Eenkanaals-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

Summary

Hier beschreven is een procedure voor het verkrijgen van lange stukken huidige opname van een ionkanaal met de cel-bijgevoegde patch-clamp techniek. Deze methode maakt het mogelijk voor het observeren, in real time, het patroon van open-close kanaal conformaties dat de biologische signaal ten grondslag liggen. Deze gegevens informeren over kanaal woningen in ongestoord biologische membranen.

Abstract

Ionkanaaleiwitten zijn universele apparaten voor snelle communicatie over biologische membranen. De temporele ondertekening van de ionische flux zij genereren afhankelijk eigenschappen inherent aan elk kanaal eiwit en het mechanisme waardoor het wordt geproduceerd en gecontroleerd en vertegenwoordigt een belangrijk gebied van het huidige onderzoek. Informatie over de operationele dynamiek van ionkanaal eiwitten kunnen worden verkregen door het observeren langgerekte stroom door een enkel molecuul. Hier beschreven is een protocol voor het verkrijgen van een-kanaal-cel bevestigd patch-clamp huidige opnames voor een ligand-gated ionkanalen, de NMDA-receptor, heteroloog tot expressie in HEK293 cellen of native in corticale neuronen. Ook worden instructies over hoe de methode aan te passen aan andere ionkanalen van belang door de presentatie van het voorbeeld van de mechanisch-gevoelige kanaal Piezo1. Deze methode kan gegevens leveren met betrekking tot geleiding eigenschappen van het kanaal en de chronologische volgorde van open-gesloten conformaties die deel uitmaken van de activering mechanisme van het kanaal, hetgeen zal bijdragen tot hun functie in gezondheid en ziekte te begrijpen.

Introduction

Snelle communicatie over biologische membranen vrijwel uitsluitend een beroep op oligomere porievormende membraaneiwitten, meestal aangeduid als kanalen. Deze eiwitten verschillen sterk in activeringssignalen, gating mechanismen en geleiding eigenschappen. Kanaal eiwitten waarvan de poriën zijn selectief ionen worden geclassificeerd als ionkanalen; hun activering produceert ionenstromen over het membraan, en hun antwoorden kunnen worden opgenomen met een hoge resolutie in real time via elektrofysiologische technieken. De activering signalen bestrijken een breed scala aan chemische en fysische-ingangen, waaronder concentratiegradiënten, mechanische en elektrische krachten en temperatuur; dus, verdere indeling van ionkanalen in ligand gated, mechanosensitive, voltage gated, of warmte gevoelige types. In dit artikel worden de protocollen beschreven een-kanaal activiteit opnemen van een ligand-gated kanaal, de NMDA-receptor, en een mechanosensitive kanaal, Piezo1, met behulp van de patch-clamp techniek.0;

Patch-clamp elektrofysiologie is de eerste en meest gebruikte experimentele werkwijze voldoende gevoelig voor de waarneming van afzonderlijke moleculen ^{1, 2} mogelijk. Naast deze uitstekende gevoeligheid heeft enorm uitgebreid de biologische preparaten vatbaar voor elektrofysiologische opname en ook kon de waarneming van ionenkanalen in intacte membranen. Ten eerste, omdat zowel spanning klem en huidige opname wordt bereikt met dezelfde elektrode kan worden gebruikt om signalen op te nemen in kleine cellen of membranen patches. De techniek bleek dat ionkanalen niet beperkt blijven tot prikkelbaar membranen van kikker spieren, paling electroplaques of reuzeninktvis axonen ^{3, 4,} maar eerder dat zij vertegenwoordigen alomtegenwoordig armaturen van transmembraan signaleringsmechanismen en zijn inherent aan alle celmembraan vormen van uni-of meercellige organismen, alsmede intracellulaire membranen. Importantly, de mogelijkheid om transmembraan stromen opnemen door gewoon het aanbrengen van een glazen pipet om een ​​intacte cel op voorwaarde dat de ongekende kans om activiteiten te registreren van ionkanalen in hun eigen ongestoorde membranen. Aldus de cel verbonden patch-clamp techniek die wordt beschreven in dit protocol, maakt controle van de activiteit van ionenkanalen continu tientallen minuten of langer in hun eigen omgeving.

Onder normale thermische schommelingen, alle proteïnen, inclusief ionkanaaleiwitten, ondergaat structurele veranderingen over een breed tijdschaal, de snelste en meest voorkomende herschikkingen vertegenwoordigd waarschijnlijk door zijketen bewegingen en veel langzamer, minder frequente veranderingen voorgesteld door de herpositionering van de gehele domeinen of subeenheden, of in sommige gevallen door posttranslationele modificaties of eiwit-eiwit interacties ^{5, 6.} Observeren lange periodes van activiteit die door een molecuul kan helpen om de functie te begrijpennale dynamiek van ionenkanalen in intacte fysiologische membranen en waardevolle informatie over de operationele mechanisme van het molecuul waargenomen.

In tegenstelling tot het groeiende begrip van de diversiteit van ionenkanalen in celtypes en ontwikkelingsstadia, kennis over de moleculaire samenstelling van ionenkanalen in natieve membranen nog beperkt. Alle ionenkanalen multimere eiwitten en de meerderheid van inheemse ionenkanalen samenstellen uit verschillende soorten subeenheden produceren eiwitten brede moleculaire diversiteit, die vaak gepaard gaat met diverse geleiding en gating eigenschappen. Om deze reden, zijn ionkanalen van gedefinieerde moleculaire samenstelling bestudeerd na expressie in heterologe systemen. Vooral HEK293 cellen, die een klonale lijn van geïmmortaliseerde humane embryonale niercellen ⁷ zijn wijdverspreide acceptatie als het voorkeurssysteem voor heterologe expressie van recombinante ionenkanalen. Onder de many voordelen die HEK293 cellen verhoogd als de keuze voor ionkanalen elektrofysiologie zijn het gemak en betaalbaarheid kweken en onderhouden langlevende stabiele culturen hun bekwaamheid tot het post-translationele vouwen, verwerking en transport van zoogdiereiwitten, en in veel gevallen , hun lage of zelfs afwezigheid van endogene uitdrukking voor het kanaal van belang ^{7, 8.} Recombinant ionenkanalen en het bestuderen van hun functionele eigenschappen in HEK293 cellen blijft een waardevolle benadering voor informatie over de structuur-functie eigenschappen van ionenkanalen en de specifieke eigenschappen van ionkanaal isovormen en hun rol in natieve weefsel verkrijgen. De in dit artikel beschreven protocollen kunnen evengoed worden toegepast om recombinante ionkanalen tot expressie in HEK293 cellen en inheemse ionenkanalen.

Samengevat, de patch-clamp techniek, door zijn ongekende vermogen signaal lossens van het ene molecuul blijft tot op heden de meest directe methode voor het observeren van het gedrag van enkele moleculen. In zijn cel bevestigd mode, patch-clamp-opname maakt het mogelijk lange observatie periodes die, als je klaar bent voor een molecuul, kan uitzonderlijk inzicht geven in de werking van ionkanalen. Hieronder wordt voorgesteld een protocol voor het verkrijgen van de huidige opnamen van hoge resolutie van cel bevestigd pleisters met een ionkanaal eiwit.

Protocol

1. Celkweek en eiwitexpressie

1. Handhaaf HEK293 cellen (ATCC CRL-1573) tussen passages 22 en 40, welke passages uitgevoerd door ATCC, in monolaagkweek in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bevat en 1% penicilline / streptomycine mengsel bij 5% _CO2 en 37 ° C. Tussen experimenten werd passage cellen in T25 kolven 5-20 voudige verdunningen in een eindvolume van 10 ml. Opmerking: Het gebruik van cellen tijdens deze passages garandeert gunstige cel gezondheid, die zal zorgen voor een optimale vorming afdichting en patch stabiliteit.
2. Voor transfectie, plaat HEK293-cellen in 35 mm schalen bij een dichtheid van ~ 10 ⁵ cellen / schaal, wat overeenkomt met ~ 0,5-0,6 ml celsuspensie per schaal en groeien cellen in 2 ml medium voor 18-24 uur.
3. In een steriele 1,5 ml centrifugebuis, bereid de transfectie mengsel gedurende vier 35 mm schalen door toevoeging (in deze volgorde): (1) 1 ug van iedere cDNA (GluN1, GluN2A en GFP); (2) 315 pldubbel gedestilleerd water (DDH ₂ O); (3) 350 ul van 42 mM 4 - (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethaansulfonzuur (HEPES), en (4) 35 pl van 2,5 M _CaCl2 druppelsgewijs, die wordt gebruikt om het neerslag te vormen.
4. Vortex buis gedurende 5 seconden en voeg 175 ul transfectie suspensie in elk van de vier 35 mm schalen uitgeplaat de dag ervoor, die nu cellen bevatten 50-60% confluentie, en incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
5. Zuig uit het transfectie medium, wassen met PBS en vervangen door 2 ml groeimedium aangevuld met 2 mM _MgCl2 voorkomen NMDA receptor gemedieerde excitotoxiciteit ^9. Opmerking: De cellen kunnen worden gebruikt voor elektrofysiologische opnames 24-48 uur na transfectie.

2. Elektrode Voorbereiding

1. Genereer 2 symmetrische opname pipetten door te trekken op borosilicaat glazen buisjes met een verticale puller. Op basis van de grootte en geometrie van de resulterende tip, verder vorm pipettenmet behulp van een polijstmachine. Opmerking: De tip grootte kan visueel en elektrisch worden geëvalueerd. Visueel, moet de buitendiameter in het bereik 1,4-5,6 urn. Elektrisch, een optimale grootte tip, wanneer gevuld met extracellulaire oplossing, moeten weerstanden te produceren in de 12-24 MQ bereik (zie figuur 2B).
2. Gebruik een pipet oplossing, die voor cel bevestigd experimenten vertegenwoordigt de extracellulaire milieu dat de maximale activiteit op het kanaal en hoge stroom amplitudes zal produceren. Opmerking: NMDA receptoren, komt dit overeen met een oplossing die verzadigende concentraties agonisten (glutamaat en glycine), 1 mM EDTA, die tweewaardige kationen remmers en blokkers cheleert, en heeft fysiologische concentraties van natrium (150 mM) als enige doordringende ion ( in mM: 1 glutamaat, glycine 0,1, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 EDTA en 10 HEPBS, gebufferd bij pH 8,0 met 1 N NaOH).

3.-Cell bevestigd Patch-clamp-opname

1. Open QUB data-acquisitie software;re (www.qub.buffalo.edu), en selecteer de overname venster onder 'layout'. Open een nieuw QUB gegevensbestand (QDF) door te klikken op 'Nieuwe gegevens' onder de drop down menu getiteld 'Bestand' en voer de volgende initiële parameters: bemonsteringsfrequentie, 40 kHz; A / D-scaling, 3000; uitgangskanaal, 1; en A / D data grootte, 2. Stel de amplitude scaling tot 0,1 V / pA door met de rechtermuisknop te klikken op het bestand, eigenschappen te selecteren, en te klikken op het tabblad 'data'. Opmerking: Deze parameters kunnen worden verfijnd voor elke instelling met een model-cel in de cel bevestigd modus. Extra instructie over data-acquisitie met QUB software en QDF eigenschappen zijn online op www.qub.buffalo.edu.
2. Selecteer een 35 mm schotel met ionkanaal tot expressie brengen en te vervangen groeimedium met 2 ml PBS met calcium en magnesium; monteer de schotel op de microscoop podium en concentreer je op het veld met behulp van cellulaire fasecontrastmicroscopie te evalueren dat cellen gezond zijn en goed op de schotelin monolaag mode (figuur 1A). Schakel over naar fluorescentie detectie te controleren of de transfectie succesvolle (Figuur 1B) was. Opmerking: Het bereik van fluorescentie intensiteiten kunnen worden gebruikt als een ruwe indicator van eiwitexpressie.
3. Voor alleenstaande kanaals opname, stelt de versterker uitgangsversterking naar x10, patch configuratie om β = 1, analoog filter tot 10 kHz, mode om voltage-clamp en aangelegde spanning tot +100 mV. Met de houdspanning commando in de UIT-stand, selecteert u de 'seal test' knop.
4. Op basis van fluorescentie en gezondheid van de cellen, kiest een cel te patchen. Controleer onder fasecontrast dat de cel goed bevestigd aan de schotel, een groot deel van het celoppervlak blootgestelde repareert en overigens gezonde ziet. Opmerking: Handhaaf fase-contrast-verlichting te voorkomen bleken van de cel tijdens de nadering en patch-klemmen.
5. Vul een vers gepolijste pipet met net genoeg oplossing zodat het contact met de electrod maakte en schud voorzichtig om luchtbellen die kan worden gevangen in de punt los. Beveilig de opname pipet op de versterker headstage vast door de afdichtschroef van de pipet houder en zorg ervoor dat de zilveren draad wordt ondergedompeld in de pipet oplossing.
6. Met een kleine (5 cc) plastic injectiespuit, die is verbonden met de pipet houder door buizen voorzichtig toepassing positieve druk om verontreinigingen voorkomen dat verstopping en de punt tijdens de nadering (Figuur 2A).
7. Met behulp van de micromanipulator, richt de pipet in het bad en plaats het direct over de gekozen voor het patchen (figuur 1C) cel, het sluiten van het elektrische circuit. Kennis te nemen van de oscilloscoop, met een rechthoekige golfvorm overeenstemt met de versterker dichtheidsbeproeving signaal (Figuur 2B) moeten aangeven. Opmerking: Bij binnenkomst in het bad, de pipet weerstand binnen het optimale bereik is 12-24 MQ. Voor een 5 mV testsignaal, de gemeten stroom range komt overeen met ~ 20-40 pA.
8. Terwijl bewaken pipet positie visueel door de microscoop en pipet weerstand elektrisch op de oscilloscoop verder de benadering in kleine stappen tot botst pipet zachtjes op de cel en het testsignaal enigszins af tot verhoogde resistentie (Figuur 2B) te geven.
9. Om een afdichting te vormen, pak de spuit en lichte onderdruk aanmelden via de laterale buis door te trekken de zuiger, die de celmembraan trekt in de punt van de opname pipet en initieert de vorming van een GQ weerstand afdichting ^10. Kennis te nemen van de test signaal golfvorm op de oscilloscoop, waarin afdichting vorming wordt aangegeven door zijn compleet afvlakken, met alleen capacitieve transiënten zichtbaar (Figuur 2B). Opmerking: Als het signaal niet helemaal plat of de basislijn wordt luidruchtig, dit duidt op een zwakke afdichting met aanzienlijke huidige lek rond de afdichting. Dit r voorkomenesolving een kanaal stromen. Als dit het geval is, trekt de pipet uit de cel en uit de buurt van het bad, haal hem uit het hoofd podium en gooi hem weg. Herhaal het proces met een fris gepoetste pipet tot het verkrijgen van een zeehond in het adequaat bereik (≥ 1 GQ).
10. Op de versterker, schakel de externe opdracht toggle van 'seal test' 'uit'; Schakel de spanning houden commando om positieve (die eerder was ingesteld op 'off'); en verhoging van de winst voor x100. Let op de oscilloscoop voor kanaal activiteit, die, indien aanwezig, wordt weergegeven als vierkante opwaartse doorbuigingen van de eerder vlakke basislijn (figuur 2C).
11. Als kanaal activiteit wordt weergegeven op de oscilloscoop, gegevens verwerven in de eerder geopende digitale bestand in QUB, door op de 'play' knop, gevolgd door de 'Record' knop. Om te stoppen met het verwerven van gegevens, druk op de stopknop in QUB, en sla het QDF bestand naar een eenvoudig gegevensbestand,staat locatie op de harde schijf van 'Data opslaan als ...' in het drop down menu getiteld 'Bestand' te selecteren.

4. Gegevens Preprocessing en idealisering

Opmerking: Belangrijke informatie kan van enkele kanalen opnamen worden gewonnen door statistische analyses die elk gegeven toekent aan een passende geleiding klasse (in het eenvoudigste geval, open of gesloten). Dit proces wordt aangeduid als data idealisering en een korte beschrijving van gegevens idealisering de segmentale k middelen (SKM) methode ¹¹ in QUB wordt hieronder beschreven.

1. Open het bestand in QUB, en bekijk de huidige sporen in de 'Pre' interface van onder 'layout'. Geef het opgenomen bestand ongefilterde (verwijder digitaal filter) door het vinkje in het vakje 'Fc.'
2. Visueel scannen het record om onregelmatigheden en artefacten (Figuur 4A) te spotten. Correct korte stroompieken dat bedrijfspensioenvoorzieningr binnen het trace (Figuur 4A) door het selecteren van een aangrenzend schoon gebied van dezelfde geleiding klasse, aandacht voor deze regio, met de rechtermuisknop te klikken en te kiezen voor 'ingesteld erase buffer.' Zoom in op de spike tot individuele meetpunten zichtbaar zijn, selecteert u de regio te worden vervangen en wissen door te wijzen op alleen deze regio en vervolgens met de rechtermuisknop op 'wissen'.
3. Definieer de nul huidige basislijn voor de hele record door het selecteren van een vroege gedeelte van de plaat waar de basislijn stabiel is, hoogtepunt, klik met de rechtermuisknop en kies 'set baseline'. Controleer of de richtlijn die nauwkeurig verschijnt vertegenwoordigt het basisniveau (paars in figuur 4B)
4. Identificeer punten in het record waar de ruwe data basislijn afwijkt zichtbaar vanaf de set basislijn. Corrigeer dit door een klein deel van de uitgangswaarde selecteren binnen de afwijkende regio, klik met de rechtermuisknop en selecteer de optie 'voeg een basislijn knooppunt' commando.
5. Identificeer gebieden van de thij opnemen met overmatig lawaai of artefacten die niet gemakkelijk kan worden gecorrigeerd (Figuur 4C). Markeer de regio moeten worden afgevoerd, klik met de rechtermuisknop en kies 'verwijderen.' Opmerking: In dit geval zal kinetische informatie verloren: de verwerkte record korter zijn en de punten die na de splice punt zal verschijnen continu met de pre-ruis regio.
6. Als u records idealiseren met de SKM-algoritme ^11, markeert een deel van het trace die zowel open als gesloten evenementen en vul de interface 'Mod' onder 'Lay-out.' In het "model" paneel, markeert een schoon gedeelte van het spoor dat representatief is voor de basislijn in het hele bestand met de rechtermuisknop op het zwarte vierkant (gesloten toestand) en selecteer "grijpen". Doe hetzelfde voor kanaal openingen door te wijzen op de open geleiding, klik met de rechtermuisknop op de rode plein in het "model" paneel en selecteer "grijpen".
7. Voer de idealizatie voor het hele record door op de knop 'Bestand' onder 'Data Source.' Klik met de rechtermuisknop op de tab 'Idealize' onder de sectie 'Modeling' om te controleren of de gewenste parameters voor analyse juist zijn en klik vervolgens op 'Uitvoeren'. Het resultaat van de idealisering, samen met amplitude histogram voor het gehele bestand, wordt bedekt met de gegevens om voor visuele inspectie van de idealisering (Figuur 5). Opmerking: Onvoldoende idealisering kan leiden tot de generatie van 'valse gebeurtenissen,' waarin QUB detecteert kanaal openingen en sluitingen die niet echt gebeuren. Binnen de opname resolutie, die door de versterker analoge filter en de sampling rate is ingesteld, kan de resolutie waarmee SKM detecteert open en gesloten evenementen gecontroleerd worden door het instellen van een dode tijd voor de analyses. Optimale dode tijden moet proefondervindelijk worden geselecteerd en zal afhangen van sampling rate, echter, een goede vuistregel iseen dode tijd die 2-3 monsters ¹² selecteren.
8. Om te controleren of de idealisering nauwkeurig de ruwe data vertegenwoordigt, handmatig scannen de geïdealiseerde trace. Bij de identificatie van fouten in de idealisering, markeert het spoor over de valse evenement, klik met de rechtermuisknop en selecteer 'Join IDL.' Opmerking: Voor meer opties en een uitgebreide uitleg van de verschillende opdrachten en functies in QUB, raadpleeg de QUB Manual online (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Recombinant NMDA receptoren

NMDA-receptoren binden en te reageren op de gelijktijdige werking van twee co-agonisten: glutamaat en glycine. Ze assembleren als heterotetrameren van twee glycine binden GluN1 subeenheden en twee glutamaat bindend GluN2 subeenheden. GluN2 subeenheden worden gecodeerd door vier genen (AD) en van deze de meest getranscribeerd vormen in de hersenen zijn GluN2A bij volwassen en GluN2B bij jonge dieren. Vanwege de diversiteit van NMDA receptor subtypes in natieve preparaten expressie receptoren in HEK293-cellen (Figuur 1A) kan de controle van de subunit samenstelling, alsmede de mogelijkheid om op te nemen stroom van kanalen met een fijn geslepen glazen pipet (figuur 1C).

Nadat de pipet raakt de cel, een duidelijke vermindering van de amplitude van de testpuls golfvorm ontstaat (figuur 2B) waarin de mogelijkheid om een afdichting te vormen. Een adequate afdichting die eenkanaal produceert duidelijke kanaal activiteit, weergegeven als neerwaartse doorbuigingen van baseline, met een goede signaal-ruisverhouding op verzoek van een positieve spanning (figuur 2C). Maximale kanaal activiteit voor wild-type recombinante NMDA-receptoren kan worden bereikt wanneer beide agonisten in hoge concentraties aanwezig zijn, en wanneer remmers en bètablokkers afwezig zijn. Dit is ideaal, zodat wanneer een pleister bevat meerdere kanalen gelijktijdig openingen direct zichtbaar ¹³ (figuur 3B). Voor eiwitten met een zeer lage activiteit, kan de kans dat een stuk van een niveau openingen is afkomstig van slechts een kanaal worden berekend als het kanaal geopend waarschijnlijkheid bekend is of kan worden benaderd ^14. Hierdoor kunnen langere observatie nodig.

Onder deze omstandigheden, en bij toepassing van een pipet bedrijf potentiaal van 100 mV (die tot een geschatte membraan potentiaal van -120 mV), single recombinant GluN1/GluN2A en GluN1/GluN2B zijn open met hoge waarschijnlijkheid (P _o, 0,3-0,5) bij een relatief hoge geleidbaarheid niveau (> 50 ps) (Figuren 3A en 5B) ^15-17. Bij het ​​opnemen, kan de huidige geluidsoverlast spikes, basislijn drift, of perioden van overmatige ruis manifesteren (Figuren 4A-C), maar zoals gezegd, deze kunnen worden gecorrigeerd indien kort en klein. Het is echter belangrijk dat kanaalactiviteit ononderbroken wordt geconstateerd gedurende een voldoende tijd (≥ 10 min, 10.000 gebeurtenissen) garanderen dat volledige breedte van kanaal gedrag wordt vastgelegd.

De resultaten van dergelijke opnames gegevens kunnen informatie over zowel kanaal kinetiek en permeatie eigenschappen. Hier tonen we idealisering uitgevoerd met behulp QUB SKM algoritme (figuur 5A), maar gegevens idealisering kan worden uitgevoerd met andere softwareprogramma's zoals PClamp of SCAN ^12, eennd kan worden uitgevoerd met verschillende algoritmen of criteria, zoals de halve drempel methode, met elk van deze opties met hun eigen voordelen en nadelen. Montage van deze gegevens kinetische modellen kunnen worden uitgevoerd teneinde meer inzicht in het gedrag van het ionkanaal krijgen. Maximum likelihood fitting kan worden uitgevoerd met software zoals QUB of HJCFIT ^18, waarin de maatregelen die door elk programma algoritmen hebben hun eigen voordelen. Terwijl de idealisering aangetoond in figuur 5 is alleen de eenvoudigste model van een gesloten toestand en een open toestand worden uitgevoerd, passend volledig kinetisch model voor een ionkanaal vereist opeenvolgend toevoegen van gesloten en open toestanden tot een bepaald criterium wordt bereikt. Dit proces heeft aangetoond dat wild type GluN1/GluN2A receptoren hebben vijf kinetisch verschillende gesloten staten en 2-4 kinetisch verschillende geopende toestanden (figuur 5C) ^19, waarin dezegating kenmerken zijn essentieel voor het bepalen van de vorm van de NMDA-receptor-gemedieerde synaptische signaal ^{20, 21.} Dit soort analyse kan worden uitgebreid tot andere ionkanalen kleinere geleiding, zoals AMPA receptoren inzicht krijgen hun eigen specifieke gating mechanismen ^22,23,24. Een nadeel is echter, aangezien AMPA receptoren meerdere niveaus geleiding, succesvolle idealisering middels QUB vereisen andere staten zijn opgenomen in een vooraf gebouwde model.

Deze werkwijzen kunnen ook worden uitgebreid tot informaties ionenkanaal permeatie en geleidingsvermogen winnen door wijziging van de samenstelling doordringt ion en / of concentratie. VERWERKINGSACTIVITEIT door enkele GluN1/GluN2A receptoren volgens de hieronder beschreven werkwijzen, behalve dat 150 mM NaCl met 75 mM _CaCl2 in de opname pipet, levert stromen met ~ 20% van de geleiding (~ 10 pS). Dit toont aan dat terwijl calcium doordringt NMDA-receptoren bij high niveaus in fysiologische omstandigheden, het eigenlijk doorloopt het kanaal langzamer dan natriumionen, wat aangeeft dat er mogelijk calcium bindingsplaats binnen de permeatie route. Bovendien, ondanks dit kleine geleiding, de opnamen kunnen worden adequaat geïdealiseerd met de SKM-algoritme in QUB, het onthullen van het bestaan ​​van een intermediair subniveau geleiding, dat is ongeveer 50% van de huidige amplitude van de belangrijkste geleiding niveau (figuren 6A en B). Deze subniveau openingen kunnen echter alleen worden geïdealiseerd QUB wanneer een extra geleiding klasse opgenomen in de initiële kinetische model. Verdere kinetische analyses bleek dat, onder deze omstandigheden, receptoren vertonen nog vijf kinetisch verschillende gesloten staten, maar deze landen hebben zeer verschillende tijd constanten en bezettingsgraden in vergelijking met wanneer het kanaal laat alleen natrium-ionen (figuur 6C). Bovendien worden slechts twee open Staten U waargenomennder deze omstandigheden aantonen dat, naast het beïnvloeden kanaal geleiding, calciumionen kunnen gating receptor moduleren.

Er is geen bepaalde manier slechts een kanaal pleisters te verkrijgen. In plaats daarvan kunnen verschillende experimentele manipulaties bijdragen aan het vergroten van de kans op succes. Allereerst streven naar lage kanaal expressie door het evalueren van de fluorescentie-intensiteit van getransfecteerde cellen (Figuur 1B). Succesvolle benaderingen kunnen zijn: de totale hoeveelheid cDNA gebruikt voor transfectie of om de hoeveelheid cDNA verminderen voor een vereiste subeenheid, zoals GluN1 verminderen; de incubatietijd met de DNA / calciumfosfaat precipitaat verminderen; en selecteer repareert slechts vaag fluorescerende cellen van het gezichtsveld. Deze aanpak moet worden voortgezet indien de verkregen vlekken meerdere kanalen bevatten vaak. Bovendien verminderen de grootte van de pipetpunt kan ook bijdragen aan slechts een kanaal vangen in de patch. Uiteindelijk echter, wordt men succesvol in het verkrijgen van een-kanaal flarden door het systematisch onthouden van opname voor lange periodes van patches die meer dan een kanaal duidelijk bevatten.

Recombinant Piezo1 Kanalen

De in dit protocol beschreven werkwijzen kunnen gemakkelijk worden toegepast op elk ligand-gated ionkanalen, en inderdaad kan worden aangepast om een ​​kanaal activiteit opnemen elke ionkanaal, hetzij geactiveerd door chemicaliën, spanning, kracht, temperatuur, of andere middelen. Een voorbeeld van hoe dit protocol kan worden aangepast aan een kanaal stromen van andere ionen-zenders specifiek muis Piezo1 een mechanosensitive ionenkanaal wordt hieronder (Figuur 7) ^{25, 26} voorgesteld.

Zoals bij de NMDA receptor kanaal, Piezo1 en GFP expressie in HEK293 cellen door calciumfosfaat gemedieerde transfectie en cellen worden gebruikt 24-48 uur na transfectie alsbeschreven in paragraaf 1.2. Omdat Piezo1 wordt geactiveerd door membraan stretch, moet ervoor worden gezorgd dat het membraan voorzichtig manipuleren tijdens patch vorming en de geschikte instrumenten voor de levering en controle van de mechanische kracht toegepast moeten beschikbaar zijn. Deze omstandigheden kunnen worden bereikt door grotere opname pipetten met weerstand in de 2-3 MQ bereik en met een snelle druk kleminrichting (HSPC) verbonden met de opname pipet door de pipet houder op de versterker headstage. De versterker instellingen zijn gelijk aan die beschreven voor NMDA receptoren in punt 3.3, behalve voor het inschakelen van het "externe" bedieningsknop zodat de versterker kan worden bestuurd via de acquisitie software.

Activiteitgeschiedenis opnemen Piezo1, gebruikt een opname pipet gevuld met (in mM): 130 NaCl, 5 KCI, 10 HEPES, 1 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 TEA-Cl, pH 7,3 met NaOH. Onder deze omstandigheden kunnen openingen worden bewaakt als iCTIEVE natrium stromingen, die zal verschijnen op de oscilloscoop als neerwaartse doorbuigingen van een nul huidige baseline. Plaats de opname pipet op de versterker hoofd podium en zorg ervoor dat de draaiknop op de HSPC op nul staat. Alvorens het bad, breng 3-5 mmHg van positieve druk. Met behulp van de micromanipulator, laat de pipet in het bad, controleer gewenste pipet weerstand, en breng de pipet in de nabijheid van de geselecteerde cel zoals beschreven in paragraaf 3.6. Zachtjes aanraken van de cel onder de microscoop begeleiding en door het toezicht op de oscilloscoop, zich aan een lichte afname van de amplitude van de dichtheidsbeproeving golfvorm op een vergelijkbare manier als gedaan voor NMDA-receptoren (paragraaf 3.7). Snel de positieve druk die wordt uitgeoefend door de pipet door het veranderen van de druk holdingniveau 3-5 tot 0 mmHg los. Wacht een GQ afdichting te vormen door het bewaken van de dichtheidsbeproeving golfvorm. In dit geval wordt geen negatieve druk toegepast om een ​​afdichting te vormen. Zodra een optimale afdichting wordt verkregen door op de &# 8216;. Plaat 'knop QUB te beginnen te verwerven gegevens Figuur 7 toont een representatief spoor van mPIEZO1 enkelkanaals stromen geactiveerd door toepassing van -20 mmHg druk om de patch pipet. Deze stromingen waren low pass gefilterd bij 2 kHz en bemonsterd op 20 kHz.

In tegenstelling tot de ligand-gated kanalen met extracellulaire ligand bindende domeinen, kan de activerende stimulus mechanosensitive kanalen worden gevarieerd tot 2 protocollen. Het eerste 'gap-free "wanneer een constante negatieve druk wordt uitgeoefend op de patch voor de gehele opnameduur. Dit protocol is handig bij het verkrijgen minuten lang opnamen en is het meest succesvol met kleinere druk stimuli (0 tot 20 mmHg), die membraan integriteit te bewaren. Activiteit van onder hoge druk, die waarschijnlijk het membraan scheuren, het best bereikt met episodische opnamen, waarbij pulsen van wisselende druk kan worden toegepast op de patch voor kortere perioden (<strong> Figuur 7). Zoals met ligand-gated kanalen, opnames van cel bevestigd een kanaal pleisters leveren een schat aan informatie over zowel de geleiding en de gating eigenschappen van het kanaal in onderzoek.

Neuronale NMDA-receptoren

De hier beschreven methode voor cel verbonden eenkanaals opname kan worden gebruikt om informatie over de geleiding en gating eigenschappen kanalen endogeen een bepaald celtype en / of ontwikkelingsstadium verkrijgen. Zoals het geval is met vele andere heteromere kanalen, is de precieze moleculaire samenstelling van natieve NMDA receptoren onbekend. Door het vergelijken van de resultaten verkregen uit recombinante receptoren van bekende compositie met die verkregen uit inheemse voorbereidingen worden hypothesen geformuleerd over subunit samenstelling en de functie van de kanalen in hun eigen omgeving kunnen worden geformuleerd of getest ^17.

Neuronen werden geïsoleerd uit prefrontalecortex van ratten embryo en in kweek tot 6 weken ^17. Naast de onderdelen beschreven voor recombinant NMDA-receptor-opnames in paragraaf 2.2, de pipet oplossing bevatte ook CNQX (20 uM) en bicuculline (10 uM) voor de inheemse AMPA en GABA-receptoren remmen, respectievelijk. Afhankelijk van de leeftijd van de cultuur, de verkregen uit inheemse NMDA receptoren verslagen bleek kinetiek die heel anders waren. Opnames van vroeg (Figuur 8A, 5 dagen in vitro) cultuur meer lijken kinetiek beschreven voor GluN1/GluN2B receptoren en opnames van eind (figuur 8B, 27 dagen in vitro) culturen meer lijken kinetiek beschreven voor GluN1/GluN2A receptoren (figuren 3A en 5A). Deze waarneming is in overeenstemming met patronen van NMDA receptor expressie isovormen en met zorgvuldige karakteriseringen van stromingen opgenomen vanuit cel bevestigd eenkanaals vlekken in hippocampal culturen ^16.

Figuur 1. Selecteren HEK293 cel voor cel verbonden opnemen. A) HEK293 cellen gekweekt in een 35 mm schaal worden op de microscoop podium geplaatst en bekeken met fase-contrast bij 40x vergroting. B) GFP fluorescentie van hetzelfde gezichtsveld als in paneel A identificeert getransfecteerde cellen. Pijl geeft aan een cel die GFP uitdrukt, lijkt gezond, en in staat is vatbaar voor pipet toegang. C) De opname pipet wordt gebracht in de nabijheid van de geselecteerde cel met een fijne beweging manipulator onder visuele begeleiding. Klik hier om te bekijken grotere versie van deze figuur.

Figuur 2. Cell afdichting formatie bevestigd. A) Een kleine spuit verbonden met de zijde van de pipet houder maakt handmatige bediening van druk in de pipet. B) de stroom door de pipet ondergedompeld in badoplossing in reactie op de versterker test, die op 5 mV (0,5 kHz) is 18 pA, en komt overeen met een pipet grootte van 28 MQ. Bij het aanraken van de cel (linker pijl), het niveau van de waargenomen stroom neemt, indicatief voor verhoogde resistentie pipet. Het toepassen van negatieve druk door de pipet (pijl naar rechts) initieert afdichting vorming en vermindert het signaal dat door de test puls alleen capacitieve transiënten. C) Bij gebreke van een test puls, en als er geen spanning wordt aangelegd door de pipet (0 V), de basislijn is stabiel (linker pijl). Het toepassen van positieve spanning (pijl, 100 mV) pr oduces stochastische unitaire stromingen die kanaalopeningen aangeven. Rode stippellijn geeft de nul huidige baseline.

. Figuur 3 Cell bevestigd stromen opgenomen van GluN1/GluN2A receptoren A) Enkele kanaal patch:. A 50 sec segment van continue opname illustreert kanaal openingen naar een uniforme amplitude B) Multi-channel patch:. A 50 sec segment van continu opnemen illustreert kanaalopeningen twee amplitudeniveaus aangeeft dat de pleister ten minste 2 actieve kanalen. Rode stippellijn geeft nul huidige baseline. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

">
Figuur 4. Data processing. A) Correctie voor ruis spikes. Data display ongefilterde en handmatig vervangen de externe signaal (rood) met een uitgangswaarde van signaal. Uitgebreide weergave toont een piek voor (midden) en na (onder) de spike (rood) werd vervangen door basissignaalstructuur. B) correctie voor baseline drift. In het begin van het record, selecteert u een klein segment van de baseline en instellen als de stroom nul-niveau voor de hele record (paarse lijn). Correcte basislijn drift door het selecteren van een klein deel van de dreef basislijn (pijl) en het toevoegen van een baseline knooppunt (paarse cirkel). C) Langere perioden van het record met luidruchtige basislijn (rood) die moeilijk te corrigeren, kunnen worden verwijderd zijn. Klik hier om te bekijken een grotere versie van deze figuur.

Figuur 5. Gegevens idealisering. A) Huidige sporen (zwart) werden geregistreerd van de ene GluN1/GluN2A receptor passeren alleen natrium-ionen de cel bijgevoegde patch-clamp techniek. Geïdealiseerde datapunten (rood) worden geïllustreerd voor een 30 seconden een kanaal segment. Deze overlappen goed, wat aangeeft dat de idealisering juist is. B) Histogram van de huidige amplitudes illustreren een verdeling die goed wordt beschreven door slechts twee Gaussische functies met pieken op nul (0,02 ± 0,8 pA), indicatief van gesloten kanaal evenementen en 10,3 ± 1,3 pA indicatief voor slechts een type van open kanaal evenementen voor de gehele opnameduur (130 min). C) Gesloten (links) en open (rechts) verblijftijd histogrammen voor hele opname getoond in (A). De probabilheid dichtheidsfunctie van de histogrammen (dikke lijnen) en kinetische afzonderlijke componenten (dunne lijnen) worden gelegd en werden berekend door het aanbrengen van de gegevens aan een model met vijf gesloten staten en drie open toestanden. Bijvoegsels over een tijdconstante (τ) en relatieve oppervlak (a) voor elk van de afzonderlijke kinetische componenten.

Figuur 6. Calcium stromen door enkele NMDA receptoren. A) Huidige sporen (zwart) werden geregistreerd van de ene GluN1/GluN2A receptor passeren alleen calciumionen de cel bijgevoegde patch-clamp techniek. Geïdealiseerde datapunten (rood) worden geïllustreerd 30 sec segment. B) Histogram van de huidige amplitudes illustreren een verdeling die goed wordt beschreven door drie Gaussische functies met pieken op nul (0 ± 0,3 pA), indicatief van naasted kanaal gebeurtenissen, 1,3 ± 0,4 pA indicatief voor open kanaal evenementen om een subniveau geleiding, en 2,1 ± 0,3, indicatief voor open kanaal gebeurtenissen naar de belangrijkste geleiding niveau. C) Gesloten (links), de belangrijkste geleiding niveau open toestand (midden) en subniveau geleiding open toestand (rechts) verblijftijd histogrammen voor hele opname getoond in (A). De kansdichtheidsfunctie voor de histogrammen (dikke lijnen) en individuele kinetische componenten (dunne lijnen) op elkaar worden geplaatst en werden berekend door het aanbrengen van de gegevens naar een model met vijf gesloten staten, twee belangrijke geleiding niveau geopend staten en een subniveau geleiding open toestand. Bijvoegsels over een tijdconstante (τ) en relatieve oppervlak (a) voor elk van de afzonderlijke kinetische componenten.

Figuur 7. Cell bevestigd een kanaal opnemenvan mPIEZO1 uitgedrukt in HEK293 cellen. activiteit wordt opgewekt door het toepassen van -20 mmHg druk met een HSPC apparaat via de patch pipet, tijdens constante toepassing van spanning (+80 mV). Rode gestippelde lijn geeft de nul huidige niveau.

Figuur 8. Cell bevestigd een kanaal opnemen van inheemse kanalen. De pipet werd bevestigd aan de soma van een neuron dat werd gescheiden van de prefrontale cortex van een rat embryo en werd in cultuur gehandhaafd gedurende 5 dagen (A) of 27 dagen (B) . Continue NMDA receptor activiteit werd opgenomen met pipet oplossingen die glutamaat (1 mM) en glycine (0,1 mM), en ook CNQX (20 uM) en bicuculline (10 uM) met natief AMPA en GABA-receptoren remmen, respectievelijk. De activiteit werd opgewekt door toepassing +100 mV through de opname pipet. Rode gestippelde lijn geeft de nul huidige niveau.

Discussion

In het veld ionkanaal, is een belangrijk gebied van onderzoek gewijd aan het begrijpen van de opeenvolging van gebeurtenissen die leidt tot het openen of gating mechanisme van het kanaal kanaal. Voor de meeste kanalen, dit proces is complex en omvat verschillende kinetische stappen die niet kunnen worden afgeleid uit een macroscopische multikanaals signaal. In tegenstelling, kunnen experimenten worden opgezet waar het observeren van de opeenvolging van open / gesloten gebeurtenissen in single channel record kan meer gedetailleerde informatie over gating mechanismen produceren. In de hier beschreven werkwijzen, de extern gelegen ligandbindende gebied bezeten door NMDA receptoren maakt minimaal invasieve patch-clamp onder constante omstandigheden te worden uitgevoerd. Mogelijk moet dit protocol worden aangepast om geschikt te zijn voor het onderzoeken van andere ligand-gated ionkanalen, afhankelijk van zowel de ligand en receptor eigenschappen zijn.

Registraties van single channel activiteiten bieden twee soorten waardevolle informatie. Ten eerste,omdat de unitaire stroomamplitude direct worden gemeten, kunnen experimenten worden ontworpen om informatie over porie eigenschappen zoals kanaal geleiding, permeabiliteit en selectiviteit te krijgen. Ten tweede, omdat de duur van open en gesloten gebeurtenissen ook direct worden gemeten uit het record experimenten kunnen worden ontworpen om kinetische informatie gating verkrijgen en dus conclusies trekken over de operationele mechanisme van het kanaal. Voor beide typen experimenten betekenisvolle statistische analyse vereist binning elk individueel punt van de huidige spoor een specifieke geleidbaarheid klasse. Hier voorgesteld is een dergelijke methode om dit te doen, door de segmentale k-middelen (SKM) ¹¹ algoritme, maar dit kan worden bewerkstelligd door verscheidene min of meer verfijnde algoritmen waaronder half-drempel, SCAN ^12, Baum-Welch, Viterbi, etc.

Opnames met behulp van de configuratie-cel bevestigd zijn krachtig in die ionenkanalen worden bewaard in biologischemembranen met onverstoorbaar intracellulaire milieus. Hierdoor is het cruciaal dat membraan afdichtingen voldoende gevormd en bewaard gedurende de registratietijd voor twee doeleinden: 1) experimenteel continuïteit en 2) het creëren van een gunstige signaal-ruisverhouding (piek basislijnruis <2 pA piek). De grootte en vorm van de pipetpunt gegenereerd bepaalt de waarschijnlijkheid van een succesvolle membraamafdichting die precies een kanaal. Een platte tip zorgt ervoor dat wanneer de pipet nadert de cel zal raken en druk op de celmembraan met de hele tip oppervlak in een keer, waardoor uniform verzegelen op de cel. Een pipet met een tip die te breed is zal minder waarschijnlijk resulteren in een kanaal pleisters zijn; daarentegen bij het ​​trekken van een pipet met een tip die te smal zal resulteren in een omega-vormige membraan lus die kan afdichten aan de basis en verstoppen de pipet ^10.

Een gunstige signaal-ruisverhouding worden beheerd door het minimaliseren van elektrische apparatenlawaai. De headstage koeling functie op de Axopatch 200B heeft toegestaan ​​voor een optimale resolutie van het signaal; nochtans ruis nog worden opgewekt door een van de apparatuur die bij de elektrofysiologie opgezet, en externe bronnen zoals licht en verwante elektronica. Gelukkig kunnen verschillende strategieën worden toegepast om ruis te minimaliseren tot een gewenst niveau ^{2, 27.} Kortom, zorg ervoor dat onderdelen van de uitrusting die kan produceren ruis zijn geaard zijn om een ​​punt in de setup. Bij Daarbij is het belangrijk om de vorming van aardlussen die aanzienlijke ruis veroorzaken voorkomen. Bovendien, als 60 cyclus ruis aanwezig is, moet u alle lichten die kan interfereren met de opname signaal uit te schakelen. Tenslotte plaatsen van een Faraday kooi rond de optekeninrichting voorkomt buurt hindernissen veroorzaken elektrische ruis.

Observing kanaal voor een lange periode heeft aangetoond dat gatingconformationele veranderingen kunnen optreden over een breed scala van tijdschalen. Tijdelijk, zijn patch-clamp gegevens beperkt tot de 'korte' uiteinde door de bandbreedte van de versterker en de snelheid waarmee het versterkte signaal gedigitaliseerd en in 'lange' uiteinde van het kijkvenster. Voor vormveranderingen die sneller is dan de lage limiet zijn, kunnen patch-clamp opnames bieden slechts informatie als in combinatie met complementaire experimentele benaderingen. Voor conformationele veranderingen die optreden bij zeer langzaam verloopt, en zijn dus zelden bemonsterd, kan men het aantal waarnemingen verhogen of verlenging van de duur van de plaat, maar dit niet altijd mogelijk.

Ondanks deze beperkingen, patch-clamp-data, met name wanneer verkregen van een individueel kanaal, bevatten vaak meer informatie dan onmiddellijk extraheerbaar huidige rekenmethodieken. Zo is de verwachting dat toekomstige verhogingen van rekencapaciteit en in de sophistication van algoritmes of er eventueel bijkomende toepassingen. Bij de komst van deze voorschotten, is te verwachten dat patch-clamp opnames van enkele kanalen in staat zijn om gelijktijdig plaatsvinden met FRET metingen, calcium imaging of zelfs in vivo voorbereidingen om nadere informatie over de structuur, functie en dynamiek van ionkanalen in voorzien zowel inheemse en gecontroleerde omgevingen.

De diversiteit van ionenkanalen onderzocht toeneemt, gedetailleerd inzicht in hun gating mechanismen en uiteindelijk begrijpen hoe hun werking bijdraagt ​​aan hun unieke biologische functies zullen profiteren van enkel molecuul waarnemingen. Met name de gegevens verkregen met de one-kanaal patch-clamp belofte om te informeren over unitaire geleiding eigenschappen en gating sequenties voor recombinante en inheemse kanalen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1