Introduction
Bir epitel tabakası oluşan insan vokal kord, lamina propria (LP) ve vocalis kas, ses üretimi için akustik dalgalar halinde akciğerlerden hava akışını dönüştüren özel bir yumuşak doku. 1. Vokal kıvrımlar, normal fonasyon sırasında düzenli salınım, değişen temel frekanslarda% 30'a varan suşları sergileyen 100-300 Hz arasında. 2 Adult vokal kat LP yüzeysel (SLP) oluşan bir degrade yapı, bir ara (TDP) ve derin (DLP) tabakasıdır. Bundan başka sınıflandırma grupları epitelyum ve mukoza tabakası olarak SLP ve ses ligamana İLP DLP ve bir araya getirir. 3 bağ olgun kolajen ve elastin lifleri ile zenginleştirilmiştir ise SLP tabaka, seyrek dağılmış kollajen lifleri ile öncelikle bir amorf matrisi içermektedir yeterli gücü sağlamak. 4. yapısı ve doğan vokal kıvrım mekaniği kendi olgun meslektaşları arasında büyük ölçüde değişebilir. Her ne kadar mekanizmasıvokal kord gelişimini ve olgunlaşmasını düzenleyen s henüz tam deneysel kanıt seslendirme kaynaklı mekanik stres tanımlayan rollerine işaret etti, anlaşılamamıştır.
Sesli taciz, enfeksiyonlar, kimyasal maddelere ve cerrahi prosedürler dahil olmak üzere birçok tıbbi durumlar, vokal kat zarar verebilir. Vokal kord bozuklukları ABD nüfusunun yaklaşık% 3-9 etkiler. Vokal kord hastalıkları için güncel tedavi yöntemleri 5 sınırlıdır ve bir kök hücre tabanlı doku mühendisliği yaklaşımı vokal kord fonksiyonunu yeniden kazandırmak için umut verici bir strateji olarak ortaya çıkmıştır. Mezenkimal kök hücreler (MKH) vokal kord doku mühendisliği için birincil vokal kord fibroblastlar için uygun bir alternatiftir. 6-9 Kök hücre kaderinin şartname ve sonraki doku gelişimi mekanik durumdur ki onlar ikamet belirli bir niş, aracılık bir önemli bir faktördür. 10. Mekanik kuvvetler doku morfonogenezi a temel düzenleyicileridirlernd özellikle rutin bir doku mühendisliği açısından bakıldığında yükleme. 11 maruz kalan dokular için homeostazı, bu maruz kalma fizyolojik olarak uygun mekanik uyarılarla hücre farklılaşması ve dokuya özel matris yeniden kök teşvik için olduğu gösterilmiştir. 12-15
Doku kültürü biyoreaktörler in vitro hücre veya doku büyümesi için arzu edilen fizyolojik bir ortam simüle etmek için tasarlanmıştır. Vokal kord doku mühendisliği için, phonating vokal kıvrımların mekanik ortamını yeniden oluşturmak için özellikle önemlidir. İdeal vokal kord biyoreaktör etkili frekans, genlik ve titreşim süresi boyunca uyduruk kontrol sağlayan, kültür hücreleri titreşimli ipuçları teslim etmelidir. Titze ve arkadaşları matriks proteinlerinin hücresel üretimini teşvik etmek için yüksek frekanslı (20-200 Hz) salınımları ile statik esneme birleştiren bir vokal kord biyoreaktörünü (T1 biyoreaktör) 16 geliştirmiştir. Istimalg Bu biyoreaktör, Webb ve arkadaşları 17 hyaluronik asit (HA)-tabanlı hidrojel içinde kültüre dermal fibroblastlar üzerinde 10 günlük, 100-Hz titreşimlerin etkilerini inceledi. Titreşime maruz yapılar HA sintaz-2 (var2) statik kontrollere göre, dekorinin, fibromodulin ve matris metaloproteinaz-1 (MMP1), bir yüksek ifade sergiledi. Uyarıcı etkileri bağımlı zaman olduğu bulunmuştur. Daha yakın zamanlarda, grubumuz 18, bir güç yükselticisi, bir fonksiyon jeneratörü, kapalı bir hoparlör ve ekli hücrelere salınımlı hava transfer eden bir çevresel olarak sabitlenmiş silikon membran kullanılan bir ses kat biyoreaktör (J1 biyoreaktör) toplandı. J1 biyoreaktör içinde yetiştirilir Neonatal sünnet derisi fibroblast kadar% 0.05 'lik bir düzlem suşu ile, 60, 110 ya da 300 Hz'de titreşim 1 saat tabi tutulmuştur. QPCR sonuçlar, bazı ECM genlerin ekspresyon orta çeşitli titreşim frekanslarına karşılık olarak değiştirilmiş olduğu ileri sürülmüştürve genlikleri.
Bu biyoreaktör tasarımlar, ilginç ederken, çeşitli sınırlamalar var. Örneğin, T1 sistem ulaşılabilir maksimum frekansları sınırlayarak, mekanik bağlanma için konektörler ve bar bir sayıda gerektirir. Ayrıca, hücreler veri yorumlama karmaşık istenmeyen mekanik çalkalama ve sıvı pertürbasyon tabi tutulabilir. J1 biyoreaktör, diğer yandan, nispeten düşük enerji dönüşüm verimliliği sergiler ve kullanıcı dostu değildir. Buna ek olarak, titreşim sıklıkla temel silikon zardan hücre yüklü yapıları ayırır. J1 sürüm olarak aynı prensibe göre dizayn Burada bildirilen J2 vokal kord biyoreaktör, tutarlılık ve tekrarlanabilirlik için optimize edilmiştir. Fonasyon taklit eden titreşimler MSC nüfuslu lifli poli (ε-kaprolakton) (PCL) iskeleleri effectiv olan tek tek monte titreşim odalarına aerodinamik oluşturulurely güvenli. Lazer Doppler Titreşim Ölçer (LDV) kullanıcı membran / iskele montaj titreşim profilini doğrulamak sağlar. Bizim tanıtımda, MSC 7 gün boyunca 12 saat günlük bir toplam için 1 saatlik-on-1-hr-kapalı (OF) model ile 200 Hz sinüzoidal titreşimlere maruz kalmaktadır. Dayatılan titreşimli ipuçlarını hücresel yanıtlar sistematik olarak incelenmiştir. Genel olarak, J2 vokal kord dinamik hücre kültürü çalışmaları, yüksek verim ve tekrarlanabilir şekilde yapılacak sağlayan, en kullanıcı dostu özellikleri sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Biyoreaktör Meclisi (Video 1)
- Önceden belirlenmiş bir iç ve dış boyutlara sahip bir alüminyum kalıp (dairesel kalıp + boşluk pin) (Şekil 1) olun.
- In: (Şekil 1 'de boşluk pim ile şekillenen 12 mm, kalınlığı ~ 0.25 mm, çap) bir sabit kol ile aşama 1.1 kalıp kullanılarak, silikon membran (1.5 mm, Şekil 1: 42 mm, kalınlık çap) üretmek Bir ticari olarak temin edilebilen bir silikon elastomer kiti kullanılarak orta.
- Eşleşen çıkıntı ve oluklar ile blok (0.9 cm kalınlığında) üst oyma (1.8 cm kalınlığında) ve alt, ortada: dairesel bir açıklığa (24 mm çap) sahip akrilik bir çift bloğu (Şekil 2 (4, 5)) Yap . 10.
- Eşleştirilmiş akrilik bloklar arasındaki silikon membran sandviç. Sabit bir kuvvet (35 cN · m) ayarlanmış bir mikro tork tornavida kullanarak dört köşe vida ile düzeneğini sabitleyen. Sonuç olarak, bir su geçirmez, 24 mm genişliğinde ve 18 mm derinliğinde titreşim odası (Şekil 2C) oluşturulur.
- Alt akrilik blokta köşe vidalar başka bir dizi titreşim odasının altında bir 3 "uzun menzilli mini woofer (Şekil 2B, 8 Ω/20 W) monte edin. Bu noktada, tek bir titreşim modülü monte edilir.
- Yedi ek titreşim modülleri çoğaltmak. Çubuklar halinde kesilir eşit aralıklı bir dairesel delik (: 7 cm, kalınlığı 2 cm çapında) hoparlör bazları yerleştirilerek iki sabit alüminyum çubuklar (40 cm x 10 cm x 2.5 cm) birine dördü yapıştırın. Her bir dairesel deliğe alüminyum çubuğun tarafı boyunca bir vida sokulmasıyla her bir hoparlör stabilize.
- Bireysel bir hoparlör seçici tarafından hoparlörleri kontrol. Seçici üzerindeki karşılık gelen çıkışlarına sonra hoparlör vücut üzerinde pozitif ve negatif girişleri için teller takılarak seçicinin tek tek hoparlör bağlayın. Hoparlör Seçici olanak t sinyaliO fonksiyon jeneratörü, bir güç amplifikatörü geçtikten sonra, bir kez (Şekil 2E) bütün sekiz hoparlör ulaşmak için.
- Bir anti-nem muhafaza içinde iki odası dizileri, hoparlör seçici ve ilgili elektronik yerleştirin. Ticari bir hücre kültürü inkübatör tüm montaj ev.
- Inkübatör arka filtre düzeneği üzerinden güç amplifikatör ve hoparlör seçici bağlantı (a medikal PVC boru yoluyla) ana kablolar besleyin.
2.. İskele Üretimi ve Karakterizasyonu
- 15 ağırlık% 'lik bir konsantrasyonda kloroform içinde PCL pelet çözülür. Bir 21 G kör uçlu iğne ile kapatılmış bir 10 ml şırınga içine solüsyonu yerleştirin.
- Bir programlanabilir şırınga pompa üzerine şırınga Kilit ve / ml 'de 1 saat akış hızını ayarlayın.
- ~ 18 sm bir iğne ucu-toplayıcı için mesafe ile yatay olarak iğne arasında alüminyum folyo kaplı toplayıcı yerleştirin.
- Pozitif alli Kelepçeiğne ortasında ve alüminyum kollektör için zemin timsah klibi timsah klibi, sonra 15 kV yüksek gerilim güç kaynağı gerilimini ayarlayabilirsiniz. DİKKAT: yüksek gerilim, iğne mesafe tutmak.
- Sırasıyla şırınga pompa ve güç kaynağı açın; hızlı bir şekilde temiz / stabil fiber jetleri önce kuru bir kağıt havlu kullanarak iğne ucu çevreleyen kalan polimer çözüm kaldırmak ve Taylor koni 19 oluşturulmuştur.
- Lifler, 250-300 um ~ bir kalınlığa Al toplayıcı üzerinde birikmesine izin verir (~ mevcut eğirme koşulları altında 7 saat). Herhangi bir artık çözücünün çıkması için 1-2 gün için bir vakumlu desikatör içinde sonuçtaki iskeleleri saklayın.
- Görüntü iskelesi, tutarlı bir elyaf morfolojisi gösteren bir Tarama Elektron Mikroskobu kullanılarak, üzeri serpme altınla kaplanır. 10
3.. Biyoreaktör Montaj ve Karakterizasyonu
- Dört kol (uzunluğu: silindir şeklinde bir disk (8 mm çapında) 2: zımbailk olarak, diskin dış çapı azaltmak için bir 12 mm çaplı biyopsi zımba kullanılarak bükümlenmiş PCL mat (Şekil 2A) üzerinden mm). Ardından eşit silah kesilecek nerede puan dairesel bıçak çevresinde aralıklı dört 2 mm uzunluğunda çentikler yapmak için ikinci bir 8 mm biyopsi yumruk kullanın. 8 mm yumruk attıktan sonra, dışa kollarının kenarlarını kesmek için bir neşter bıçak kullanın. Uzatılmış kollar üzerinden silikon membran oluk içine yerleştirin iskele (Video 1). Nazikçe flathead cımbız kullanarak yüzeyi basarak eklenen iskele düzleştirin.
- Lazer yansıma yardımcı olmak üzere PCL iskele ince Al folyo küçük bir parça (8 mm x 2 mm, ortogonal şekil, Şekil 2B) takın.
- Titreşim odası içindeki monte silikon membran / PCL iskele (aşama 1.4 'de açıklandığı gibi) elde edin. Titreşim önce PCL iskele hidrat için odacık içinde 1.5 ml su ilave edilir.
- Fonksiyon jeneratör kullanarak, titreşim işareti tanıtmakals sandviç akrilik haznesine (0,1 V bir tepe-tepe voltaj, Vpp olan, örneğin, 200 Hz sinüs dalgaları). Doğru her hoparlör girişindeki voltajı ölçmek için bir voltmetre kullanın. Not: fonksiyon jeneratöründen gelen Vss okuma hoparlör teslim nihai geriliminden farklı olacaktır.
- Tek-nokta LDV birleştirin ve bir pan-tilt kafa tripod fiber-optik lazer sensör kafasını sabitlemek. Açı sensör kafasını o masa dik bakacak şekilde. Koaksiyel kablo üzerinden veri toplama modülüne LDV sensör kafasını bağlayın ardından USB üzerinden laptop modülü.
- Silikon membran (Şekil 2B ve Şekil 3) üzerinde çeşitli önceden belirlenmiş noktalarda dik olarak bir lazer ışını Odak.
- Veri toplama yazılımı kullanarak, orta zar deplasman kaydedebilirsiniz. "Seçenekler" menüsünden "Acquisition Ayarlar" ı tıklayın; sonra ölçüm modunu "FFT değiştirin221;. Sonra, ana araç çubuğundaki "Sürekli Ölçüm" tıklatın deplasman kaydetmek için seçilen frekansta (Şekil 6D) de oluşturan tepe tıklatın.
- Alt-tabaka üzerinde göreli konumun bir fonksiyonu olarak normal orta zar yer değiştirme (w 0) çizilir. Origin 8.5 veri analiz yazılımı kullanılarak yüzey titreşim profilinin 3D renk haritası oluşturun.
4. Titreşimli Hücre Kültürü
- Bakım MSC medya / cm 2 4,000-5,000 hücrelik bir başlangıç yoğunluğunda tohumlama T150 doku kültürü şişelerinde alt kültür İnsan kemik iliğinden türetilmiş MSC.
- Hücre kültürü 7-8 gün sonra (~% 85 konfluansa kadar), bu Accutase gibi bir hücre ayrıştırma maddesi ile hücreleri trypsinize, bir hemositometre, santrifüj (5 dakika için 440 x g) kullanılarak sayısı ve yeniden askıya hücre peleti içinde 4.5 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda taze MSC bakım ortamı.
- PCL scaffo daldırın% 70 etanol O / N. ld Çözücü buharlaştırılmıştır sonra 5-8 dakika boyunca UV ışığı (254 nm) için mikrop öldürücü skafoldun iki tarafını ortaya çıkarmak.
- 1 saat boyunca 37 ° C'de 20 ug / ml fibronektin çözeltisi içindeki PCL iskele bekletin. Silikon membran içine fibronektin kaplı iskele yerleştirin. 1. adımda ayrıntılı olarak biyoreaktör birleştirin.
- PCL güvenli iskele üzerinde düzgün bir şekilde hücre süspansiyonu 40 ul dağıtın. Hücreler titreşim bölmeye ilave bir 1.5 ml taze ortam ilave edilmeden önce 1-1.5 saat boyunca takmak için izin verin.
- Kültür MSC-yüklü PCL 3 gün boyunca statik iskele ve statik kültür tamamlandıktan sonra ortam yenileyin.
- Hücresel yapıları seçilen titreşim rejimleri empoze. Not: Örnek olarak, hücreler kadar 7 gün boyunca günde 12 saat boyunca ~ 40 um aw 0 ile 200 Hz'de titreşim (OF), bir 1-hr-on-1-hr-off tabi tutulur. Titreşimli uyarılara maruz Yapıları Vib örnekleri ve bu kültürlerdeki olarak belirlenmişstatik aynı titreşim odalarına kırmızı olarak statik kontrollerini (İstatistik) hizmet vermektedir.
5.. Biyolojik Değerlendirmeleri
- Her gün, her bölmeden 200 ul hücre kültür ortamı kazan (gün 1, 3, 5 ve 7) ve (800 ul her biri) ile birlikte, aynı örnekten alikotları havuz.
- MMP-1 (MMP1) ve üreticilerin prosedürü izleyerek, sırasıyla, bir MMP1 ELISA Geliştirme kiti ve bir hiyalüronan rekabetçi ELISA kiti kullanılarak HA hücresel üretim niceliğini. Öte yandan, daha önce bildirilen prosedür takip edilerek ELISA çözünür ön-elastin üretimini tahlil. 8
- 7. günde, son titreşim döngüsünün tamamlanmasından sonra, hızlı bir şekilde keskin cımbız kullanarak titreşim odalarından hücresel yapıları çıkarın ve kısa bir süre soğuk bir fosfat tamponlu tuzlu su (PBS, 4 ° C) ile yıkayın.
- Canlı / ölü boyama için, propidyum iyodür (PBS içinde 1:2,000) ile yapıları ve kuluçkaya yatmakSyto-13 oda sıcaklığında 5 dakika boyunca aynı anda (PBS içerisinde 1:1000). Görüntü bir multiphoton konfokal mikroskop ile boyanmış yapılar.
- Ayrı olarak, kuru buz üzerinde PBS ile durulanmıştır hücre yapıları ek dondurma ve gen analizleri için, daha önce rapor protokolü takip edilerek, toplam hücre RNA ekstrakte edin. 9
- UV-Vis spektrofotometre kullanılarak çıkarılan RNA miktarını ve kalitesini kontrol edin. 1,8-2,2 arasında A260/A280 ve A260/A230 oranları ile RNA numuneleri daha sonra QPCR analizi için kullanılmıştır.
- Ters bir ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanılarak ters transkripsiyon cDNA'ya RNA (500 ng / numune) uyarlamak.
- Daha önce detaylı bir prosedür izlenerek ticari olarak temin edilebilir PCR master karışımını kullanarak gerçek zamanlı bir sekans saptama sistemi üzerinde PCR reaksiyonu yapın. 8
- Ticari QPCR veri analiz yazılımı kullanılarak qPCR analiz sonuçları. Veri analizinin güvenilirliğini sağlamak için, çoklu referans genler (YWHAZ, TBP, PPIA) int olarak istihdam edilmektedirernal kontrol ve spesifik primer verimlilik değişme göz önüne alınır. 8
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Elektrospinning ile imal PCL iskeleleri mikron büyüklüğünde interstisyel gözenekler ve 4.7 um (Şekil 4A) arasında bir ortalama çapa sahip rastgele bir biçimde dolanmış elyaflar içerir. Daha yüksek bir büyütme oranında nano ölçekli oluklar ve gözenekler tek tek liflerin (Şekil 4B) üzerinde görülebilir. Fibronektinle iskelelerinin kaplama hidrofilikliğin geliştirir ve ilk hücre yapışmasını / PCL iskelesi (yayınlanmamış gözlem) yayılan kolaylaştırır.
Arzu edilen frekans (f, 100-300 Hz) ve gerilim ile Sinüzoidal dalga formu (Vss: 0-0,125 V) her bir titreşim odasının altındaki hoparlör ve silikon membran alt ve bir kağıt konisi arasında sınırlanmış hava tanıtılmaktadır mini woofer salınım içine sürülür. Hava salınım ile ya da olmadan hücre PCL iskele teslim edilir. LDV, belirli f ve Vpp de skafoldun titreşim karakteristiklerini analiz etmek için kullanılırdikkate suyun kırılma endeksi (1.33) alma. 20 Şekil 5, VPP bir fonksiyonu olarak PCL iskele merkezinde (w 0) normal değiştirmesini göstermektedir ve f. Titreşim frekansı, temel insan konuşma frekansları yansıtacak şekilde seçilir. 21, test edilen bütün frekanslar için 0-0,125 V aralığında var w 0 arasında doğrusal bir ilişki olduğu ve Vss. Belirli bir Vpp de, 100 ila 300 Hz f arttıkça 0 düşüşler w.
Belirli bir durum titreşim (f = 200 Hz, Vss = 0.1 V) daha fazla analiz için seçilmiştir. Zaman (Şekil 6) bir fonksiyonu olarak hız profili hoparlöre tanıtılan sinüzoidal sinyal yüksek bir aslına uygunluk PCL iskele tarafından ele olduğunu gösterir. PCL skafoldun merkezi 52 mm / sn 'lik bir pik hızı ile uzunlamasına salınır, bir tepe 66 m / sec 2 (~ 6.7g) bir ivme ve~ 40 um'lik, normal değiştirmesi. 100, 300, 400 ve 500 Hz harmonik sinyalleri temel frekans (200 Hz) daha düşük büyüklükte, en az bir düzen vardır. Vss değer (0.15 V) çok yüksek olan, ancak, temel frekans karşılaştırılabilir yoğunluk birden fazla harmonik zirveleri (Şekil 7) tespit edilir. Iskele boyunca titreşim profili PCL yüzeyinin radyal yönde 73 temsili noktalarında (Şekil 3) bir toplam yer değiştirme, normal izleme tarafından oluşturulur. 3D renk haritası (Şekil 8), zarın yüzeyi üzerinde algılanan titreşim aksisimetrik merkezine göre ve dinlenme konumu olduğunu göstermektedir. Normal yer değiştirme membran sabitlenir kenarına merkezinden tekdüze azalma olduğu bulunmuştur.
PCL iskeleleri kültürlenir MSC seçilen titreşim koşulları altında kültürlenir. 7-da maruz hücrelerstimülasyon y elyaflı iskeleleri cytocompatible ve uygulanan titreşim canlılığı hiçbir kaybına neden olduğunu teyit, statik kontrol (Şekil 9) gibi benzer canlılığı ve proliferasyonu özelliklerini korumak. Titreşimli uyaranlar hücresel yanıtlar, elastin (ELN) gibi temel vokal kat ECM proteinlerinin ekspresyonu, hyaluronan sentaz-1 (HAS1), Col3A1 ve MMP1 (Şekil 10) bakımından mRNA seviyelerinde incelenir. Titreşim statik kontrollere göre 7. günde ELN ifadesinde bir 2.3 kat artışa yol açar. Titreşimli uyarılar da orta Col3A1 ekspresyonu artmıştır. Bu büyük ECM yeniden enzimler, HAS1 ve MMP1 ifadesi, önemli ölçüde titreşim sinyalleri ile artar dikkat çekicidir. Özellikle, dinamik işleme HAS1 ve MMP1 için ~ 1.7 ~ 16.3 katlık bir artışa neden oldu 7. günde, statik kontrol fazla ifadesi (her ikisi de p <0.05), sırasıyla. Genel olarak, HAS1 ve MMP1 üzerine titreşimlerin indüktif etkisi 7 gün için günde 3 geliştirilmiştir.
Ayrıca QPCR sonuçları doğrulamak için, HA, çözünür elastin ve MMP1 hücresel üretim translasyon düzeyinde (Şekil 11) sonra ELISA ile ölçülür. Statik kontrol 2.7 ± 0.2 ug / mg), oysa elastin birikir dinamik olarak kültürlenmiş hücreler, titreşim 7 gün sonra çözünür elastin (kuru iskele ağırlık başına), 4.2 ± 0.1 ug / mg üretir. Ortalama olarak, titreşimlerin 7 günlük 2.2-ve HA 4.7-kat artış ile ilgili statik kontrollere göre, MMP1 salgılanması neden olmaktadır.
Video 1: J2 bioreaktörün düzeneğini gösteren bir 3D simülasyon. Video Autodesk 3ds Max Design (Congfei Xie izniyle) tarafından oluşturuldu.
"Fo: keep-together.within-page =" always ">
. Şekil 1. yerleşik kovan ile silikon membran imalatı için kullanılan Al kalıbın boyutunu gösteren Fotoğrafı Ø:. Çapı, d: kalınlık / derinlik, h:. Yükseklik bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
.. Şekil 2. Akış Şeması biyoreaktör düzeneğini gösteren (A), bir dört kollu şekilli PCL skafoldun bir fotoğraf, (B) titreşim odası ile bölmenin altına odaklanmış lazer vibrometreler sabitlenmiş olan PCL iskele gösteren bir fotoğraftır; ( C) bir kesittitreşim odasının al görünümü. 1: PCL iskele (kırmızı); 2: silikon membran (mavi); 3: Al sabit bar; 4: Üst akrilik blok; 5: Alt akrilik blok; 6: mini woofer, titreşim modülü (D) yan görünüm, (E) tüm montaj gösteren bir fotoğraf. Bu rakam Tong ve ark modifiye edilmiştir. 10. Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 3.. Tek nokta LDV ölçümleri için radyal işaretlenmiş silikon membran İllüstrasyon. Bu rakam Tong ve ark modifiye edilmiştir. 10. Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc
Farklı büyütme PCL iskelelerinin Şekil 4. SEM görüntüleri. (A) 600X, (B) 7,000 X. Bu rakam Tong ve ark modifiye edilmiştir. 10. Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Şekil 5,. Uygulanan bir frekans fonksiyonu (100, 200 ve 300 Hz) ve itici voltajı (Vss = 0-0,125 V) veya (w 0) silikon membran merkezinde Normal yer değiştirme. Bu rakam modifiye edilmiştir Tong vd. 10. Copyright 2013 ma dan ry Ann Liebert, Inc
, Frekansın bir fonksiyonu olarak f ile silikon membranın merkezi = 200 Hz ve zamanın bir fonksiyonu olarak bir Vss = 0.1 V. (A) hız profili tespit Şekil 6,. Titreşim özellikleri. (B) hız profili. (C) , frekansın bir fonksiyonu olarak ivme., frekansın bir fonksiyonu olarak (D) (w 0) Normal yer değiştirme. Bu rakam, Tong ve ark. 10 modifiye edilmiştir. Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
/ 51594fig7highres.jpg "/>
Şekil 7,., 200 Hz bir sinüs dalgası Vss = 0.15 V'ta mini-woofer sokulur zaman, frekansın bir fonksiyonu olarak (w 0) zarın merkezinde yer değiştirme tespit Normal
Tüm noktalarda toplanan, normal deplasman verileri kullanılarak yüzey gridleme inşa Şekil 8.. 3D renk haritası PCL iskele üzerinde işaretlenmiş. Bu rakam Tong ve ark modifiye edilmiştir. 10. Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc
Canlı / ölü boyama tarafından görüntülenmiştir Şekil 9.. Hücre canlılığı, titreşimler 7 gün sonra. Bu rakam Tong e modifiye edilmiştirt ark. 10. Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.
Vokal kat ilgili ECM genlerin ifadesi açısından titreşimli uyarılara 10. Hücresel tepkileri Şekil. Göreceli gen ekspresyonu (katlı değişim) bir gün 3 ve gün 7 (kesikli taban çizgisi) de ilgili statik kontrol için normalize edilir. **: Önemli ölçüde değişti (p <0.05) başlangıca göre: 3. gün ve 7, # arasında anlamlı bir fark (p <0.05). Veriler, ortalama ± ortalama standart hatayı temsil eder (SEM, n = 4). Iki kuyruklu Student t-testi p <0.05 anlamlı olarak kabul ediliyor di ile, istatistiksel analiz için kullanılırfference (aşağıda aynı). Bu rakam Tong ve ark modifiye edilmiştir. 10. Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc
Kuru ağırlığı başına iskele ECM moleküllerinin 7 gün boyunca Stat ve Vib koşullar altında PCL iskele kültürlenir MSC tarafından üretilen HA (A) Şekil 11. Biochemical miktar, çözünebilir ELN (B) ve MMP1 (C). Toplam miktarı (mg) . ± SEM ortalama olarak, temsili deneme n = 4 # temsil edilmektedir: önemli ölçüde geliştirilmiştir (p <0.05) kontrol grubuna göre Stat. Bu rakam Tong ve ark modifiye edilmiştir. 10. Copyright 2013 Mary Ann Liebert, Inc
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro fonksiyonel vokal kord dokuların başarılı mühendislik multipotent hücrelerinin davranışlarını aracılık etmek bir vokal kord benzeri mikroçevresinin rekreasyon gerektirir. Genellikle doku veya organ yapıları da gerçekleştirmek için gerekli işlevleri yansıttığı kabul edilmektedir. Vokal kord dokuları için 22, fonasyon sırasında ortaya çıkan yüksek frekanslı titreşimler doku olgunlaşması için önemli olduğu önerilmiştir. Vokal kord biyoreaktör kültürlü MSC'Iere fizyolojik ilgili mekanik sinyalleri tanıtmak için tasarlanmıştır ise bizim çalışmamızda, PCL iskeleleri bir bağ gibi yapısal destek sağlamak için kullanılır. (J2) Burada tarif biyoreaktör elektromanyetik bireysel hoparlörler aracılığıyla titreşim oluşturur ve kültür hücreleri enerji aerodinamik aktarır. Önceki tasarımı ile karşılaştırıldığında, 18 mevcut sistem fo sağlayan, her bir numune de doğrudan altında titreşim uyarım kaynağı taşırra daha verimli enerji dönüşüm. Bunun bir sonucu olarak, çok daha büyük bir yer değiştirme, normal ve daha yüksek bir ivme mevcut sistemi kullanılarak elde edilir. Modüler tasarımı da farklı titreşim odaları arasında sistem varyasyonları ve mekanik karmaşanın en aza indirir.
Bizim tasarım titreşim sinyallerini sunmak için bir silikon membran dayanır. Bu, zar bütünlüğü ve homojenliğini korumak için önemlidir. Öncü çözeltisi alüminyum kalıba dökülür, bu kalıp yüzeyi boyunca bir cam slayt sürükleyerek fazla sıvının çıkması için arzu edilir. Sürüklenen hava kabarcıkları olmadan tutarlı membranlar kür süresini artırırken sertleşme sıcaklığını düşürerek üretilebilir. Ayrıca,% 70 etanol çözeltisi geçici olarak sertleştirilmiş silikon kolayca çıkarılmasına izin vermek için, alüminyum arayüzünde membran şişirmek için kullanılabilir. 3D dinamik kültür, merkezi olarak konumlandırılmış ince oluk için hücresel yapıları yerleştirmek için iPCL iskeleleri çevresel titreşim bölmesi demirli olabilir, öyle ki silikon membran, kalıp s. Oluğun geometrisi ayarlanabilir; Bu şekilde, hücresel yapının şekli daha yerli vokal kıvrım geometrisini taklit etmek için buna göre ayarlanmış olabilir. 23 PCL iskele şekilde silikon zar içinde güvenli değilse, silikon PCL de ve dış bölge tespit LDV sinyalleri membran mükemmel örtüşmez. Biyoreaktör monte edilirken, bu istenmeyen hareketleri önlemek için ve oda değişimlerine bölmeyi en aza indirmek için, tüm bileşenlerin aynı derecede güvenli ve sıkılır önemlidir.
Bioreaktörün programı doğrulamak için, MSC PCL iskeleler üzerinde yetiştirilir ve 7 gün için titreşim (OF) aralıklı tabi tutulur. Günde birkaç saatlik bir süre boyunca titreşimlerin örneğin, mesleki şarkı, yoğun ses kullanıcılarının konuşma koşulları üretmek için kullanılır ers ve öğretmenler. 23. önceden bildirilen vokal kord biyoreaktörlerde aksine, bizim hücrelere herhangi bir zararlı etkisi ya da fizyolojik travmalar neden olmaz.
200 Hz-titreşim farklı olarak önemli ECM bileşenlerinin hücresel üretimini düzenleyecek şekilde bulunmuştur. Elastin vokal kord LP genelinde bulunan çok önemli bir yapısal protein ve esneklik ve elastikiyet kazandırır. Örneğin HA 24 İnterstisyel amorf bileşenleri, uygun doku viskoelastiklik ve skar oluşumu önlenmesi bakım katkıda. 25,26 MKH'ler tabi muamelesinden 7-gün statik kültürlü muadillerine göre elastin önemli ölçüde daha yüksek miktarda üretmek. HA üzerinde HAS1 ve ELISA sonuçları QPCR sonuçlarının da doğruladığı gibi HA biyosentezi de titreşimlere karşı duyarlıdır. Bu bulgular, biyoreaktör olarak etkin titreşim uyarımı, anti-yara izi moleküllerinin üretimi için elverişli olduğunu göstermektedir.
jove_content "> dengeli ECM devir eşzamanlı matris birikimi ve bozulma dayanır. 27 Tip III kolajen yük taşıma özellikleri olan doku temin eden, vokal kıvrım bulunan başlıca kollajen retiküler elyaftır. gen ekspresyonunu artırmak buluşta uygulanan 28 7 günlük titreşimler Col3A1 değil, aynı elastin çok daha düşük bir boyutta. Dolayısıyla, uygulanan titreşimleri diferansiyel III kolajen ve elastin sentezinde yer alan hücre amaçlı düzenler. İlginç bir şekilde, MMP1, matris bozulması ve doku yer alan önemli MMP'lerin bir yeniden 27 , titreşimli ipuçları için son derece duyarlıdır. Bu sonuçlar HA matris içinde sıkışıp kalan hücreler tarafından titreşim kaynaklı MMP1 upregülasyonu üzerine önceki raporlar ile de uyuşmaktadır. 29. Genel olarak, vokal kord biyoreaktör tarafından üretilen titreşimli uyarılar derinden hemostazını teşvik MSC fonksiyonlarına aracılık vokal kat gibi matrisler.Üzerindehepsi burada sunulan yeni vokal kord biyoreaktör dinamik hücre kültürü tekrarlanabilir bir şekilde yapılmasına olanak sağlayan, modüler ve kullanıcı dostudur. Ancak, bazı sınırlamalar mevcut tasarım bulunmaktadır. İlk olarak, titreşim genliği, J1 sürümü geliştirilmiş olmasına rağmen, vokal kord doku ile karşılaştırıldığında hala küçük. İkincisi, bizim biyoreaktör, normal fonasyon sırasında vokal kıvrımların ikili çarpışma simülasyonu değil. Üçüncüsü, lifli PCL iskele doku anizotropiye yansıtmamaktadır. Gelecekteki çalışmalar daha yerli fonasyon koşullarını taklit tasarım geliştirmeye adamıştır. Bu arada, 3D dinamik kültür için uygun rejimler in vitro başarılı fonksiyonel vokal kord montaj için incelenecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbir rakip mali çıkarları var.
Acknowledgments
Biz konfokal görüntüleme onun eğitim ve tavsiye için Dr Jeffrey Caplan'ı teşekkür ederim. Biz de SEM yardım için Keck Elektron Mikroskopi Lab ve Dr Chaoying Ni teşekkür ederim. Bu çalışma Sağlık (NIDCD, R01DC008965 ve R01DC011377) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edilmektedir. ABZ NSF Bütünleştirici Lisansüstü Eğitim ve Araştırma staj finansman için (IGERT) programı kabul eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | Cure the membrane at 100 °C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~80 kDa, dissolve O/N |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| Human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | Received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| Propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| Replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | Paper cone, full range (80-13,000 Hz), 85 dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | Torque range: 20-120 cN·m |
| Stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | Maximum power handling 50 W |
| Function generator | Agilent | 33220A | Frequency range 1 µHz-20 MHz |
| Power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | Frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| Cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | Output voltage: 0-30 kV |
| Scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| Desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | Non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| Multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | Acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| Aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| Acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| Polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| Electronic cable/wire | |||
| Medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | Clear, biocompatible |
| 10 ml Syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G Blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | Fully insulated |
| 8 mm Biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | Sterile, disposable |
| 12 mm Biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| Tissue culture flasks | Corning | Cell culture treated |
References
- Titze, I. R.
- Titze, I. R. On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation. J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).
- Gray, S. D.
- Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring. J. Voice. 16, 96-104 (2002).
- Hansen, J. K., Thibeault, S. L. Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring. J. Voice. 20, 110-120 (2006).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284, 143-147 (1999).
- Hanson, S. E., et al. Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts. Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).
- Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds. Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).
- Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor. Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).
- Jones, D. L., Wagers, A. J. No place like home: anatomy and function of the stem cell niche. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).
- Wang, J. H., Thampatty, B. P. Mechanobiology of Adult and Stem Cells. Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).
- Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels. Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Webb, K., et al. Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs. J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).
- Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Kutty, J. K., Webb, K. Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts. J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).
- Farran, A. J. E., et al. Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System. J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).
- Reneker, D. H., Yarin, A. L. Electrospinning jets and polymer nanofibers. Polymer. 49, 2387-2425 (2008).
- Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).
- Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional. J. Voice. 5, 310-315 (1991).
- Ingber, D. E. Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again. Faseb J. 20, 811-827 (2006).
- Titze, I. R., et al. Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses. J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).
- Moore, J., Thibeault, S. Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease. J. Voice. 26, 269-275 (2012).
- Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar. J. Voice. 17, 377-383 (2003).
- Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. Vocal fold wound healing: A review for clinicians. J. Voice. 20, 432-442 (2006).
- Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).
- Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers. Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).
- Kutty, J. K., Webb, K. Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria. Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).
