة القدرات. ومن المتفق عليه عموما أن النسيج أو العضو الهياكل تعكس المهام التي يتعين عليهم القيام بها. الأنسجة لل22 أضعاف صخبا، تقترح الاهتزازات عالية التردد التي تحدث أثناء معالجة حكمية إلى أن تكون مهمة لنضوج الأنسجة. في دراستنا، وتستخدم السقالات PCL لتوفير الدعم الهيكلي مثل الرباط في حين تم تصميم مفاعل حيوي أضعاف صخبا لإدخال الإشارات الميكانيكية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية إلى اللجان الدائمة مثقف. مفاعل حيوي وصفها هنا (J2) بإنشاء اهتزاز الكهرمغنطيسية من خلال مكبرات الصوت الفردي وينقل ديناميكية هوائية الطاقة إلى الخلايا المستزرعة. مقارنة مع التصميم السابق، 18 النظام الحالي يتحرك مصدر التحفيز الذبذبات مباشرة أسفل كل عينة بشكل جيد، مما يسمح للرا تحويل الطاقة أكثر كفاءة. ونتيجة لذلك، حققت النزوح العادية أكبر من ذلك بكثير وتسارع أعلى باستخدام النظام الحالي. تصميم وحدات يقلل أيضا اختلافات النظام واضطراب الميكانيكية عبر غرف اهتزاز مختلفة.
لدينا تصميم تعتمد على غشاء السيليكون لتقديم إشارات الاهتزاز. ولذا فمن المهم للحفاظ على سلامة الغشاء والتجانس. بعد سكب الحل السلائف في القالب الألمنيوم، فمن المستحسن لإزالة السائل الزائد عن طريق سحب شريحة زجاجية على سطح القالب. يمكن أن تنتج الأغشية متسقة دون أي فقاعات الهواء شرك عن طريق خفض درجة الحرارة علاج مع زيادة وقت المعالجة. بالإضافة إلى ذلك، حل الإيثانول 70٪ يمكن استخدامها لتضخم الغشاء مؤقتا في واجهة الألمنيوم للسماح إزالة سهلة للسيليكون علاجه. لاستيعاب بنيات الخلوية ل 3D ثقافة ديناميكية، أخدود رقيقة المتمركزة مركزيا طق مصبوب في غشاء السيليكون، مثل أن السقالات PCL يمكن الراسية محيطيا في غرفة الاهتزاز. هندسة الأخدود هو قابل للتعديل؛ وبالتالي شكل بناء الخلوية يمكن ضبطها وفقا لذلك إلى تقليد أفضل هندسة الطيات الصوتية الأصلية. 23 إذا لم يتم تأمين السقالة PCL بإحكام في غشاء السيليكون، والإشارات LDV الكشف في PCL في المنطقة والخارجي على السيليكون سوف الغشاء لا تتداخل تماما. عند تجميع مفاعل حيوي، فمن الأهمية بمكان أن جميع مكونات يتم تأمينها وشددت على نفس الدرجة وذلك لتجنب الحركات غير المرغوب فيها والحد من غرفة إلى غرفة الاختلافات.
للتحقق من صحة فائدة مفاعل حيوي، تزرع اللجان الدائمة على السقالات PCL ويتعرضون لفترات متقطعة (OF) الاهتزازات لمدة 7 أيام. لمن الاهتزازات على مدى فترة من عدة ساعات يوميا ويعمل لإعادة إنتاج الظروف الحديث عن المستخدمين صوت الثقيلة، على سبيل المثال، الغناء المهنية المتطلبات البيئية والمعلمين. 23 خلافا ذكرت سابقا المفاعلات الحيوية أضعاف صخبا، لنا لا تسبب أي تأثير ضار أو الصدمة الفسيولوجية للخلايا.
تم العثور على الاهتزازات-200 هرتز لتنظيم تفاضلي إنتاج الخلوية من مكونات ECM الهامة. الإيلاستين هو بروتين الهيكلية الحاسمة التي يتم العثور عليها في جميع أنحاء أضعاف LP الصوتية، ويضفي المرونة ومرونة. مكونات غير متبلور 24 الخلالية، مثل HA، والمساهمة في الحفاظ على الأنسجة السليمة زوجية ومنع تشكيل ندبة. 25،26 اللجان الدائمة تعرض إلى يوم 7 من العلاج إنتاج كمية أعلى بكثير من الإيلاستين من نظرائهم مثقف بشكل ثابت. HA الحيوي هو أيضا حساسة للاهتزازات، وهو ما أكدته نتائج QPCR على HAS1 وELISA النتائج على HA. وتشير هذه النتائج إلى أن التحفيز الذبذبات مكنت من مفاعل حيوي يؤدي إلى إنتاج جزيئات مضادة للندبات.
jove_content "> المتوازن دوران ECM يعتمد على ترسب مصفوفة المتزامنة وتدهورها. النوع الثالث الكولاجين 27 هو رئيسي الألياف الكولاجين شبكي وجدت في الطيات الصوتية، وتوفير الأنسجة مع خصائص الحاملة 28 الاهتزازات لمدة 7 أيام تطبيق هذا القانون تعزيز التعبير الجيني من Col3A1، ولكن في حجم أقل بكثير من الإيلاستين. ولذلك، فإن الاهتزازات تطبيق تفاضلي تنظيم الآلات الخلوية تشارك في تركيب الكولاجين والإيلاستين الثالث. ومن المثير للاهتمام، MMP1، واحدة من كبرى تقوم ال MMPs المشاركة في تدهور المصفوفة والأنسجة إعادة عرض 27 ، حساس جدا إلى العظة اهتزازي. هذه النتائج تتفق بشكل جيد مع التقارير السابقة بشأن الناجم عن الاهتزاز MMP1 upregulation من قبل خلايا شرك في مصفوفة HA 29 وعموما، فإن التحفيز اهتزازي الناتجة عن مفاعل حيوي أضعاف صخبا التوسط عميقا وظائف MSC عن طريق تعزيز التوازن من المصفوفات الصوتية مثل أضعاف.خلالكل شيء، والرواية مفاعل حيوي أضعاف الصوتية المعروضة هنا هي وحدات وسهلة الاستخدام، مما يسمح للخلية ثقافة ديناميكية التي يتعين القيام بها بطريقة استنساخه. ومع ذلك، توجد العديد من القيود في التصميم الحالي. أولا، سعة الاهتزاز، على الرغم من تحسن من الإصدار J1، لا تزال صغيرة بالمقارنة مع الأنسجة أضعاف صخبا. الثانية، لا محاكاة مفاعل حيوي لدينا الاصطدام الثنائية من خلال معالجة حكمية الطيات الصوتية العادية. الثالث، لا يعكس لدينا ليفية PCL سقالة تباين الأنسجة. ويكرس العمل في المستقبل لتحسين تصميم لمحاكاة أفضل الظروف معالجة حكمية الأصلية. وفي الوقت نفسه، سيتم استكشاف الأنظمة المثلى للثقافة دينامية 3D لوظيفية التجمع أضعاف صخبا الناجحة في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا توجد المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر الدكتور جيفري كابلان لتدريبه والمشورة بشأن التصوير متحد البؤر. نحن نشكر أيضا الكترون مختبر المجهر كيك والدكتور تشاو يينغ ني للحصول على المساعدة ووزارة شؤون المرأة. ويتم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية لل(وNIDCD، R01DC008965 R01DC011377) الصحة. يقر ABZ NSF التكاملية العليا التعليم والبحث العلمي، تدرب برنامج (IGERT) للحصول على التمويل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | Cure the membrane at 100 °C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~80 kDa, dissolve O/N |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| Human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | Received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| Replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | Torque range: 20-120 cN·m |
| Stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | Maximum power handling 50 W |
| Function generator | Agilent | 33220A | Frequency range 1 µHz-20 MHz |
| Power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | Output voltage: 0-30 kV |
| Scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| Desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | Non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| Multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | Acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| Aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| Acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| Polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| Electronic cable/wire | |||
| Medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | Clear, biocompatible |
| 10 ml Syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G Blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | Fully insulated |
| 8 mm Biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | Sterile, disposable |
| 12 mm Biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| Tissue culture flasks | Corning | Cell culture treated |
References
- Titze, I. R.
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D.
- Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
- Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
- Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
- Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
- Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
- Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
- Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
- Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
- Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
- Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
- Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
- Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
- Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
- Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).
