Introduction
एक उपकला परत से बना मानव मुखर गुना, लामिना propria (एलपी) और vocalis मांसपेशी, ध्वनि उत्पादन के लिए ध्वनिक लहरों में फेफड़ों से हवा का प्रवाह है कि धर्मान्तरित एक विशेष नरम ऊतक है. 1 मुखर सिलवटों सामान्य शब्दोच्चार के दौरान नियमित रूप से हिलाना, लेकर मौलिक आवृत्तियों पर 30% तक की उपभेदों प्रदर्शन 100-300 हर्ट्ज से. 2 वयस्क मुखर गुना एल.पी. एक सतही (एसएलपी) से बना एक ढाल संरचना, एक मध्यवर्ती (आईएलपी) और एक गहरी (डीएलपी) परत है. इसके अलावा वर्गीकरण समूहों उपकला और म्यूकोसा परत के रूप में एसएलपी, और मुखर बंधन में आईएलपी और डीएलपी को जोड़ती है. 3 बंधन परिपक्व कोलेजन और elastin फाइबर से समृद्ध है, जबकि SLP परत, कम छितरी मज्जा तंतुओं के साथ मुख्य रूप से एक अनाकार मैट्रिक्स शामिल पर्याप्त शक्ति प्रदान करने के लिए. 4 संरचना और नवजात मुखर परतों के यांत्रिकी उनके परिपक्व समकक्षों से काफी भिन्नता है. हालांकि तंत्रमुखर गुना विकास और परिपक्वता को विनियमित करने की अभी तक पूरी तरह प्रयोगात्मक सबूत वोकलिज़ेशन व्युत्पन्न यांत्रिक तनाव के निर्णायक की भूमिका निभाने की ओर इशारा किया गया है, समझ नहीं रहे हैं.
आवाज करें, संक्रमण, रासायनिक परेशानी और शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं सहित कई चिकित्सा शर्तों, मुखर गुना नुकसान पहुंचा सकता है. मुखर गुना विकारों अमेरिका की आबादी का एक अनुमान के अनुसार 3-9% प्रभावित करते हैं. मुखर गुना विकारों के लिए वर्तमान उपचार विधियों 5 सीमित कर रहे हैं और एक स्टेम सेल आधारित ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण मुखर गुना समारोह बहाल करने के लिए एक आशाजनक रणनीति के रूप में उभरा है. Mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) मुखर गुना ऊतक इंजीनियरिंग के लिए प्राथमिक मुखर गुना fibroblasts लिए एक उपयुक्त विकल्प हैं. 6-9 स्टेम सेल भाग्य विनिर्देश और बाद में ऊतक विकास मैकेनिकल शर्त है जिसमें से वे में रहते विशिष्ट आला, द्वारा मध्यस्थता कर रहे हैं एक महत्वपूर्ण कारक. 10 यांत्रिक बलों ऊतक morphogenesis एक की आवश्यक नियामकों हैंएन डी विशेष रूप से नियमित रूप से एक ऊतक इंजीनियरिंग के नजरिए से लोड हो रहा है. 11 के अधीन हैं कि ऊतकों के लिए homeostasis, यह जोखिम physiologically प्रासंगिक यांत्रिक stimulations सेल भेदभाव और ऊतक विशेष मैट्रिक्स remodeling स्टेम बढ़ावा के लिए कि प्रदर्शन किया गया. 12-15
टिशू कल्चर बायोरिएक्टर विट्रो में सेल या ऊतक के विकास के लिए वांछित मनोवैज्ञानिक वातावरण अनुकरण करने के लिए तैयार कर रहे हैं. मुखर गुना ऊतक इंजीनियरिंग के लिए, यह phonating मुखर परतों के यांत्रिक वातावरण विश्राम करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. एक आदर्श मुखर गुना बायोरिएक्टर प्रभावी रूप से आवृत्ति, आयाम और कंपन की अवधि से अधिक सुगम नियंत्रण की अनुमति, संस्कृति कोशिकाओं को थरथानेवाला cues देने चाहिए. Titze और सहकर्मियों मैट्रिक्स प्रोटीन की सेलुलर उत्पादन को प्रोत्साहित करने के लिए उच्च आवृत्ति (20-200 हर्ट्ज) दोलनों के साथ स्थिर खिंचाव को जोड़ती है कि एक मुखर गुना बायोरिएक्टर (T1 बायोरिएक्टर) 16 तैयार की. Usinजी इस बायोरिएक्टर, वेब और उनके सहयोगियों ने 17 एक hyaluronic एसिड (हा) आधारित हाइड्रोजेल में सुसंस्कृत त्वचीय fibroblasts पर 10 दिन, 100 हर्ट्ज कंपन के प्रभाव का अध्ययन किया. कंपन के अधीन निर्माणों हा synthase -2 (Has2) स्थिर नियंत्रण के सापेक्ष, decorin, fibromodulin और मैट्रिक्स metalloproteinase -1 (MMP1), के एक ऊंचा अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया. stimulatory प्रभाव निर्भर समय होना पाया गया है. हाल ही में, हमारे समूह 18 एक शक्ति एम्पलीफायर, एक समारोह जनरेटर, एक संलग्न लाउड - स्पीकर और संलग्न कोशिकाओं को oscillating हवा स्थानान्तरण कि एक circumferentially लंगर सिलिकॉन झिल्ली का उपयोग कर एक मुखर गुना बायोरिएक्टर (J1 बायोरिएक्टर) इकट्ठे हुए. J1 बायोरिएक्टर में खेती नवजात चमड़ी fibroblasts अप करने के लिए 0.05% की एक में विमान तनाव के साथ, 60, 110 या 300 हर्ट्ज पर कंपन की 1 घंटा के अधीन थे. qPCR परिणाम कुछ ईसीएम जीनों की अभिव्यक्ति मामूली विभिन्न थरथानेवाला आवृत्तियों के जवाब में बदल दिया गया था कि सुझावऔर आयाम.
ये बायोरिएक्टर डिजाइन, पेचीदा है, जबकि कई सीमाएं हैं. उदाहरण के लिए, T1 प्रणाली प्राप्य अधिकतम आवृत्तियों सीमित, यांत्रिक युग्मन के लिए कनेक्टर्स और सलाखों की एक बड़ी संख्या की आवश्यकता है. इसके अलावा, कोशिकाओं डेटा व्याख्या उलझा कि अवांछनीय यांत्रिक आंदोलन और तरल पदार्थ गड़बड़ी के अधीन किया जा सकता है. J1 बायोरिएक्टर, दूसरे हाथ पर, अपेक्षाकृत कम ऊर्जा रूपांतरण दक्षता दर्शाती है और उपयोगकर्ता के अनुकूल नहीं है. इसके अलावा, कंपन अक्सर अंतर्निहित सिलिकॉन झिल्ली से सेल से लदी निर्माणों detaches. J1 संस्करण के रूप में एक ही सिद्धांत के आधार पर तैयार रिपोर्ट यहाँ J2 मुखर गुना बायोरिएक्टर, स्थिरता और reproducibility के लिए अनुकूलित है. शब्दोच्चार नकल उतार कंपन एमएससी आबादी रेशेदार पाली (ε-caprolactone) (पीसीएल) scaffolds प्रभावी ढंग से कर रहे हैं, जहां व्यक्तिगत रूप से सज्जित कंपन कक्षों में aerodynamically उत्पन्न कर रहे हैंइली सुरक्षित. लेजर डॉपलर Vibrometry (LDV) उपयोगकर्ता झिल्ली / पाड़ विधानसभा की थरथानेवाला प्रोफाइल को सत्यापित करने की अनुमति देता है. हमारे प्रदर्शन में, MSCs 7 दिनों के लिए 12 घंटे प्रतिदिन की कुल के लिए एक 1-HR-पर-1-HR-बंद (के) पैटर्न के साथ 200 हर्ट्ज sinusoidal कंपन के संपर्क में हैं. लगाया थरथानेवाला cues के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं योजनाबद्ध तरीके से जांच कर रहे हैं. कुल मिलाकर, J2 मुखर गुना गतिशील सेल संस्कृति के अध्ययन के लिए एक उच्च throughput और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फैशन में आयोजित करने की अनुमति देता है, सबसे उपयोगकर्ता के अनुकूल सुविधाओं को प्रदान करता है.
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Protocol
1. बायोरिएक्टर सभा (वीडियो 1)
- पूर्व निर्धारित भीतरी और बाहरी आयामों के साथ एक एल्यूमीनियम मोल्ड (परिपत्र मरने + स्पेसर पिन) (चित्रा 1) बनाते हैं.
- में: (चित्रा 1 में स्पेसर पिन के आकार का 12 मिमी, मोटाई ~ 0.25 मिमी व्यास) एक आरोपित आस्तीन के साथ 1.1 कदम से फफूंदी का उपयोग, एक सिलिकॉन झिल्ली (1.5 मिमी, चित्रा 1: 42 मिमी, मोटाई व्यास) बनाना एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिलिकॉन elastomer किट का उपयोग मध्यम.
- मिलान लकीरें और grooves के साथ ब्लॉक (0.9 सेमी मोटी) शीर्ष खोदना (1.8 सेमी मोटी) और नीचे, बीच में: एक परिपत्र उद्घाटन (24 मिमी व्यास) के साथ एक्रिलिक ब्लॉक की एक जोड़ी (चित्रा 2 (4, 5)) बनाओ 10.
- बनती ऐक्रेलिक ब्लॉक के बीच सिलिकॉन झिल्ली सैंडविच. एक निरंतर बल (35 सीएन · एम) के लिए सेट एक सूक्ष्म टोक़ शराबी का उपयोग चार कोने शिकंजा के साथ विधानसभा सुरक्षित. नतीजतन, एक पानी से तंग, 24 मीटरमीटर चौड़ा और 18 मिमी गहरी कंपन कक्ष (चित्रा -2) बनाया जाता है.
- नीचे ऐक्रेलिक ब्लॉक पर कोने शिकंजा का एक और सेट के माध्यम से कंपन कक्ष के नीचे एक 3 "विस्तारित रेंज मिनी वूफर (चित्रा 2 डी, 8 Ω/20 डब्ल्यू) माउंट. इस बिंदु पर, एक व्यक्ति कंपन मॉड्यूल इकट्ठा किया है.
- सात अतिरिक्त कंपन मॉड्यूल को दोहराने. सलाखों में कटौती समान स्थान परिपत्र छेद (: 7 सेमी, मोटाई 2 सेमी व्यास) में वक्ता अड्डों रखकर दो स्थिर एल्यूमीनियम सलाखों (40 सेमी x 10 सेमी x 2.5 सेमी) में से एक के लिए उनमें से चार प्रत्यय. प्रत्येक परिपत्र छेद में एल्यूमीनियम पट्टी की ओर से एक पेंच डालने से प्रत्येक वक्ता स्थिर.
- व्यक्तिगत रूप से एक वक्ता चयनकर्ता द्वारा वक्ताओं नियंत्रित करते हैं. चयनकर्ता पर इसी outputs के तत्कालीन अध्यक्ष शरीर पर सकारात्मक और नकारात्मक सूचनाओं के लिए तार संलग्न द्वारा चयनकर्ता को व्यक्तिगत वक्ताओं कनेक्ट. वक्ता चयनकर्ता अनुमति देता है टी से संकेतवह समारोह जनरेटर, एक शक्ति एम्पलीफायर के माध्यम से गुजर जाने के बाद, एक बार (चित्रा 2 ई) में सभी आठ वक्ताओं तक पहुँचने के लिए.
- एक विरोधी आर्द्रता बाड़े में दो कक्ष सरणियों, वक्ता चयनकर्ता और संबद्ध इलेक्ट्रॉनिक्स रखें. एक वाणिज्यिक सेल कल्चर इनक्यूबेटर में पूरे विधानसभा घर.
- इनक्यूबेटर की पीठ पर फिल्टर विधानसभा के माध्यम से शक्ति एम्पलीफायर और स्पीकर चयनकर्ता जोड़ने (एक चिकित्सा ग्रेड पीवीसी टयूबिंग के माध्यम से) मुख्य केबल फ़ीड.
2. पाड़ निर्माण और विशेषता
- 15% wt के एक एकाग्रता में क्लोरोफॉर्म में पीसीएल छर्रों भंग. एक 21 जी कुंद समाप्त सुई के साथ छाया हुआ है एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में समाधान लोड.
- एक प्रोग्राम सिरिंज पंप पर सिरिंज लॉक और / घंटा 1 मिलीलीटर में प्रवाह की दर निर्धारित किया है.
- ~ 18 सेमी की एक सुई की नोक से कलेक्टर दूरी के साथ, क्षैतिज सुई से पार एल्यूमीनियम पन्नी से ढके कलेक्टर रखें.
- सकारात्मक Alli दबानासुई के बीच, और एल्यूमीनियम कलेक्टर को जमीन मगरमच्छ क्लिप को गेटोर क्लिप, फिर 15 केवी उच्च वोल्टेज बिजली की आपूर्ति पर वोल्टेज सेट. चेतावनी: उच्च वोल्टेज, सुई से दूरी रखने के लिए.
- क्रमिक रूप से सिरिंज पंप और बिजली की आपूर्ति को चालू; जल्दी से साफ / स्थिर फाइबर विमानों से पहले एक सूखी कागज तौलिया का उपयोग कर सुई की नोक आसपास के अवशिष्ट बहुलक समाधान निकालने और टेलर शंकु 19 का गठन कर रहे हैं.
- फाइबर 250-300 माइक्रोन ~ की मोटाई को अल कलेक्टर पर जमा करने की अनुमति दें (~ वर्तमान कताई शर्तों के तहत 7 घंटा). किसी भी अवशिष्ट विलायक दूर करने के लिए 1-2 दिनों के लिए एक निर्वात desiccator में परिणामी scaffolds स्टोर.
- छवि scaffolds, संगत फाइबर आकारिकी दिखाने के लिए एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग कर, सोने के साथ लेपित धूम. 10
3. बायोरिएक्टर विधानसभा और विशेषता
- चार हथियार (लंबाई के साथ: एक बेलनाकार डिस्क (8 मिमी व्यास): पंच 2पहली डिस्क के बाहरी व्यास में कटौती करने के लिए एक 12 मिमी व्यास बायोप्सी पंच का उपयोग कर के रूप में काता PCL चटाई (2A चित्रा) से बाहर मिमी). तो फिर बराबर हथियारों में कटौती की जानी हैं जहां स्कोर करने के लिए परिपत्र ब्लेड के आसपास दूरी पर चार 2 मिमी लंबे notches बनाने के लिए एक दूसरे, 8 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग करें. 8 मिमी पंच के साथ स्कोरिंग के बाद, जावक हथियारों के किनारों में कटौती करने के लिए एक स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें. विस्तारित हथियार के माध्यम से सिलिकॉन झिल्ली की नाली में पाड़ डालें (वीडियो) 1. धीरे फ्लैटहेड चिमटी का उपयोग कर सतह दबाकर डाला पाड़ समतल.
- लेजर प्रतिबिंब सहायता करने के लिए PCL पाड़ पतली अल पन्नी का एक छोटा सा टुकड़ा (8 मिमी x 2 मिमी, orthogonal आकार, चित्रा 2 बी) संलग्न करें.
- कंपन कक्ष में इकट्ठे सिलिकॉन झिल्ली / PCL पाड़ (1.4 कदम में विस्तृत रूप में) सुरक्षित. कंपन से पहले PCL पाड़ हाइड्रेट करने के क्रम में चैम्बर में 1.5 मिलीलीटर पानी जोड़ें.
- समारोह जनरेटर का प्रयोग, कंपन साइन परिचयए एल एस sandwiched ऐक्रेलिक चैम्बर के लिए (0.1 वी की एक चोटी से पीक वोल्टेज, Vpp, साथ उदाहरण के लिए, 200 हर्ट्ज sinusoidal तरंगों). सही प्रत्येक वक्ता इनपुट पर वोल्टेज को मापने के लिए एक वाल्टमीटर का प्रयोग करें. नोट: समारोह जनरेटर से Vpp readout के स्पीकर के लिए दिया अंतिम वोल्टेज से अलग होगा.
- एकल बिंदु LDV इकट्ठा और एक अखिल झुकाव सिर तिपाई के लिए फाइबर ऑप्टिक लेजर सेंसर सिर सुरक्षित. कोण संवेदक सिर यह टेबलटॉप को सीधा इशारा कर रहा है कि इतनी. समाक्षीय केबल के माध्यम से डाटा अधिग्रहण मॉड्यूल को LDV सेंसर सिर फिर से कनेक्ट USB के माध्यम से लैपटॉप के लिए मॉड्यूल.
- सिलिकॉन झिल्ली (चित्रा 2B और चित्रा 3) पर विभिन्न पूर्व निर्धारित अंक पर लंब के रूप में लेजर बीम ध्यान दें.
- डाटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, मध्य झिल्ली विस्थापन रिकॉर्ड. "विकल्प" मेनू से "अधिग्रहण सेटिंग्स" पर क्लिक करें; तब माप मोड के लिए "FFT बदल221;. अगला, मुख्य उपकरण पट्टी में "निरंतर माप" पर क्लिक करें तो विस्थापन को रिकॉर्ड करने के लिए चुना आवृत्ति (चित्रा 6D) में रूपों है कि शिखर पर क्लिक करें.
- सब्सट्रेट भर सापेक्ष स्थिति के एक समारोह के रूप में सामान्य के मध्य झिल्ली विस्थापन (0 डब्ल्यू) प्लॉट. उत्पत्ति 8.5 डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सतह थरथानेवाला प्रोफाइल के एक 3 डी रंग मैप का निर्माण.
4. थरथानेवाला सेल संस्कृति
- एमएससी रखरखाव मीडिया में / 2 सेमी 4,000-5,000 कोशिकाओं का एक प्रारंभिक बोने घनत्व पर T150 टिशू कल्चर बोतल में उप संस्कृति मानव अस्थि मज्जा व्युत्पन्न MSCs.
- सेल संस्कृति के 7-8 दिनों के बाद (~ 85% confluency करने के लिए), ऐसे Accutase के रूप में एक सेल हदबंदी अभिकर्मक के साथ कोशिकाओं trypsinize, एक hemocytometer, अपकेंद्रित्र (5 मिनट के लिए 440 XG) का उपयोग गिनती, और फिर से निलंबित सेल गोली में 4.5 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में ताजा एमएससी रखरखाव मीडिया.
- पीसीएल scaffo विसर्जित70% इथेनॉल हे / एन में एलडी विलायक सुखाया जाता है, के बाद 5-8 मिनट के लिए पराबैंगनी प्रकाश (254 एनएम) पदार्थविषयक को पाड़ के दोनों पक्षों को बेनकाब.
- 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक 20 माइक्रोग्राम / एमएल fibronectin समाधान में पीसीएल पाड़ भिगोएँ. सिलिकॉन झिल्ली में fibronectin लेपित पाड़ डालें. चरण 1 में विस्तृत रूप में बायोरिएक्टर इकट्ठे.
- सुरक्षित PCL पाड़ पर समान रूप से सेल निलंबन के 40 μl वितरित करें. कोशिकाओं कंपन चैम्बर के लिए एक अतिरिक्त 1.5 एमएल ताजा मीडिया जोड़ने से पहले 1-1.5 घंटे के लिए संलग्न करने की अनुमति दें.
- संस्कृति एमएससी लदी PCL 3 दिनों के लिए स्थिर रुप से पाड़ और स्थिर संस्कृति के पूरा होने पर मीडिया को ताज़ा करें.
- सेलुलर निर्माणों को चयनित कंपन शासनों थोपना. नोट: एक उदाहरण के रूप में, कोशिकाओं को 7 दिनों के लिए प्रति दिन 12 घंटे के लिए ~ 40 माइक्रोन से ओ 0 के साथ 200 हर्ट्ज पर कंपन (के) एक 1-HR-पर-1-HR-बंद के अधीन हैं. थरथानेवाला stimulations के अधीन निर्माणों Vib नमूने और उन cultu के रूप में नामित कर रहे हैंस्थिर रुप से समान कंपन कक्षों में लाल के रूप में स्थिर नियंत्रण (स्टेट) की सेवा.
5. जैविक मूल्यांकन
- हर दूसरे दिन प्रत्येक कक्ष से 200 μl सेल संस्कृति मीडिया लीजिए (दिन 1, 3, 5, और 7) और (800 μl प्रत्येक) एक साथ एक ही नमूना से aliquots पूल.
- मैट्रिक्स metalloproteinase -1 (MMP1) और 'निर्माताओं की प्रक्रिया के बाद क्रमश: एक MMP1 एलिसा किट के विकास और एक hyaluronan प्रतिस्पर्धी एलिसा किट का उपयोग हा के सेलुलर उत्पादन यों. इस बीच, जैसा कि पहले बताया एलिसा प्रक्रिया के बाद घुलनशील इलास्टिन अग्रदूत का उत्पादन परख. 8
- सुबह 7 बजे आखिरी कंपन चक्र के पूरा होने पर, जल्दी से तेज चिमटी का उपयोग कर कंपन कक्षों से सेलुलर निर्माणों को हटाने और संक्षेप में ठंड फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस, 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ उन्हें कुल्ला.
- लाइव / मृत धुंधला के लिए, propidium आयोडाइड (पीबीएस में 1:2,000) के साथ निर्माणों सेते हैं औरSyto-13 आरटी पर 5 मिनट के लिए एक साथ (पीबीएस में 1:1,000). छवि एक multiphoton confocal खुर्दबीन के साथ दाग निर्माणों.
- उधर, सूखी बर्फ पर पीबीएस rinsed सेलुलर निर्माणों तस्वीर फ्रीज और जीन विश्लेषण के लिए एक पहले की रिपोर्ट प्रोटोकॉल के बाद कुल सेलुलर शाही सेना निकाल सकते हैं. 9
- एक यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर निकाला शाही सेना की मात्रा और गुणवत्ता की जाँच करें. 1.8-2.2 की A260/A280 और A260/A230 अनुपात के साथ शाही सेना के नमूने बाद qPCR विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है.
- रिवर्स एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिवर्स प्रतिलेखन किट का उपयोग सीडीएनए में शाही सेना (500 एनजी / नमूना) टाइप करना.
- पहले विस्तृत प्रक्रिया के बाद एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर मास्टर मिश्रण का उपयोग करते हुए एक वास्तविक समय अनुक्रम पहचान प्रणाली पर पीसीआर प्रतिक्रिया प्रदर्शन करना. 8
- वाणिज्यिक qPCR डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग qPCR परिणामों का विश्लेषण करें. डेटा विश्लेषण की विश्वसनीयता सुनिश्चित करने के लिए, कई संदर्भ जीन (YWHAZ, TBP, PPIA) int के रूप में कार्यरत हैंernal नियंत्रण, और विशिष्ट प्राइमर क्षमता के विचरण को ध्यान में रखा जाता है. 8
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Representative Results
Electrospinning द्वारा गढ़े PCL scaffolds माइक्रोन आकार बीचवाला pores और 4.7 माइक्रोन (चित्रा -4 ए) के एक औसत व्यास के साथ बेतरतीब ढंग से उलझ फाइबर होते हैं. एक उच्च बढ़ाई, nanoscale के खांचे और pores व्यक्तिगत फाइबर (चित्रा 4 बी) पर दिखाई दे रहे हैं. फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ scaffolds के कोटिंग hydrophilicity में सुधार और प्रारंभिक सेल आसंजन / PCL पाड़ (अप्रकाशित अवलोकन) पर प्रसार की सुविधा.
वांछित आवृत्ति (एफ, 100-300 हर्ट्ज) और वोल्टेज के साथ sinusoidal waveforms (Vpp: 0-.125 वी) प्रत्येक कंपन चैम्बर नीचे वक्ता, और सिलिकॉन झिल्ली के नीचे और एक के कागज शंकु के बीच ही सीमित हवा के लिए पेश कर रहे हैं मिनी वूफर दोलन में संचालित है. हवा कंपन के साथ या कोशिकाओं के बिना PCL पाड़ के लिए दिया जाता है. LDV, किसी दिए गए एफ और VPP में पाड़ की कंपन विशेषताओं का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता हैखाते में पानी का अपवर्तनांक (1.33) ले रही है. 20 चित्रा 5 Vpp के एक समारोह के रूप में पीसीएल पाड़ के केंद्र में (0 डब्ल्यू) सामान्य विस्थापन से पता चलता है और च. कंपन आवृत्तियों मौलिक मानव बोल आवृत्तियों को प्रतिबिंबित करने के लिए चुना जाता है. 21 परीक्षण सभी आवृत्तियों के लिए 0-.125 वी की श्रृंखला में 0 डब्ल्यू के बीच एक रेखीय रिश्ता है और VPP. एक दिया Vpp में, 100 से 300 हर्ट्ज के लिए च वृद्धि के रूप में 0 घटने डब्ल्यू.
एक विशिष्ट कंपन हालत (च = 200 हर्ट्ज, Vpp = 0.1 वी) आगे के विश्लेषण के लिए चुना है. समय (चित्रा 6A) के एक समारोह के रूप में वेग प्रोफाइल वक्ता के लिए शुरू की sinusoidal संकेत उच्च निष्ठा के साथ PCL पाड़ द्वारा कब्जा कर लिया है कि पता चलता है. पीसीएल पाड़ के केंद्र 52 मिमी / सेकंड की एक शिखर वेग के साथ longitudinally oscillates, एक चोटी के 66 मीटर / सेकंड 2 (~ 6.7g) के त्वरण और एक~ 40 माइक्रोन की सामान्य विस्थापन. 100, 300, 400 और 500 हर्ट्ज पर हार्मोनिक संकेतों मौलिक आवृत्ति (200 हर्ट्ज) पर उन से कम परिमाण की कम से कम एक आदेश हैं. Vpp मूल्य (0.15 वी) बहुत अधिक है, तो हालांकि, मौलिक आवृत्ति के लिए तुलनीय तीव्रता के कई हार्मोनिक चोटियों (चित्रा 7) पता चला रहे हैं. पाड़ भर में कंपन प्रोफाइल PCL सतह के रेडियल दिशाओं पर 73 प्रतिनिधि अंक (चित्रा 3) के कुल से सामान्य विस्थापन की निगरानी के द्वारा बनाई गई है. 3 डी रंग मैप (चित्रा 8) झिल्ली की सतह पर पाया कंपन axisymmetrical केंद्र के सापेक्ष और उसके आराम पदों है कि यह दर्शाता है. सामान्य विस्थापन झिल्ली सुरक्षित है, जहां किनारे करने के लिए केंद्र से monotonically कम पाया जाता है.
पीसीएल scaffolds पर सुसंस्कृत MSCs चयनित कंपन परिस्थितियों में सुसंस्कृत हैं. एक 7 दा के अधीन कोशिकाओंउत्तेजना के y रेशेदार scaffolds cytocompatible थे और लागू कंपन व्यवहार्यता का कोई नुकसान के परिणामस्वरूप, पुष्टि है कि स्थिर नियंत्रण (चित्रा 9) के रूप में इसी तरह की व्यवहार्यता और प्रसार गुणों को बनाए रखने. थरथानेवाला stimulations के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं ऐसे इलास्टिन (ELN) के रूप में आवश्यक मुखर गुना ईसीएम प्रोटीन की अभिव्यक्ति, hyaluronan synthase -1 (HAS1), COL3A1 और MMP1 (चित्रा 10) के मामले में mRNA स्तर पर जांच कर रहे हैं. कंपन की स्थैतिक नियंत्रण के सापेक्ष दिन 7 पर ELN अभिव्यक्ति में एक 2.3 गुना वृद्धि हुई है, की ओर जाता है. थरथानेवाला stimulations भी मामूली COL3A1 अभिव्यक्ति की वृद्धि हुई. यह प्रमुख ईसीएम remodeling एंजाइमों, HAS1 और MMP1 की अभिव्यक्ति, काफी कंपन संकेत द्वारा संवर्धित है कि उल्लेखनीय है. विशेष रूप से, गतिशील उपचार HAS1 और MMP1 के लिए ~ 1.7 और ~ 16.3 के एक गुना वृद्धि हुई सुबह 7 बजे उनके स्थिर नियंत्रण खत्म अभिव्यक्ति (दोनों पी <0.05), क्रमशः,. कुल मिलाकर, HAS1 और MMP1 पर कंपन का अधिष्ठापन का प्रभाव दिन से 7 दिन में 3 से बढ़ाया गया था.
आगे qPCR परिणाम को पुष्ट करने के लिए, हा, घुलनशील इलास्टिन और MMP1 के सेलुलर उत्पादन translational स्तर (11 चित्रा) में एलिसा द्वारा मात्रा निर्धारित है. स्थैतिक नियंत्रण केवल 2.7 ± 0.2 माइक्रोग्राम / मिलीग्राम) इलास्टिन जमा जबकि गतिशील रूप से संवर्धित कोशिकाओं, कंपन के 7 दिनों के बाद घुलनशील इलास्टिन (सूखा पाड़ के वजन के प्रति) 4.2 ± 0.1 माइक्रोग्राम / मिलीग्राम का उत्पादन. औसत पर, कंपन के 7 दिन के लिए 2.2 और हेक्टेयर में 4.7 गुना वृद्धि हुई है और इसी स्थिर नियंत्रण के सापेक्ष MMP1 स्राव, में परिणाम.
वीडियो 1: एक J2 बायोरिएक्टर के विधानसभा दिखाते हुए एक 3 डी सिमुलेशन. वीडियो Autodesk 3ds मैक्स डिजाइन (Congfei झी के सौजन्य से) द्वारा बनाया गया था.
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. चित्रा 1 आरोपित आस्तीन के साथ सिलिकॉन झिल्ली fabricating के लिए इस्तेमाल अल मोल्ड के आयाम illustrating तस्वीर Ø:. व्यास, डी: मोटाई / गहराई, एच:. ऊंचाई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
.. चित्रा 2 फ्लोचार्ट बायोरिएक्टर विधानसभा दिखा (ए) एक चार हाथ की आकृति वाले PCL पाड़ की एक तस्वीर, (बी) के कंपन कक्ष और कक्ष के नीचे पर ध्यान केंद्रित vibrometer लेजर में सुरक्षित PCL पाड़ दिखा तस्वीर, ( सी) एक पार अनुभागकंपन चैंबर के अल देखें. 1: पीसीएल पाड़ (लाल); 2: सिलिकॉन झिल्ली (सियान); 3: अल स्थिर बार; 4: शीर्ष ऐक्रेलिक ब्लॉक; 5: नीचे ऐक्रेलिक ब्लॉक; 6: मिनी वूफर, कंपन मॉड्यूल (डी) की ओर देखें, (ई) पूरे विधानसभा दिखा तस्वीर. यह आंकड़ा टोंग एट अल से संशोधित किया गया है. 10 कॉपीराइट 2013, मैरी एन Liebert, Inc इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 3. एकल बिंदु LDV माप के लिए त्रिज्यात चिह्नित सिलिकॉन झिल्ली का चित्रण. यह आंकड़ा टोंग एट अल से संशोधित किया गया है. 10 कॉपीराइट 2013, मैरी एन Liebert, Inc
विभिन्न आवर्धन पर PCL scaffolds के चित्रा 4. SEM छवियाँ. (ए) 600X, (बी) 7,000 एक्स यह आंकड़ा टोंग एट अल से संशोधित किया गया है. 10 कॉपीराइट 2013, मैरी एन Liebert, Inc इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 5. लागू आवृत्ति के एक समारोह (100, 200 और 300 हर्ट्ज) और ड्राइविंग वोल्टेज (Vpp = 0-.125 वी) के रूप में (0 डब्ल्यू) सिलिकॉन झिल्ली के केंद्र में सामान्य विस्थापन. यह आंकड़ा संशोधित कर दिया गया है टोंग एट अल. 10 कॉपीराइट 2013, मा से RY एन Liebert, Inc
आवृत्ति के एक समारोह के रूप में च के साथ सिलिकॉन झिल्ली के केंद्र = 200 हर्ट्ज और समय के एक समारोह के रूप में एक Vpp = 0.1 वी. (ए) वेग प्रोफाइल पर पता चला चित्रा 6. कंपन विशेषताओं. (बी) के वेग प्रोफाइल. (सी) आवृत्ति के एक समारोह के रूप में त्वरण. आवृत्ति के एक समारोह के रूप में (डी) (0 डब्ल्यू) सामान्य विस्थापन. यह आंकड़ा टोंग एट अल. 10 से संशोधित किया गया है. कॉपीराइट 2013, मैरी एन Liebert, Inc इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
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चित्रा 7. एक 200 हर्ट्ज sinusoidal लहर एक Vpp = 0.15 वी. पर मिनी वूफर के लिए पेश किया जाता है जब आवृत्ति के एक समारोह के रूप में (0 डब्ल्यू) झिल्ली के केंद्र में पता चला सामान्य विस्थापन
सभी स्थानों से एकत्र सामान्य विस्थापन डेटा का उपयोग कर सतह gridding द्वारा निर्मित चित्रा 8. 3 डी रंग मैप PCL पाड़ पर चिह्नित. यह आंकड़ा टोंग एट अल से संशोधित किया गया है. 10 कॉपीराइट 2013, मैरी एन Liebert, Inc
लाइव / मृत धुंधला द्वारा कल्पना चित्रा 9. सेल व्यवहार्यता,, कंपन के 7 दिनों के बाद. यह आंकड़ा टोंग ई से संशोधित किया गया हैटी अल. 10 कॉपीराइट 2013, मैरी एन Liebert, Inc इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
मुखर गुना प्रासंगिक, ईसीएम जीनों की अभिव्यक्ति के मामले में थरथानेवाला stimulations के लिए 10. सेलुलर प्रतिक्रियाओं चित्रा. रिश्तेदार जीन अभिव्यक्ति (परिवर्तन गुना) 3 दिन और दिन 7 (धराशायी आधारभूत) में संबंधित स्थिर नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत है. **: काफी बदल (पी <0.05) आधारभूत के सापेक्ष: 3 दिन और 7, # के बीच महत्वपूर्ण अंतर (पी <0.05). डाटा मतलब का मतलब ± मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करता है (SEM, N = 4). दो पूंछ विद्यार्थी t-परीक्षण <0.05 पी के रूप में काफी di माना जा रहा है, सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए प्रयोग किया जाता हैfference (नीचे के रूप में ही). यह आंकड़ा टोंग एट अल से संशोधित किया गया है. 10 कॉपीराइट 2013, मैरी एन Liebert, Inc
शुष्क पाड़ के वजन के प्रति ईसीएम अणुओं के 7 दिनों के लिए स्टेट और Vib परिस्थितियों में पीसीएल पाड़ पर सुसंस्कृत MSCs द्वारा उत्पादित हा (ए) का आंकड़ा 11. बायोकेमिकल मात्रा का ठहराव, घुलनशील ELN (बी) और MMP1 (सी). कुल राशि (एमजी) . मतलब ± SEM के रूप में, प्रतिनिधि परीक्षण से n = 4 # प्रतिनिधित्व किया है: काफी बढ़ाया (पी <0.05) स्टेट नियंत्रण की तुलना में. यह आंकड़ा टोंग एट अल से संशोधित किया गया है. 10 कॉपीराइट 2013, मैरी एन Liebert, Inc
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Discussion
इन विट्रो में कार्यात्मक मुखर गुना ऊतकों के सफल इंजीनियरिंग multipotent कोशिकाओं के व्यवहार को मध्यस्थता करने के लिए एक मुखर गुना की तरह microenvironment के मनोरंजन की आवश्यकता है. यह आम तौर पर ऊतक या अंग संरचनाओं वे प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक हैं कार्यों को प्रतिबिंबित स्वीकार किया है कि. मुखर गुना ऊतकों के लिए 22, शब्दोच्चार के दौरान होने वाले उच्च आवृत्ति कंपन ऊतक परिपक्वता के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए प्रस्तावित कर रहे हैं. मुखर गुना बायोरिएक्टर सुसंस्कृत MSCs को physiologically प्रासंगिक यांत्रिक संकेतों को पेश करने के लिए बनाया गया है, जबकि हमारे अध्ययन में, PCL scaffolds एक बंधन की तरह संरचनात्मक सहायता प्रदान करने के लिए उपयोग किया जाता है. (J2) यहाँ वर्णित बायोरिएक्टर electromagnetically व्यक्ति स्पीकर के माध्यम से कंपन पैदा करता है और संवर्धित कोशिकाओं को ऊर्जा aerodynamically स्थानान्तरण. हमारे पिछले डिजाइन की तुलना में, 18 मौजूदा प्रणाली के लिए अनुमति देता है, सीधे अच्छी तरह से प्रत्येक नमूना नीचे कंपन उत्तेजना का स्रोत चालेंआरए अधिक कुशल ऊर्जा रूपांतरण. नतीजतन, एक काफी बड़ा सामान्य विस्थापन और एक उच्च त्वरण मौजूदा प्रणाली का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. मॉड्यूलर डिजाइन भी अलग कंपन कक्षों भर प्रणाली विविधताओं और यांत्रिक गड़बड़ी को कम करता है.
हमारे डिजाइन कंपन संकेत देने के लिए एक सिलिकॉन झिल्ली पर निर्भर करता है. यह झिल्ली अखंडता और एकरूपता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. अग्रदूत समाधान एल्यूमीनियम मोल्ड में डाल दिया है, के बाद यह मोल्ड सतह भर में एक गिलास स्लाइड खींचकर अतिरिक्त तरल निकालने के लिए वांछनीय है. किसी भी फँस हवा के बुलबुले के बिना लगातार झिल्ली इलाज समय बढ़ रही है, जबकि तापमान के इलाज को कम से उत्पादन किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, एक 70% इथेनॉल समाधान अस्थायी रूप से ठीक हो सिलिकॉन की आसान हटाने की अनुमति एल्यूमीनियम इंटरफेस में झिल्ली प्रफुल्लित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. 3 डी गतिशील संस्कृति, एक केंद्रीय स्थान पर पतली नाली के लिए सेलुलर निर्माणों को समायोजित करने के लिए मैंपीसीएल scaffolds सतही तौर पर कंपन कक्ष में लंगर डाले जा सकता है कि इस तरह की सिलिकॉन झिल्ली, में ढाला है. नाली की ज्यामिति समायोज्य है; इस प्रकार सेलुलर निर्माण के आकार बेहतर देशी मुखर परतों की ज्यामिति की नकल करने के हिसाब से देखते जा सकता है. 23 PCL पाड़ कसकर सिलिकॉन झिल्ली में सुरक्षित नहीं है, तो सिलिकॉन पर पीसीएल पर और बाहरी क्षेत्र में पता लगाया LDV संकेत झिल्ली पूरी तरह से ओवरलैप नहीं होगा. बायोरिएक्टर कोडांतरण है, यह अवांछनीय गतियों से बचने के लिए और कक्ष बदलाव के लिए चैम्बर कम से कम ताकि सभी घटकों को एक ही डिग्री करने के लिए सुरक्षित और कड़ा कर रहे हैं कि महत्वपूर्ण है.
बायोरिएक्टर की उपयोगिता को मान्य करने के लिए, MSCs PCL scaffolds पर खेती कर रहे हैं और 7 दिनों के लिए कंपन (के) विरामी के अधीन हैं. प्रति दिन कई घंटे की अवधि में कंपन की जैसे, पेशेवर गाते, भारी आवाज उपयोगकर्ताओं की बात शर्तों को पुन: पेश करने के लिए नियोजित कर रहे हैं नेताओं और शिक्षकों. 23 जैसा कि पहले बताया मुखर गुना बायोरिएक्टर के विपरीत, हमारा कोशिकाओं को किसी भी हानिकारक प्रभाव या शारीरिक आघात का कारण नहीं है.
200 हर्ट्ज कंपन विभिन्न महत्वपूर्ण ईसीएम घटकों के सेलुलर उत्पादन को विनियमित करने के लिए पाए जाते हैं. Elastin मुखर गुना एल.पी. भर में पाया है कि एक महत्वपूर्ण संरचनात्मक प्रोटीन है, और लचीलापन और लोच प्रदान करता है. ऐसे हा के रूप में 24 बीचवाला अनाकार घटकों, उचित ऊतक viscoelasticity और निशान गठन की रोकथाम के रखरखाव के लिए योगदान करते हैं. 25,26 MSCs अधीन उपचार के 7 दिन के लिए स्थिर रुप से संवर्धित समकक्षों की तुलना में elastin के एक काफी अधिक राशि का उत्पादन. हा पर HAS1 और एलिसा परिणामों पर qPCR परिणामों से इसकी पुष्टि के रूप में हा जैवसंश्लेषण, भी कंपन के प्रति संवेदनशील है. इन निष्कर्षों को बायोरिएक्टर रूप से सक्षम कंपन उत्तेजना विरोधी scarring के अणुओं का उत्पादन के लिए अनुकूल है कि सुझाव है.
jove_content "> बैलेंस्ड ईसीएम कारोबार समवर्ती मैट्रिक्स बयान और गिरावट पर निर्भर करता है. 27 प्रकार III कोलेजन लोड असर गुणों के साथ ऊतक प्रदान करने, मुखर सिलवटों में पाया प्रमुख जालीदार कोलेजन फाइबर है. जीन की अभिव्यक्ति को बढ़ाने के साथ साथ लागू 28 7 दिन की कंपन COL3A1 की, लेकिन इलास्टिन की तुलना में काफी कम परिमाण में. इसलिए, लागू कंपन विभिन्न कोलेजन III और elastin के संश्लेषण में शामिल सेलुलर तंत्र को विनियमित. दिलचस्प है, MMP1, मैट्रिक्स गिरावट और ऊतक में शामिल प्रमुख एम एम पी के एक remodeling 27 , थरथानेवाला cues के लिए बेहद संवेदनशील है. ये परिणाम एक हा मैट्रिक्स में फँस कोशिकाओं द्वारा कंपन प्रेरित MMP1 upregulation पर पिछली रिपोर्टों के साथ अच्छी तरह से सहमत हैं. 29 कुल मिलाकर, मुखर गुना बायोरिएक्टर द्वारा उत्पन्न कंपन stimulations गहराई से homeostasis को बढ़ावा देने से एमएससी कार्यों मध्यस्थता के मुखर गुना की तरह matrices.ओवरसभी यहाँ प्रस्तुत उपन्यास मुखर गुना बायोरिएक्टर गतिशील सेल संस्कृति एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फैशन में प्रदर्शन करने की अनुमति, मॉड्यूलर और उपयोगकर्ता के अनुकूल है. हालांकि, कई सीमाएं मौजूदा डिजाइन में मौजूद हैं. सबसे पहले, कंपन आयाम, J1 संस्करण से सुधार हुआ है, हालांकि मुखर गुना ऊतकों की तुलना में अभी भी छोटा है. दूसरा, हमारे बायोरिएक्टर सामान्य शब्दोच्चार दौरान मुखर परतों के द्विपक्षीय टक्कर अनुकरण नहीं करता है. तीसरा, हमारी रेशेदार PCL पाड़ ऊतक anisotropy को प्रतिबिंबित नहीं करता. भविष्य के काम के बेहतर देशी शब्दोच्चार परिस्थितियों की नकल करने के लिए डिजाइन में सुधार लाने के लिए समर्पित है. इस बीच, 3 डी गतिशील संस्कृति के लिए इष्टतम शासनों विट्रो में सफल कार्यात्मक मुखर गुना विधानसभा के लिए पता लगाया जाएगा.
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Disclosures
कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों मौजूद हैं.
Acknowledgments
हम confocal इमेजिंग पर उसके प्रशिक्षण और सलाह के लिए डॉ. जेफरी कैपलन धन्यवाद. हम भी SEM सहायता के लिए उबकना इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी लैब और डॉ Chaoying नी धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य (NIDCD, R01DC008965 और R01DC011377) के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित है. ABZ NSF एकीकृत स्नातकोत्तर शिक्षा एवं अनुसंधान Traineeship वित्त पोषण के लिए (IGERT) कार्यक्रम मानता है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | Cure the membrane at 100 °C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~80 kDa, dissolve O/N |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| Human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | Received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| Replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | Torque range: 20-120 cN·m |
| Stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | Maximum power handling 50 W |
| Function generator | Agilent | 33220A | Frequency range 1 µHz-20 MHz |
| Power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | Output voltage: 0-30 kV |
| Scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| Desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | Non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| Multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | Acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| Aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| Acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| Polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| Electronic cable/wire | |||
| Medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | Clear, biocompatible |
| 10 ml Syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G Blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | Fully insulated |
| 8 mm Biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | Sterile, disposable |
| 12 mm Biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| Tissue culture flasks | Corning | Cell culture treated |
References
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