Un canale Cell-allegato patch-clamp registrazione

Summary

Qui viene descritta una procedura per ottenere lunghi tratti di registrazione corrente da un canale ionico con la tecnica patch-clamp cell-attached. Questo metodo permette di osservare, in tempo reale, il modello di apertura-chiusura conformazioni di canale che stanno alla base del segnale biologico. Questi dati informano sulle proprietà dei canali nelle membrane biologiche inalterate.

Abstract

Proteine ​​canale Ion sono dispositivi universali per la comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche. La firma temporale del flusso di ioni generano dipende dalle proprietà intrinseche di ciascuna proteina canale così come il meccanismo attraverso il quale è generato e controllato e rappresenta un'importante area di ricerca corrente. Informazioni sulle dinamiche operative delle proteine ​​del canale ionico può essere ottenuta osservando lunghi tratti di corrente prodotte da una singola molecola. Qui descritto è un protocollo per ottenere patch-clamp registrazioni di corrente di un canale Cell-attached per una gated canale ionico ligando, il recettore NMDA, espresso eterologamente in cellule HEK293 o nativo in neuroni corticali. Sono fornite anche le istruzioni su come adattare il metodo per gli altri canali ionici di interesse presentando l'esempio del canale PIEZO1 meccano-sensibili. Questo metodo può fornire dati riguardanti le proprietà conduttanza del canale e la sequenza temporale di opeconformazioni n chiusi che compongono il meccanismo di attivazione del canale, contribuendo così a capire le loro funzioni in materia di salute e di malattia.

Introduction

Comunicazione veloce attraverso le membrane biologiche si basa quasi esclusivamente su oligomeriche formanti pori proteine ​​di membrana, comunemente indicato come canali. Queste proteine ​​sono molto diverse in segnali di attivazione, meccanismi di gating, e le proprietà di conduttanza. Proteine ​​canale cui pori sono selettivi per ioni sono classificati come canali ionici; la loro attivazione produce correnti ioniche attraverso la membrana, e le risposte possono essere registrati con alta risoluzione in tempo reale utilizzando tecniche elettrofisiologiche. I segnali di attivazione abbracciano una vasta gamma di input chimici e fisici, tra cui gradienti di concentrazione, forze meccaniche ed elettriche, e la temperatura; in tal modo, un ulteriore classificazione canali ionici in ligando recintato, meccanosensibili, tensione recintato, o tipi sensibili al calore. In questo articolo, i protocolli sono descritti per registrare l'attività di un canale da un canale ligando gated, il recettore NMDA, e un canale meccanosensibili, PIEZO1, utilizzando la tecnica del patch-clamp.0;

Patch-clamp elettrofisiologia è il primo e più diffuso metodo sperimentale sufficientemente sensibile per consentire l'osservazione di singole molecole ^{1, 2.} In aggiunta a questa sensibilità squisita, ha potenziato notevolmente i preparati biologici suscettibili di registrazione elettrofisiologica e inoltre ha permesso l'osservazione dei canali ionici in membrane intatte. In primo luogo, perché entrambi serraggio tensione e corrente di registrazione sono realizzate con lo stesso elettrodo, può essere utilizzato per registrare segnali attraverso piccole cellule o membrane patch. La tecnica ha rivelato che i canali ionici non sono limitati alle membrane eccitabili dei muscoli della rana, electroplaques anguilla, o assoni giganti di calamaro ^{3, 4,} ma piuttosto che essi rappresentano infissi onnipresenti di meccanismi di segnalazione transmembrana e sono intrinseci a tutti i tipi di membrane cellulari di uni-o organismi multicellulari, e anche alle membrane intracellulari. Importantly, la capacità di registrare le correnti transmembrana semplicemente collegando una pipetta di vetro di una cellula intatta fornito l'opportunità senza precedenti per registrare l'attività di canali ionici nelle loro membrane undisrupted nativi. Così, l'allegata patch-clamp cella, che è descritto in questo protocollo, consente il monitoraggio dell'attività di canali ionici ininterrottamente per decine di minuti o più nel loro ambiente nativo.

In normali fluttuazioni termiche, tutte le proteine, tra cui proteine ​​del canale ionico, subiscono cambiamenti strutturali su vasta scala di tempo, con i riarrangiamenti più veloci e più frequenti rappresentato probabilmente dai movimenti della catena laterale e molto più lento, meno frequenti cambiamenti rappresentate dal riposizionamento dell'intero domini o subunità, o in alcuni casi di modificazioni post traduzionali o interazioni proteina-proteina ^{5, 6.} Osservando lunghi periodi di attività generate da una molecola può aiutare a comprendere la funzionedinamica zionali di canali ionici in membrane fisiologiche intatte e fornisce preziose informazioni circa il meccanismo di funzionamento della molecola osservata.

In contrasto con la crescente comprensione della diversità dei canali ionici attraverso tipi di cellule e fasi di sviluppo, le conoscenze sulla composizione molecolare dei canali ionici in membrane native è ancora limitata. Tutti i canali ionici sono proteine ​​multimeriche e la maggior parte dei canali ionici nativi assemblare da diversi tipi di subunità che producono proteine ​​di diversità molecolare ampia, che è spesso accompagnata con conduttanza e gating diverse proprietà. Per questo motivo, canali ionici di composizione molecolare definita sono studiati su espressione in sistemi eterologhi. In particolare, cellule HEK293, che sono una linea clonale delle cellule renali embrionali umane immortalizzate ^7, ampiamente accettato come il sistema preferito per l'espressione eterologa di canali ionici ricombinanti. Tra l'uomovantaggi y che le elevate cellule HEK293 come il sistema ideale per elettrofisiologia canale ionico sono la facilità e la convenienza di coltura e il mantenimento delle culture stabili di lunga durata, la loro capacità di svolgere post-traslazionale piegatura, l'elaborazione e il traffico di proteine ​​di mammiferi, e in molti casi , il livello basso o addirittura assenza di espressione endogena per il canale di interesse ^{7, 8.} Esprimendo canali ionici ricombinanti e studiare le loro proprietà funzionali in cellule HEK293 continua ad essere un valido approccio per ottenere informazioni sulle proprietà struttura-funzione dei canali ionici e le proprietà specifiche delle isoforme del canale ionico e il loro ruolo nel tessuto nativo. I protocolli descritti in questo articolo possono essere applicati ugualmente bene a canali ionici ricombinanti espressi in cellule HEK293 e canali ionici nativi.

In sintesi, la tecnica del patch-clamp, attraverso la sua capacità senza precedenti di risolvere segnales da una molecola rimane, ad oggi, il metodo più diretto per osservare il comportamento delle singole molecole. Nella sua modalità cella-attached, la registrazione patch-clamp consente lunghi periodi di osservazione che, se fatto per una molecola, può fornire indicazioni eccezionale sul funzionamento dei canali ionici. Qui di seguito viene presentato un protocollo per l'ottenimento di registrazioni correnti ad alta risoluzione da cellulari patch allegati contenenti una proteina del canale ionico.

Protocol

1. Coltura cellulare e proteine ​​Expression

1. Mantenere cellule HEK293 (numero ATCC CRL-1573) tra i passaggi 22 e 40, che comprende i passaggi eseguiti da ATCC, in coltura monostrato in DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina miscela al 5% di CO ₂ e 37 ° C. Tra gli esperimenti, le cellule di passaggio in fiasche T25 5-20 diluizioni in un volume finale di 10 ml. Nota: Utilizzando cellule durante questi passaggi garantisce la salute delle cellule favorevole che consentirà per la formazione tenuta ottimale e la stabilità patch.
2. Per la trasfezione, le cellule HEK293 in piastra da 35 mm ad una densità di ~ 10 ⁵ cellule / piastra, che corrisponde a ~ 0,5-0,6 ml di sospensione cellulare per ogni piatto e crescere le cellule in 2 ml di mezzo per 18-24 ore.
3. In una sterile 1,5 ml tubo da centrifuga, preparare la miscela di trasfezione per quattro piatti il ​​35 mm per l'aggiunta (in questo ordine): (1) 1 mg di ciascun cDNA (GluN1, GluN2A, e GFP); (2) 315 ml diacqua bidistillata (DDH ₂ O); (3) 350 ml di 42 mM 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), e (4) 35 ml di 2,5 M CaCl ₂ goccia a goccia, che viene utilizzato per formare il precipitato.
4. Tubo Vortex per 5 sec e aggiungere 175 ml di sospensione trasfezione in ciascuno dei quattro piatti 35 millimetri piastrate il giorno prima, che ora contiene globuli a 50-60% di confluenza, le cellule e incubare a 37 ° C per 2 h.
5. Aspirare il mezzo off trasfezione, lavare con PBS e sostituire con 2 ml di terreno di coltura addizionato con 2 mM MgCl ₂ per prevenire recettore NMDA mediata eccitotossicità ^9. Nota: Le celle possono essere utilizzati per le registrazioni elettrofisiologiche 24-48 ore dopo la trasfezione.

2. Elettrodo Preparazione

1. Generare due pipette di registrazione simmetriche tirando tubi in vetro borosilicato con un estrattore verticale. In base alle dimensioni e geometria della punta risultante, altre pipette formacon una lucidatrice. Nota: Il formato di punta può essere valutata visivamente ed elettricamente. Visivamente, il diametro esterno dovrebbe essere nel range 1,4-5,6 micron. Elettricamente, una punta massima dimensione, quando riempita con una soluzione extracellulare, dovrebbe produrre resistenze nel range 12-24 mW (vedi Figura 2B).
2. Utilizzare una soluzione di pipetta, che per esperimenti sulle cellule divisoria rappresenta il mezzo extracellulare che produrrà canale attività massima e ampiezze elevate correnti. Nota: per i recettori NMDA, questo corrisponde ad una soluzione contenente saturazione concentrazioni di agonisti (glutammato e glicina), 1 mM EDTA, che chela inibitori bivalenti cationici e bloccanti, ed ha concentrazioni fisiologiche di sodio (150 mm) come unico ione permeante ( in mM: 1 glutammato, glicina 0,1, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA 1, e 10 HEPBS, tamponata a pH 8,0 con NaOH 1 N).

3. Cell-allegato patch-clamp registrazione

1. Aperto acquisizione dati QUB Softwari (www.qub.buffalo.edu), e selezionare la finestra di acquisizione sotto 'layout'. Aprire un nuovo file di dati QUB (QDF) cliccando su 'New Data' sotto il menu a tendina intitolato 'File' e inserire i seguenti parametri iniziali: frequenza di campionamento, 40 kHz; A scala D /, 3000; canale di uscita, 1; e la dimensione dei dati A / D, 2. Regolare la scala di ampiezza di 0,1 V / pA facendo clic destro sul file di dati, selezionare Proprietà e fare clic sulla scheda "dati". Nota: Questi parametri possono essere affinate per ogni impostazione utilizzando un modello cellulare in modalità cella-attached. Istruzione supplementare su acquisizione dati con software QUB e le proprietà QDF sono online in www.qub.buffalo.edu.
2. Selezionare un piatto 35 millimetri contenente canale ionico cellule esprimenti e sostituire terreno di coltura con 2 ml di PBS contenente calcio e magnesio; montare il piatto sul palco microscopio e concentrarsi sul campo di cellulare utilizzando la microscopia a contrasto di fase per valutare che le cellule sono sani e ben attaccate al piattoin modo monostrato (Figura 1A). Passare alla rivelazione della fluorescenza per verificare che la trasfezione era successo (Figura 1B). Nota: L'intervallo di intensità di fluorescenza può essere utilizzato come misura grezza di espressione della proteina.
3. Per la registrazione canale singolo, impostare il guadagno dell'amplificatore di uscita per x10, configurazione patch per β = 1, filtro analogico a 10 kHz, la modalità di tensione-clamp e applicata tensione a +100 mV. Con il comando dell'azienda di tensione in posizione OFF, selezionare il pulsante 'prova di tenuta'.
4. Sulla base di fluorescenza e la salute delle cellule, scegliere una cella di patch. Verificare in contrasto di fase che la cella è ben attaccato al piatto, ha una grande porzione della superficie cellulare esposta per la permutazione, e altrimenti sembra sano. Nota: Mantenere l'illuminazione a contrasto di fase per evitare di sbiancamento cella durante l'avvicinamento e patch-bloccaggio.
5. Riempire una pipetta appena lucidato con appena soluzione sufficiente in modo che rende il contatto con il elettrodoe e agitare delicatamente per rimuovere le bolle d'aria intrappolate nella punta. Fissare la pipetta di registrazione sul headstage amplificatore serrando la vite di tenuta del supporto pipetta e fare in modo che il filo di argento viene immerso nella soluzione pipetta.
6. Usando un piccolo (5 cc) siringa di plastica, che è collegato al supporto pipetta dalla tubazione, applicare delicatamente pressione positiva per evitare l'ingresso delle impurità e intasamento della punta durante l'avvicinamento (Figura 2A).
7. Utilizzando il micromanipolatore, dirigere la pipetta nel bagno e posizionare direttamente sopra la cella selezionata per la permutazione (Figura 1C), chiudendo il circuito elettrico. Prendere nota dell'oscilloscopio, che dovrebbe indicare una forma d'onda rettangolare corrispondente al segnale di prova di tenuta dell'amplificatore (Figura 2B). Nota: Al momento dell'entrata in vasca, la resistenza pipetta nel range ottimale è 12-24 mW. Per un segnale di prova 5 mV, il r corrente misurataange corrisponde a ~ 20-40 pA.
8. Durante il monitoraggio posizione pipetta visivamente attraverso la resistenza microscopio e pipetta elettricamente sull'oscilloscopio, continuare l'avvicinamento in piccoli incrementi finché la pipetta incide delicatamente sulla cella, e il segnale di test diminuisce leggermente a indicare una maggiore resistenza (Figura 2B).
9. Per formare un sigillo, prendere la siringa ed applicare una leggera pressione negativa attraverso il tubo laterale tirando lo stantuffo della siringa, che tira la membrana cellulare nella punta della pipetta registrazione e avvia la formazione di un sigillo GΩ resistenza ^10. Prendere nota della forma d'onda del segnale di prova sull'oscilloscopio, in cui la formazione sigillo è indicato dal suo appiattimento completo, con solo transienti capacitivi visibili (Figura 2B). Nota: Se il segnale non appiattire completamente o la linea di base diventa rumoroso, questo indica un sigillo debole con sostanziale perdita di corrente intorno alla tenuta. Questo consentirà di evitare resolving uno correnti canale. Se questo è il caso, ritirare la pipetta dalla cella e lontano dal bagno, rimuoverlo dalla fase testa e scartarla. Ripetere il processo con una pipetta appena lucidato fino ad ottenere un sigillo nella gamma adeguata (≥ 1 GΩ).
10. L'amplificatore, spegnere l'interruttore di comando esterno da 'prova di tenuta' a 'off'; attivare il comando di tensione che tiene a positivo (che è stato fissato in precedenza a 'off'); e aumentare il guadagno per x100. Osservare l'oscilloscopio per l'attività di canale, che, se presente, verrà visualizzata come deviazioni verso l'alto quadrati dalla linea di base precedentemente piatta (Figura 2C).
11. Se l'attività del canale viene visualizzato sul oscilloscopio, acquisire i dati in file digitale aperto in precedenza QUB, premendo il tasto 'play' seguito dal tasto 'record'. Per interrompere l'acquisizione dei dati, premere il pulsante stop in QUB, e salvare il file QDF ad un facile reperimentoposizione grado sul disco rigido del computer selezionando 'Salva dati con nome ...' nel menu a tendina intitolato 'File'.

4. Dati pre-elaborazione e idealizzazione

Nota: Le informazioni importanti possono essere estratte dalle registrazioni di singolo canale da analisi statistiche che assegna ogni punto dati per una classe di conduttanza appropriata (nel caso più semplice, chiuso o aperto). Questo processo è indicato come idealizzazione dati e una breve descrizione di idealizzazione dati con i mezzi k segmentale (SKM) metodo ¹¹ in QUB è descritta di seguito.

1. Aprire il file di dati in QUB, e visualizzare le tracce attuali nell'interfaccia 'Pre' sotto 'layout'. Visualizzare il file registrato non filtrato (rimuovere il filtro digitale) deselezionando la casella 'Fc.'
2. Visivamente la scansione del registro per individuare le irregolarità e artefatti (Figura 4A). Correggere brevi picchi di corrente che occur all'interno della traccia (Figura 4A) selezionando una regione pulita adiacente della stessa classe conduttanza, mettendo in evidenza questa regione, tasto destro del mouse e selezionando 'buffer di cancellazione impostata.' Zoom sul picco fino a singoli punti di campionamento sono visibili, selezionare la regione da sostituire e cancellare evidenziando solo questa regione e quindi fare clic destro 'cancellazione'.
3. Definire la linea di base corrente zero per l'intero record selezionando una porzione iniziale del record in cui la linea di base è stabile, evidenziare, fare clic destro e selezionare 'basale set'. Verificare che la linea guida che appare esattamente rappresenta il livello di base (viola in Figura 4B)
4. Identificare punti nel record in cui la linea di base dati grezzi si discosta visibilmente dalla linea di fondo set. Correggere questo selezionando una piccola sezione della linea di base nella regione deviando destro del mouse e selezionare il comando 'aggiungere un nodo di base'.
5. Identificare le regioni di tegli registrazione contenente eccesso di rumore o artefatti che non possono essere facilmente corretti (Figura 4C). Evidenziare la regione da scartare, fare clic destro e selezionare 'cancella'. Nota: In questo caso sarà persa informazioni cinetica: il record elaborato sarà più breve ei punti che si verificano dopo il punto di giunzione sembrerà essere continuo con la regione pre-rumore.
6. Per idealizzare i record utilizzando l'algoritmo SKM ^11, evidenziare una porzione della traccia contenente sia aperto ed eventi chiusi e inserire l'interfaccia 'Mod' sotto 'Layout'. Nel pannello "modello", evidenziare una parte pulita del tracciato rappresentativo della linea di base in tutto il file, fare clic con il quadrato nero (stato chiuso) e selezionare "afferrare". Fare lo stesso per le aperture dei canali, mettendo in evidenza la conduttanza aperto, fare clic destro sul quadrato rosso nel pannello "modello" e selezionare "afferrare".
7. Eseguire la idealizazione per l'intero record selezionando il pulsante 'File' sotto 'Origine dati.' Fare clic destro sulla scheda 'idealizzare' sotto la sezione 'Modeling' per verificare che i parametri desiderati per l'analisi siano corrette, quindi fare clic su 'Esegui'. Il risultato della idealizzazione, insieme con istogramma ampiezza per l'intero file, viene sovrapposto con i dati per consentire l'ispezione visiva del idealizzazione (Figura 5). Nota: idealizzazione inadeguato può portare alla generazione di "eventi falsi,« in cui QUB rileva aperture dei canali e chiusure che in realtà non si verificano. Entro la risoluzione di registrazione, che è impostato dal filtro analogico dell'amplificatore e la frequenza di campionamento, la risoluzione con cui SKM rileva gli eventi di apertura e chiusura può essere controllata impostando un tempo morto per le analisi. Tempi morti ottimali devono essere selezionati per tentativi ed errori e dipenderà dalla frequenza di campionamento, tuttavia, una buona regola èper selezionare un tempo morto che è 2-3 campioni ^12.
8. Per verificare che l'idealizzazione rappresenta con precisione i dati grezzi, la scansione manualmente la traccia idealizzato. Dopo l'identificazione di errori nella idealizzazione, evidenziare la traccia sopra il falso evento, fare clic destro e selezionare 'Join Idl.' Nota: per ulteriori opzioni e una spiegazione dettagliata dei vari comandi e funzioni in QUB, consultare il QUB Manuale on-line (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Ricombinante NMDA recettori

Recettori NMDA legano e rispondere all'azione concomitante di due co-agonisti: glutammato e glicina. Si assemblano come heterotetramers di due glicina vincolanti subunità GluN1 e vincolante subunità GluN2 due glutammato. Subunità GluN2 sono codificate da quattro geni (AD) e di questi le forme più ampiamente trascritti nel cervello sono GluN2A in adulti e GluN2B negli animali giovani. A causa della diversità dei sottotipi del recettore NMDA in preparati native, esprimono dei recettori in cellule HEK293 (Figura 1A) consente il controllo della composizione subunità, così come la possibilità di registrare corrente da canali utilizzando una pipetta di vetro finemente lucido (Figura 1C).

Una volta che la pipetta tocca la cella, una netta riduzione di ampiezza dell'impulso di forma d'onda di prova si verifica (Figura 2B), che indica la capacità di formare un sigillo. Una tenuta adeguata contenente unocanale produce attività del canale chiaro, visualizzata come deviazioni verso il basso rispetto al basale, con un buon rapporto segnale-rumore su richiesta di una tensione positiva (Figura 2C). Attività del canale massima per la wild type recettori NMDA ricombinante può essere raggiunto quando sono presenti in alte concentrazioni sia agonisti, e quando inibitori e bloccanti dei canali sono assenti. Questo è ideale, in modo che quando un cerotto contiene più di un canale, aperture simultanee sono immediatamente evidenti ¹³ (Figura 3B). Per le proteine ​​con livelli di attività molto bassi, la probabilità che un tratto di uno aperture livello proviene da un solo canale può essere calcolata se la probabilità di apertura del canale è noto o può essere approssimata ^14. A causa di questo, periodi di osservazione più lunghi possono essere necessari.

In queste condizioni, e quando si applica un potenziale un'azienda pipetta di +100 mV (portando ad un potenziale di membrana approssimativa di -120 mV), SIngle GluN1/GluN2A ricombinante e GluN1/GluN2B sono aperti con alta probabilità (P _o, 0,3-0,5) per un livello di conduttanza relativamente elevato (> 50 pS) (Figure 3A e 5B) ^15-17. Durante la registrazione, picchi di corrente di rumore, derive di base, o periodi di rumore eccessivo possono manifestarsi (Figure 4A-C), tuttavia come detto, questi possono essere corretti se breve e minori. E 'importante, tuttavia, che l'attività canale viene registrato senza interruzioni per un periodo di tempo sufficiente (≥ 10 min, 10.000 eventi) per garantire che l'intera gamma di comportamenti canale viene catturato.

I dati ottenuti da tali registrazioni possono fornire informazioni su entrambi canale cinetiche e proprietà di penetrazione. Qui, dimostriamo idealizzazione eseguita QUB utilizzando l'algoritmo SKM (Figura 5A), tuttavia idealizzazione dei dati può essere effettuata utilizzando altri programmi software, quali pClamp o SCAN ^12, unND può essere effettuata utilizzando diversi algoritmi o criteri, come il metodo metà soglia, con ciascuna di queste opzioni contenenti i loro vantaggi e svantaggi. Lato di questi dati a modelli cinetici possono essere eseguite al fine di ottenere una visione più i comportamenti del canale ionico. Lato massima verosimiglianza può essere eseguita con software come QUB HJCFIT o ^18, in cui gli algoritmi implementati da ciascun programma hanno i loro vantaggi. Mentre l'idealizzazione dimostrato nella Figura 5 richiede solo il modello più semplice possibile di uno stato di chiusura ed una condizione aperta da eseguire, adattando un modello cinetico completo per un canale ionico richiede aggiungendo sequenzialmente chiusi e stati aperti fino a raggiungere un certo criterio. Questo processo ha dimostrato che i recettori di tipo selvatico GluN1/GluN2A hanno cinque stati chiusi cineticamente distinti e 2-4 stati aperti cineticamente distinti (Figura 5C) ^19, in cui questicaratteristiche gating sono cruciali per determinare la forma del recettore NMDA mediata segnale sinaptico ^{20, 21.} Questo tipo di analisi può essere estesa ad altri canali ionici di conduttanza più piccole, come i recettori AMPA, per ottenere informazioni di propri meccanismi di gating distinti ^22,23,24. Un avvertimento è, tuttavia, dal momento che i recettori AMPA hanno più livelli di conduttanza, idealizzazione di successo utilizzando QUB può richiedere ulteriori Stati sono incorporati in un modello precompilato.

Questi metodi possono anche essere estese per ottenere informazioni sulla permeazione canale ionico e conduttanza alterando la permeando composizione ionica e / o concentrazione. Registrazione dell'attività mediante recettori GluN1/GluN2A singoli utilizzando i metodi qui descritti, ma sostituendo NaCl 150 mM CaCl con 75 mM ₂ nella pipetta di registrazione, produce correnti con ~ 20% della conduttanza (~ 10 pS). Ciò dimostra che mentre il calcio permea recettori NMDA a hilivelli di GH in condizioni fisiologiche, in realtà attraversa il canale più lentamente di ioni sodio, che indica che ci può essere un potenziale sito di legame del calcio all'interno del percorso permeazione. Inoltre, nonostante questa piccola conduttanza, le registrazioni possono essere adeguatamente idealizzato usando l'algoritmo SKM in QUB, rivelando l'esistenza di una conduttanza sottolivello intermedio, che è circa il 50% della corrente di ampiezza del livello di conduttanza principale (figure 6A e B). Queste aperture sottolivello, tuttavia, possono essere idealizzate solo in QUB quando una classe conduttanza supplementare è incorporato nel modello cinetico iniziale. Ulteriori analisi cinetiche rivelato che, in queste condizioni, i recettori presentano ancora cinque stati chiusi cineticamente distinti, tuttavia questi stati hanno estremamente differenti costanti di tempo e occupazioni rispetto a quando il canale passa solo ioni sodio (Figura 6C). Inoltre, solo due stati aperti si osservano under queste condizioni dimostrano che, oltre ad influenzare conduttanza canale, ioni calcio sono in grado di modulare gating recettore.

Non esiste un certo modo avere solo una patch canale. Invece, diverse manipolazioni sperimentali possono contribuire ad aumentare la probabilità di successo. Primo, puntare basso livello di espressione dei canali valutando l'intensità di fluorescenza delle cellule trasfettate (Figura 1B). Approcci di successo possono essere le seguenti: diminuire la quantità totale di cDNA utilizzati per la trasfezione o per diminuire la quantità di cDNA di subunità necessario, come è GluN1; per diminuire il tempo di incubazione con il fosfato precipitato DNA / calcio; e selezionare per la permutazione uniche cellule debolmente fluorescenti dal campo visivo. Questi approcci dovrebbero essere perseguite se le patch ottenuti spesso contengono più canali. Inoltre, diminuendo la dimensione della punta della pipetta può anche contribuire alla cattura solo canale in PATCh. In definitiva però, si diventa successo nell'ottenere patch a un canale sistematicamente ometta di registrazione per lunghi periodi di patch che contengono chiaramente più di un canale.

Canali PIEZO1 ricombinanti

I metodi descritti in questo protocollo possono essere facilmente applicati a qualsiasi canale ionico gated ligando, e in effetti possono essere adattati per registrare un canale attività da qualsiasi canale ionico, se attivato da sostanze chimiche, tensione, forza, temperatura, o altri mezzi. Un esempio di come questo protocollo può essere adattato per registrare una corrente di canale da altri canali ioni, specificamente topo PIEZO1, un canale ionico meccanosensibili, è la seguente (Figura 7) ^{25, 26.}

Come con i canali del recettore NMDA, PIEZO1 e GFP sono espressi in cellule HEK293 da calcio fosfato mediata trasfezione e cellule sono utilizzati 24-48 alberino trasfezione comedescritto nella sezione 1.2. Poiché PIEZO1 è attivato da membrana tratto, occorre prestare attenzione a manipolare la membrana delicatamente durante la formazione di patch e appropriati dispositivi per la consegna e controllo della forza meccanica applicata dovrebbe essere disponibile. Queste condizioni possono essere conseguiti grandi pipette di registrazione, con resistenza nell'intervallo 2-3 mW e utilizzando un dispositivo di bloccaggio pressione alta velocità (HSPC) collegato alla pipetta di registrazione attraverso il supporto pipetta sulla headstage amplificatore. Le impostazioni dell'amplificatore sono simili a quelle descritte per i recettori NMDA nella sezione 3.3, tranne per l'accensione della manopola di comando 'esterno' in modo che l'amplificatore può essere controllato attraverso il software di acquisizione.

Per registrare l'attività da PIEZO1, utilizzare una pipetta di registrazione riempito con (in mM): 130 NaCl, KCl 5, 10 HEPES, 1 CaCl _2, 1 _MgCl2, 10 TEA-Cl, pH 7,3 con NaOH. In queste condizioni, le aperture possono essere monitorati come icorrenti di sodio nward, che appariranno sul oscilloscopio come deviazioni verso il basso da una linea di base corrente zero. Posizionare la pipetta di registrazione sul palco testa amplificatore e assicurarsi che il selettore sulla HSPC è a zero. Prima di entrare nel bagno, applicare 3-5 mmHg di pressione positiva. Utilizzando il micromanipolatore, abbassare la pipetta nel bagno, per controllare la resistenza pipetta desiderata, e per portare la pipetta in prossimità della cella selezionata, come descritto al punto 3.6. Toccare delicatamente la cella sotto la guida microscopio e monitorando l'oscilloscopio, osservare una lieve riduzione di ampiezza della forma d'onda di prova di tenuta in modo simile a come fatto per i recettori NMDA (punto 3.7). Rilasciare rapidamente la pressione positiva applicata attraverso la pipetta cambiando il livello di mantenimento della pressione del 3-5 a 0 mmHg. Attendere un sigillo GΩ per formare monitorando la forma d'onda di prova di tenuta. In questo caso, nessuna pressione negativa è applicata per formare un sigillo. Una volta che una tenuta ottimale si ottiene premendo il &# 8216;. Pulsante di registrazione 'in QUB per avviare l'acquisizione di dati figura 7 mostra una traccia rappresentante della mPIEZO1 correnti di singolo canale attivati ​​mediante l'applicazione di -20 mmHg di pressione per la pipetta di patch. Queste correnti erano filtraggio passa-basso a 2 kHz e campionato a 20 kHz.

In contrasto con ligando canali gated con ligando extracellulare domini di legame, lo stimolo attivando canali mechanosensitive può essere variato in 2 protocolli. Il primo è 'libero-gap,' in cui una pressione negativa costante viene applicato il patch per l'intera durata della registrazione. Questo protocollo è utile per ottenere minuti registrazioni di lunga durata ed è più successo con stimoli più piccoli di pressione (da 0 a 20 mmHg), che conservano l'integrità della membrana. Attività prodotto da alta pressione, che rischia di rompere la membrana, è meglio ottenuta con registrazioni 'episodici', dove gli impulsi di pressioni varianti possono essere applicate la patch per periodi di tempo più brevi (<strong> Figura 7). Come con canali ligando gated, registrazioni da cellule attaccate una patch di canale offrono una ricchezza di informazioni per quanto riguarda sia la conduttanza e le proprietà di gating del canale in esame.

Neuronale recettori NMDA

Il metodo qui descritto per la registrazione di un canale Cell-divisoria può essere utilizzato per ottenere informazioni sulla conduttanza e proprietà di comando dei canali endogena ad un particolare tipo di cellula e / o stadio di sviluppo. Come è il caso con molti altri canali heteromeric, l'esatta composizione molecolare dei recettori NMDA nativi non è noto. Confrontando i risultati ottenuti dai recettori ricombinanti di composizione nota con quelli ottenuti da preparazioni native, ipotesi sulla composizione subunità e la funzione di canali nel loro ambiente nativo può essere formulato o testata ^17.

I neuroni sono stati isolati da prefrontalecortecce di embrioni di ratto e cresciuti in coltura per fino a 6 settimane ^17. Oltre ai componenti descritti per ricombinanti registrazioni del recettore NMDA nella sezione 2.2, la soluzione di pipetta conteneva anche CNQX (20 micron) e bicucullina (10 micron) per inibire AMPA e GABA recettori nativi, rispettivamente. A seconda dell'età della coltura, le registrazioni realizzate dai recettori NMDA nativi rivelato cinetica che erano piuttosto differente. Registrazioni dalla prima (Figura 8A, 5 giorni in vitro) cultura più somigliano cinetica descritti per i recettori GluN1/GluN2B e registrazioni da fine (Figura 8B, 27 giorni in vitro) culture si avvicinano maggiormente a cinetica descritti per i recettori GluN1/GluN2A (Figure 3A e 5A). Questa osservazione è coerente con i modelli di NMDA isoforme di espressione del recettore e con accurate caratterizzazioni delle correnti registrate da cellule attaccato patch a un canale in hipculture pocampal ^16.

Figura 1. Selezione di un cellulare HEK293 per la cella di registrazione allegata. A) HEK293 cellule coltivate in un piatto da 35 millimetri sono immessi sul palco microscopio e visualizzati con contrasto di fase a 40X di ingrandimento. B) GFP fluorescenza dallo stesso campo visivo a pannello A identifica cellule trasfettate. Freccia indica una cellula che esprime GFP, appare in buona salute, ed è in una posizione suscettibile di pipetta accesso. C) La pipetta di registrazione è portato nelle immediate vicinanze della cella selezionata con un bel movimento manipolatore sotto guida visiva. Cliccare qui per visualizzare un grande versione di questa figura.

Figura 2. Cellulare attaccato formazione sigillo. A) Una piccola siringa collegata al lato del supporto pipetta permette il controllo manuale della pressione all'interno della pipetta. B) La corrente che passa attraverso la pipetta immersa nella soluzione del bagno in risposta al test amplificatore, che a 5 mV (0,5 kHz) è 18 pA, e corrisponde a una dimensione pipetta di 28 mW. Dopo aver toccato la cella (freccia a sinistra), il livello di corrente decresce osservati, indicativi di una maggiore resistenza pipetta. Applicazione di pressione negativa attraverso la pipetta (freccia destra) avvia la formazione guarnizione e riduce il segnale prodotto dal trigger di controllo al solo transienti capacitivi. C) In assenza di un impulso di prova, e se non è applicata tensione attraverso la pipetta (0 V), la linea di base è stabile (a sinistra della freccia). Applicando una tensione positiva (freccia, +100 mV) pr oduces correnti unitari stocastici che indicano aperture dei canali. Red linea tratteggiata indica la linea di base corrente zero.

. Figura 3 Cellulari correnti collegati registrati dai recettori GluN1/GluN2A A) di patch a un canale:. Un segmento di 50 secondi di registrazione continua illustra aperture dei canali ad una sola ampiezza uniforme B) Multiple-canale patch:. Un segmento di 50 secondi di registrazione continua illustra aperture dei canali a due livelli di ampiezza indicano che il cerotto contiene almeno 2 canali attivi. Red linea tratteggiata indica zero di riferimento attuale. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Elaborazione dei dati. A) Correzione per picchi di rumore. Visualizzazione dei dati non filtrato e manualmente sostituire il segnale estraneo (rosso) con segnale basale. Vista espansa illustra un picco prima (al centro) e dopo (inferiore) del picco (rosso) è stato sostituito con il segnale di base. B) Correzione della deriva della linea di base. All'inizio del record, selezionare un piccolo segmento della linea di base e impostarlo come l'attuale livello zero per l'intero record (linea viola). Corretta la deriva della linea di base selezionando una piccola porzione di scivolò basale (freccia) e l'aggiunta di un nodo di base (cerchio viola). C), periodi più lunghi di registrazione con riferimento rumoroso (rosso) che sono difficili da correggere può essere eliminato. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Idealizzazione dei dati. A) tracce correnti (nero) sono stati registrati da un recettore GluN1/GluN2A passa solo ioni di sodio con la tecnica del patch-clamp cell-attached. Punti dati idealizzati (rosso) sono illustrati per 30 secondi un segmento di canale. Questi sovrappongono bene, indicando che l'idealizzazione è accurato. B) Istogramma delle ampiezze correnti illustrano una distribuzione che è ben descritto da solo due funzioni gaussiane con picchi a zero (0,02 ± 0,8 pA), indicativo di eventi canale chiuso e 10.3 ± 1.3 pA indicativo di un solo tipo di eventi canale aperto per tutta la durata della registrazione (130 min). C) Chiuso (sinistra) e aperto (destra) dimorano istogrammi temporali per tutta la registrazione mostrato in (A). La probabilitfunzione di densità lità per gli istogrammi (linee spesse) e componenti cinetiche individuali (linee sottili) sono sovrapposti e sono stati calcolati inserendo i dati in un modello contenente cinque stati chiusi e tre stati aperti. Inserti forniscono la costante di tempo (τ) e superficie relativa (a) per ciascuna delle singole componenti cinetiche.

Correnti Figura 6. Calcio attraverso i recettori NMDA singoli. A) tracce correnti (nero) sono stati registrati da un recettore GluN1/GluN2A passando solo gli ioni di calcio con la tecnica del patch-clamp cell-attached. Punti dati idealizzati (rossi) sono illustrati 30 segmento sec. B) Istogramma delle ampiezze attuali illustrano una distribuzione che è ben descritto da tre funzioni gaussiane con picchi a zero (0 ± 0,3 pA), indicativo di una strettaeventi d canale, 1,3 ± 0,4 pA indicativo di eventi di canale aperto a una conduttanza sottolivello, e 2,1 ± 0,3, indicativo di eventi di canale aperti al livello di conduttanza principale. C) Chiuso (a sinistra), il livello di conduttanza principale stato di apertura (al centro) e sottolivello conduttanza stato di apertura (a destra) abitano istogrammi temporali per tutta la registrazione in (A). La funzione di densità di probabilità per gli istogrammi (linee spesse) e componenti cinetiche individuali (linee sottili) sono sovrapposti e sono stati calcolati inserendo i dati in un modello contenente cinque stati chiusi, due stati aperti livello di conduttanza principali e una sottolivello conduttanza stato aperto. Inserti forniscono la costante di tempo (τ) e superficie relativa (a) per ciascuna delle singole componenti cinetiche.

Figura 7. Cellulare attaccato una registrazione del canaleda mPIEZO1 espresso in cellule HEK293. attività viene suscitato applicando pressione -20 mmHg con un dispositivo HSPC attraverso la pipetta di patch, durante costante applicazione di tensione (+80 mV). Red linea tratteggiata indica il livello corrente zero.

Figura 8. Cellulare attaccato un canale di registrazione da canali nativi. La pipetta è stata attaccata al soma di un neurone che è stato dissociato dalla corteccia prefrontale di un embrione di ratto ed è stato mantenuto in coltura per 5 giorni (A) o 27 giorni (B) . Continua attività del recettore NMDA è stato registrato con soluzioni pipette contenenti glutammato (1 mM) e glicina (0,1 mM), e anche CNQX (20 mM) e bicucullina (10 pM) per inibire AMPA e GABA recettori nativi, rispettivamente. L'attività è stata suscitato applicando +100 mV tttraverso la pipetta di registrazione. Red linea tratteggiata indica il livello corrente zero.

Discussion

Nel campo canale ionico, un area di ricerca è dedicata alla comprensione della sequenza di eventi che conduce al canale meccanismo di apertura o gating del canale. Per la maggior parte dei canali, questo processo è complesso e prevede diversi passaggi cinetici che non possono essere dedotti da un segnale multicanale macroscopico. Al contrario, gli esperimenti possono essere progettati in cui osservando la sequenza di eventi aperti / chiusi in record di singolo canale può produrre informazioni più dettagliate su gating meccanismi. Nei metodi qui descritti, il legame del ligando dominio che si trova esternamente posseduto da recettori NMDA consente minimamente invasive registrazioni di patch-clamp per essere eseguite in condizioni costanti. Questo protocollo può avere bisogno di essere adattate in modo da essere adatto per indagare altri canali ionici ligando gated seconda sia ligando e recettore proprietà.

Record di attività singolo canale forniscono due tipi di informazioni preziose. Primo,perché l'ampiezza della corrente unitaria può essere misurata direttamente, esperimenti possono essere progettati per acquisire informazioni sulle proprietà dei pori come conduttanza canale, permeabilità e selettività. In secondo luogo, perché la durata degli eventi di apertura e chiusura può essere misurata direttamente dal record, esperimenti possono essere progettati per ottenere informazioni sulla cinetica gating e quindi, fare inferenze sul meccanismo operativo del canale. Per entrambi i tipi di esperimenti, analisi statistica significativa richiede categorizzazione ciascun punto dalla traccia corrente a una classe conducibilità specifica. Presentato qui era uno di questi metodi di fare questo, in base alle segmentale k-means (SKM) algoritmo ^11, tuttavia, questo può essere realizzato da vari algoritmi più o meno sofisticati con mezza soglia, SCAN ^12, Baum-Welch, Viterbi, eccetera

Le registrazioni utilizzando la configurazione cell-attached sono potenti in quanto i canali ionici sono conservati nel biologicomembrane con ambienti intracellulari imperturbati. Per questo motivo, è fondamentale che opercoli sono adeguatamente formate e mantenute durante la registrazione per due scopi: 1) continuità sperimentale e 2) il mantenimento di un favorevole rapporto segnale-rumore (rumore tra un picco basale <2 pA). La dimensione e la forma della punta della pipetta generato determina la probabilità di un sigillo a membrana successo contenente esattamente un canale. Una punta piatta assicura che quando la pipetta si avvicina alla cella toccherà e premere sulla membrana cellulare con l'intera superficie della punta contemporaneamente, contribuendo a sigillare uniformemente sulla cella. Una pipetta con una punta che è troppo larga sarà meno suscettibile di provocare macchie unico canale; in contrasto, tirando su una pipetta con una punta che è troppo stretta si tradurrà in una membrana anello a forma di omega che può sigillare alla base e intasare la pipetta ^10.

Un segnale favorevole al rumore può essere gestito minimizzando fonti di elettricarumore. La funzione di raffreddamento headstage sul Axopatch 200B ha permesso per la risoluzione ottimale del segnale; tuttavia rumore può ancora essere prodotte con la strumentazione coinvolta nella elettrofisiologia istituito, così come sorgenti esterne come la luce e l'elettronica indipendenti. Fortunatamente, diverse strategie possono essere implementate per ridurre il rumore ad un livello desiderato ^{2, 27.} In breve, assicurarsi che i pezzi di apparecchiature che sono in grado di produrre rumore siano messi a terra in un unico punto all'interno del setup. Nel fare questo, è importante prevenire la formazione di anelli di massa che causerà rumore significativo. Inoltre, se il 60 il rumore ciclo è presente, assicurarsi di spegnere tutte le luci che possono interferire con il segnale di registrazione. Infine, ponendo una gabbia di Faraday intorno l'apparecchio di registrazione impedirà ostacoli nelle vicinanze di causare disturbi elettrici.

Osservando un canale per un lungo periodo di tempo ha dimostrato che gatingcambiamenti conformazionali possono verificarsi in un ampio intervallo di scale temporali. Temporalmente dati patch-clamp sono limitate alla fine 'breve' dalla larghezza di banda dell'amplificatore e la velocità con cui il segnale amplificato viene digitalizzato e alla fine 'lungo' dalla finestra di osservazione. Per i cambiamenti conformazionali che sono più veloce del limite basso, registrazioni di patch-clamp in grado di offrire solo informazioni quando accoppiato con approcci sperimentali complementari. Per cambiamenti conformazionali che si verificano con tempi molto lenti, e quindi vengono campionati rado, si può aumentare il numero di osservazioni o aumentare la durata del disco, tuttavia, puo 'non essere sempre possibile.

Nonostante questi limiti, i dati di patch-clamp, soprattutto quando ottenuti da un singolo canale, spesso contengono più informazioni di quelle immediatamente estraibile con metodologie di calcolo attuali. Così, l'aspettativa è che i futuri aumenti di capacità di calcolo e nella Sophistication di algoritmi di analisi renderà possibili applicazioni aggiuntive. Dopo l'avvento di tali anticipi, è prevedibile che le registrazioni di patch-clamp da singoli canali possono essere in grado di verificarsi in concomitanza con le misure di FRET, immagini di calcio o anche in preparazioni vivo per fornire ulteriori informazioni sulla struttura, funzione e le dinamiche dei canali ionici in entrambi gli ambienti nativi e controllati.

Come la diversità dei canali ionici indagato aumenta, comprensione dettagliata dei loro meccanismi di gating e, infine, capire come il loro funzionamento contribuisce alla loro funzioni biologiche uniche potranno beneficiare di osservazioni di singola molecola. In particolare, i dati ottenuti con un canale patch-clamp promessa di informare sulle proprietà di conduttanza unitari e le sequenze di gating per i canali ricombinanti e nativi.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1