一チャネルセル付パッチクランプ法

Summary

ここで説明するには、セルに接続されたパッチクランプ技術を用いて1イオンチャネルから現在の記録の長いストレッチを取得するための手順です。この方法は、リアルタイムで、観察するための生体信号の基礎となる開閉チャネルコンフォメーションのパターンを可能にする。これらのデータは、邪魔されずに生体膜におけるチャネルのプロパティをお知らせ。

Abstract

イオンチャネルタンパク質は、生体膜を通過高速通信用の汎用デバイスである。それらが生成するイオン流束の時間的なシグネチャは、各チャネルタンパク質ならびにその生成および制御される機構の固有の性質に依存しており、現在の研究の重要な領域を表す。イオンチャネルタンパク質の操作動力学に関する情報は、単一の分子によって生成される電流の長いストレッチを観察することによって得ることができる。リガンド依存性イオンチャネル、NMDA受容体に対する1チャネルセル付きパッチクランプ電流記録を取得するためのプロトコルがここに記載され、皮質ニューロンでHEK293細胞においてネイティブまたは異種発現。また、機械刺激感受性チャネルPIEZO1の例を提示することによって、関心のある他のイオンチャネルにメソッドを適応させる方法についても提供される。この方法は、チャネルのコンダクタンス特性とOPEの時系列に関するデータを提供することができますこのように健康と病気にそれらの機能を理解するために貢献し、チャネルの活性化機構を構成しているN-クローズコンフォメーション。

Introduction

生体膜を横切る高速通信は、一般にチャネルと呼ば膜タンパク質を形成するオリゴマーの細孔にほぼ排他的に依存している。これらのタンパク質は、活性化信号、ゲーティングメカニズム、コンダクタンス特性において大きく異なっている。細孔がイオンに対して選択的であるチャネルタンパク質をイオンチャネルとして分類される;それらの活性化は、膜を横切るイオン電流を生成し、その応答は、電気生理学的技術を使用して、即座に高解像度で記録することができる。活性化信号は、濃度勾配、機械的および電気的な力、および温度などの化学的および物理的入力の幅広いまたがる。従って、さらなるゲートさリガンドへのイオンチャネルを分類する機械受容電圧は、ゲート、または敏感型を加熱する。この記事では、プロトコルは、パッチクランプ技術を用いて、リガンド依存性チャネル、NMDA受容体、および機械受容チャネル​​、PIEZO1から1チャンネル活性を記録するために記載されている。0;

パッチクランプ電気生理学は、単一分子^1,2の観察を可能にするのに十分な感度最初の最も広く使用された実験方法である。この優れた感度に加えて、それは非常に電気生理学的記録に従う生物学的製剤を拡大しており、また、無傷の膜におけるイオンチャネルの観察を可能にした。電圧クランプと電流の記録の両方が同じ電極を用いて達成されているので、まず、小さな細胞または膜パッチを横切って信号を記録するために使用することができる。技術は、イオンチャンネルがカエルの筋肉、ウナギelectroplaques、またはイカ巨大軸索^3,4の興奮性膜に限定されないことが明らかになったのではなく、それらは、膜貫通シグナル伝達機構のユビキタス器具を表し、単方向または全ての細胞膜の種類に固有であること多細胞生物、また細胞内膜へ。インポートantly、単に無傷の細胞にガラスピペットを取り付けることにより、貫通電流を記録する機能は、ネイティブ破壊されていない膜内のイオンチャネルからの活動を記録するために前例のない機会を提供した。したがって、このプロトコルに記載されているセル取り付けパッチクランプ技術は、数十分又はそれらの天然の環境においてより長い連続イオンチャネルの活性をモニター可能にする。

通常の熱揺らぎの下では、イオンチャネルタンパク質を含む全てのタンパク質は、側鎖の動きと全体の再配置によって表される非常に遅く、あまり頻繁に変更することによって最も可能性の高い表現最速かつ最も頻繁に再編成に、幅広い時間スケールにわたる構造的な変化を受けるドメインまたはサブユニット、または翻訳後修飾またはタンパク質-タンパク質相互作用^5,6によっていくつかの場合において。 1分子によって生成された活動の長い期間を観察すると、機能を理解するのに役立ちます完全な生理的膜におけるイオンチャネルのtionalダイナミクスと観測され、分子の動作メカニズムについての貴重な情報を提供します。

細胞型および発生段階を横切るイオンチャネルの多様性の増加理解とは対照的に、天然の膜におけるイオンチャネルの分子組成についての知識は、依然として限られている。すべてのイオンチャネルは、多量体タンパク質であり、天然イオンチャネルの大部分は、多くの場合、多様なコンダクタンスとゲーティング特性を伴う広い分子多様性のタンパク質を産生するサブユニットのいくつかのタイプから組み立てる。このため、規定された分子組成物のイオンチャネルは、異種系での発現の際に検討されている。具体的には、不死化したヒト胚性腎細胞のクローンライン⁷であるHEK293細胞は、組換え型イオンチャネルの異種発現のための好適なシステムとして広く受け入れを得た。男の中イオンチャネルの電気生理学のための選択シス​​テムは、培養の容易さと低価格であり、長寿命、安定した培養物を維持するように、哺乳動物タンパク質の翻訳後フォールディング、プロセシングおよび輸送を行う能力をHEK293細胞を上昇yの利点は、多くの場合、その低レベルまたは対象^7、8のチャネルのための内因性発現のさえない状態。組換えイオンチャネルを発現し、HEK293細胞におけるそれらの機能的特性を研究することは構造 - 機能イオンチャネルの特性ならびにイオンチャネルアイソフォームおよび天然組織におけるそれらの役割の特定のプロパティに関する情報を取得する価値のあるアプローチであり続けている。この資料に記載されているプロトコルは、HEK293細胞において発現された組換えイオンチャネルおよび天然イオンチャネルにも同様に適用することができる。

要約すると、その前例のない能力を介してパッチクランプ技術は、信号を解決するために一つの分子からのsは、今日まで、単一分子の挙動を観察するための最も直接的な方法のままである。その細胞結合型モードでは、パッチクランプ記録は、一分子のために行わ、長い観察期間を可能にするイオンチャネルの動作中に例外的な洞察を提供することができる。以下に一つのイオンチャネルタンパク質を含む細胞取り付けパッチから高分解能電流記録を取得するためのプロトコルが提供される。

Protocol

1。細胞培養およびタンパク質発現

1. HEK293細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充したDMEM中で単層培養中で、ATCCにより行わ通路を含み、通路22と40との間（ATCC番号CRL-1573）、および5％CO ₂で1％ペニシリン/ストレプトマイシン混合物を維持する37℃実験の間、10mlの最終体積の5〜20倍希釈でT25フラスコに継代細胞。注：これらの通路の間に細胞を使用することで、最適なシール形成及びパッチの安定性を可能にする、良好な細胞の健康を保証します。
2. トランスフェクションのために、皿当たり細胞懸濁液を〜0.5〜0.6ミリリットルに相当〜10 ⁵細胞/皿の密度で35mmディッシュにHEK293細胞をプレート18〜24時間、2ミリリットル培地中で細胞を増殖させる。
3. 無菌1.5ミリリットル遠心管では、（この順序で）追加することにより、4 35mmディッシュ用のトランスフェクション混合物を準備し、それぞれのcDNA（GluN1、GluN2A、およびGFP）の（1）1μgのを。 （2）315μlを蒸留水（のddH ₂ O）; （3）42mMの350μlの4 - （2 -ヒドロキシエチル）-1 -ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）、沈殿物を形成するために使用されている通り2.5 M CaCl _2を降下、（4）35μLを。
4. 5秒間ボルテックスチューブと4 35mm皿のそれぞれにトランスフェクション懸濁液​​175μLを加え、今50から60パーセントの集密度で細胞を含有し、2時間37℃で細胞をインキュベートした、前日に播種した。
5. トランスフェクション培地を吸引除去オフは、PBSで洗浄し、NMDA受容体媒介興奮毒性^9を防止するために2mMのMgCl ₂を補充した増殖培地2mlと交換してください。注：細胞は電気生理学的記録の24〜48時間後、トランスフェクションのために使用することができる。

2。電極の準備

1. 垂直プラーとホウケイ酸ガラス管を引くことによって2対称記録ピペットを生成します。その結果、チップの大きさや形状に基づいて、さらに形状ピペット研磨機を使用して。注：先端サイズを視覚的かつ電気的に評価することができる。視覚的には、外径が1.4から5.6程度の範囲でなければならない。電気的には、細胞外液で満たされた、最適なサイズのチップは、（ 図2B参照 ）12月24日MΩの範囲の抵抗を生成する必要があります。
2. セル添付の実験のために、最大のチャネル活性と高い電流振幅を生成する細胞外環境を表しピペット溶液を使用してください。注：（NMDA受容体の場合、これは、アゴニスト（グルタミン酸およびグリシン）の飽和濃度を含有する溶液に対応する二価の陽イオン性阻害剤および遮断剤をキレート1mMのEDTA、及び唯一つの透過イオンとしてナトリウム（150ミリモル）の生理的濃度を有するmM単位：1グルタミン酸、0.1グリシン、1N NaOHでpHを8.0に緩衝さ150のNaCl、2.5 KClを、1 EDTA、および10 HEPBS、）。

3。セルに接続されたパッチクランプ法

1. オープンQUBデータ取得ソフト制（www.qub.buffalo.edu）RE、および「レイアウト」の下で取得ウィンドウを選択します。 「ファイル」と題し、ドロップダウンメニューの下に「新しいデータ」をクリックして新しいQUBデータファイル（QDF）を開き、次の初期パラメータに入力します。サンプリングレート、40 kHzと; A / Dスケーリング、3,000;出力チャネル、1;とA / Dデータサイズ、2は、データファイルを右クリックして[プロパティ]を選択し、「データ」タブをクリックすることで、0.1V / PAに振幅スケーリングを調整します。注意：これらのパラメータは、セルに接続されたモードでモデル細胞を用いて、各セットアップのために改良することができる。 QUBソフトウェアとQDF特性を備えたデータ収集に関する追加指示がwww.qub.buffalo.eduでオンラインになっている。
2. 細胞を発現するイオンチャネルを含有する35mmディッシュを選択して、カルシウム及びマグネシウムを含有する2mlのPBSに成長培地を交換し;顕微鏡のステージ上に料理をマウントして、細胞が健康で、よくお皿に付着していることを評価するために、位相差顕微鏡を使用してセルラーフィールドに焦点を当てる単層のファッション（ 図1A）であった。トランスフェクションは（ 図1B）成功したことを確認するために蛍光検出に切り替えます。注：蛍光強度の範囲は、タンパク質発現の粗尺度として用いることができる。
3. 単一チャネルの記録のために、×10、アンプ出力ゲイン= 1βに対するパッチ構成、10 kHzのアナログフィルタ、クランプを電圧モードに設定し、100 mVの電圧を適用した。電圧がOFFの位置にコマンドを保持して、「シールテスト」ボタンを選択します。
4. 蛍光と細胞の健康に基づいて、パッチを適用するセルを選択します。細胞がウェルディッシュに接続されていることを位相コントラスト下で確認し、パッチ適用のために露出細胞表面の大部分を有し、他の点では健康に見える。注意：アプローチとパッチクランプの間に細胞を漂白避けるために、位相差照明を維持します。
5. それはelectrodに接触するようにちょうど足りるだけの水でたての研磨ピペットを埋めるE、ゆっくり振る先端に捕捉された気泡を取り除くために。ピペットホルダーのシールねじを締めると銀線をピペット溶液に浸漬されることを確認することで、アンプのヘッドステージ上に記録ピペットを固定します。
6. チュービングによりピペットホルダに接続されている小（5ccの）プラスチックシリンジを用いて、穏やかなアプローチ（ 図2A）の間にチップを入力し、目詰まりを防止するために、不純物の正の圧力を加える。
7. マイクロマニピュレーターを用いて、浴中にピペットを指示し、電気回路を開閉する ​​（ 図1C）をパッチするために選択したセルの上に直接配置します。アンプのシールテスト信号（ 図2B）に対応した矩形波を示す必要があり、これをオシロスコープに注意してください。注意：お風呂に入ると、最適な範囲内でピペット抵抗は、12月24日MΩです。 5 mVの試験信号は、測定された電流rをANGEは、〜20〜40 PAに対応している。
8. オシロスコープで電気顕微鏡ピペット抵抗を介して視覚的にピペットの位置を監視しながら、ピペットは、細胞を軽く当たるまで、少しずつアプローチを続け、テスト信号が増加した抵抗（ 図2B）を示すために、わずかに減少します。
9. 、シールを形成する注射器を手に取り、記録ピペットの先端に細胞膜を引っ張り、GΩ抵抗シール¹⁰の形成を開始シリンジプランジャを引いて、横方向のチューブを通して若干の負圧を適用する。シール形成が見えるだけの容量トランジェント（ 図2B）で、その完全な平坦で示されているオシロスコープでテスト信号波形に注意してください。注：信号が完全にフラット化しない場合、またはベースラインにノイズになると、これはシールの周りにかなりの電流リークと弱シールを示している。これはRを防ぐことができます1チャネル電流をesolving。この場合は、セルからピペットを撤回し、離れてお風呂から、ヘッドステージから削除し、それを廃棄します。適正な範囲（≥1GΩ）にシールを得るまでたて研磨ピペットを用いて処理を繰り返します。
10. アンプに、「オフ」に「シール·テスト」から外部コマンドトグルを切り替える。 （「オフ」にあらかじめ設定された）正にコマンドを保持して電圧を切り替える。およびX100にゲインを上げる。存在する場合、以前にフラットベースライン（ 図2C）からの方形上向き振れとして表示されますが、チャネル活性のためのオシロスコープを、観察します。
11. チャネル活性をオシロスコープに表示されている場合は、「録画」ボタンが続く「プレイ」ボタンを押すことで、QUBで以前に開かれたデジタルファイルにデータを取得する。 、データの取得を停止QUBに停止ボタンを押して簡単にretrievにQDFファイルを保存するには「ファイル」と題し、ドロップダウンメニューで[名前を付けて保存データを保存...」を選択することにより、コンピュータのハードドライブ上のことができる場所。

4。データの前処理や理想化

注：重要情報（最も簡単な場合には、閉じているか開いて）適切な伝導度クラスに、各データ点を割り当てる統計分析により、単一チャネル記録から抽出することができる。このプロセスは、データの理想化と分節K手段（SKM）QUBのメソッド^11を以下に説明されているとのデータ理想の簡単な説明と呼ばれている。

1. QUB内のデータファイルを開き、「レイアウト」の下の「前」のインターフェイスの現在のトレースを表示。というボックスオフにして（デジタルフィルタを削除します）フィルタリングされていない記録されたファイルを表示する」のFcを。 '
2. 視覚的に凹凸や成果物（ 図4A）を発見するレコードをスキャンしてください。そのoccu正しい短時間の電流スパイクRトレース内で、同じコンダクタンスクラスの隣接するクリーンな領域を選択する、この領域をハイライトして右クリックして選択することで（ 図4A） 'を設定、消去バッファを。'個々のサンプル·ポイントが表示されるまでのスパイクにズームイン、交換する地域を選択して、この領域のみとし、右クリックして「消去」を強調することで消去する。
3. ベースラインが安定しているレコードの初期の部分を選択することで、レコード全体のためにゼロ電流のベースラインを定義して、ハイライトして右クリックし、「設定のベースライン]を選択します。正確に表示されるガイドラインは、（ 図4Bの紫）ベースラインレベルを表していることを確認します。
4. 生データのベースラインが設定されたベースラインから目に見えて外れたレコード内のポイントを特定します。逸脱した領域内のベースラインの小さなセクションを選択することにより、これを修正し、右クリックして「ベースライン·ノードを追加」コマンドを選択します。
5. Tの領域を識別彼は簡単に（ 図4C）を補正することができない過剰ノイズやアーチファクトを含む記録。破棄されるべき領域をハイライト表示し、右クリックして選択し「削除してください。 '注：この場合、運動の情報が失われます。処理されたレコードが短くなり、接続点の後に発生するポイントは、事前にノイズ領域に連続して表示されます。
6. SKMアルゴリズム^11を使用してレコードを理想化するには、オープンとクローズの両方のイベントを含むトレースの一部を強調表示し、下の「モッズ」インターフェースに入力'レイアウト。' 「モデル」パネルで、黒四角（閉じた状態）を右クリックして、「グラブ」を選択し、ファイル全体のベースラインを表している微量のきれいな部分を強調表示します。オープンコンダクタンスを強調することによってチャネル開口部のために同じことをする、右「モデル」パネルで、赤い四角をクリックして、「グラブ」を選択します。
7. idealizaを実行下の「ファイル」ボタンを選択して、レコード全体のためのTiON「データソース」。分析用に必要なパラメータが正しいことを確認し、[]をクリックする「モデル」セクションの下に「理想化」タブを右クリックして「ファイル名を指定して実行。 '理想化の結果は、ファイル全体に対する振幅ヒストグラムと一緒に、理想の目視検査（ 図5）を可能にするデータと重ねられる。注意：不適切な理想化はQUBが実際に発生していないチャネル開口部とクロージャを検出する「偽のイベント、 'の発生につながる可能性があります。アンプのアナログフィルタとサンプリングレートによって設定された記録解像度内では、SKMの開閉イベントを検出すると解像度が分析のためデッドタイムを設定することによって制御することができる。最適なデッドタイムは、試行錯誤によって選択する必要があり、サンプリング·レートに依存しますが、経験則である2〜3のサンプル¹²でデッドタイムを選択します。
8. 理想化が正確に生データを表していることを確認するには、手動で理​​想化トレースをスキャンします。理想の誤差の同定に、偽のイベントの上にトレースをハイライト、右クリックし、「IDLに参加してください。 '注意：追加のオプションやQUBにおける様々なコマンドおよび機能の詳細な説明については、QUBマニュアルオンライン（www.qub.buffalo.edu）を参照してください。

Representative Results

組換えNMDA受容体

NMDA受容体は、結合して、2コアゴニストの同時動作に対応：グルタミン酸およびグリシン。彼らはGluN1サブユニットとGluN2サブユニットを結合2グルタミン酸結合2グリシンのヘテロ四として組み立てる。 GluN2サブユニットは、4つの遺伝子（A〜D）でエンコードされており、これらの脳の中で最も広く、転写形式はGluN2A少年動物で大人とGluN2Bである。なぜなら（ 図1A）サブユニット組成の制御、並びに微細研磨したガラスピペット（ 図1C）を用いてチャネルからの電流を記録する機能を可能にするHEK293細胞において受容体を発現する天然の調製物中のNMDA受容体サブタイプの多様性。

ピペットが細胞に接触した後、試験パルス波形の振幅の明らかな減少が、シールを形成する能力を示す（ 図2B）が発生する。一つを含む十分なシールチャネルは、正の電圧（ 図2C）が印加されると対ノイズ比の良い信号が、ベースラインから下方に偏向として表示されるクリアチャネル活性を、生成する。両方のアゴニストは、高濃度で存在する場合、野生型組換えNMDA受容体を達成することができ、インヒビターおよびチャンネル遮断薬が存在しない場合の最大チャネル活動。パッチが複数のチャネルを含む場合、同時開口部^13（ 図3B）は直ちに明らかであるようにするために、理想的である。チャネル開口確率が既知であるか^、14を近似することができる場合に、非常に低い活性レベルを有するタンパク質については、1つのレベル開口のストレッチが1つのチャネルから生じる確率を計算することができる。このため、より長い観察期間が必要であり得る。

これらの条件下で、及び（-120 mVでのおおよその膜電位につながる）+100 mVでのピペット保持電位を印加し、済州ngle組換えGluN1/GluN2AとGluN1/GluN2Bは1比較的高いコンダクタンスレベル（> 50 PS）（ 図3Aおよび図^5B）15〜17と高い確率（P o _を 、0.3〜0.5）で開かれている。記録時には、電流ノイズスパイク、ベースラインドリフト、又は過度のノイズの周期は（ 図4A-C）が現れることが簡潔とマイナー場合、しかしながら上述したように、これらを補正することができる。これは、チャネル活性はチャネル動作の全容が取り込まれることを保証するのに十分な時間（≥10分間、10,000事象）のために中断のない記録されていることが重要である。

このような記録から得られたデータは、チャネル動態および透過特性の両方に情報を提供することができる。ここでは、しかしながら、データは、理想化、例えばPCLAMPなどの他のソフトウェアプログラムを使用して実施または^12をスキャンすることができる、SKMアルゴリズム（ 図5A）を用いてQUBによって実行理想化を実証番目は、独自の長所と短所を含有するこれらのオプションの各々と、そのようなハーフ閾値法として、異なるアルゴリズム又は基準を使用して行うことができる。動力学モデルにこれらのデータのフィッティングは、イオンチャネルの挙動へのさらなる洞察を得るために行われてもよい。最尤フィッティングは、各プログラムが実装されたアルゴリズムは、独自の利点を有している、例えば、QUB又はHJCFIT ¹⁸などのソフトウェアを用いて行うことができる。理想にのみ実行されるように1閉じた状態の最も単純なモデルと1オープン状態を必要とする。図5に示されているが、イオンチャネルの完全な動力学モデルをフィッティングすると、特定の基準に到達するまで順次クローズとオープンの状態を追加する必要があります。このプロセスは、野生型GluN1/GluN2A受容体は、5つの異なる動力学的に閉状態と三時五十八動力学的に別個の開放状態（ 図5C）を有すること^を実証した¹⁹ここで、これらのゲーティング特性は、NMDA受容体媒介シナプス信号^20,21の形状を決定するために重要である。分析のこのスタイルは、独自の個別のゲーティング機構^22,23,24への洞察を得るために、例えば、AMPA受容体のような小さなコンダクタンスの他のイオンチャネルに拡張することができる。 AMPA受容体は、複数のコンダクタンスレベルを持っているので、一つの注意点は、QUBを使用して成功した理想化が構築済みのモデルに組み込まれている追加の状態を必要とするかもしれない、しかし、である。

これらの方法は、透過イオン組成および/または濃度を変えることにより、イオンチャネル浸透コンダクタンスについての情報を得るように拡張することができる。ここに記載される方法を用いて、単一のGluN1/GluN2A受容体を介して活動を記録するが、記録ピペットで75のCaCl ₂と150のNaClを交換、コンダクタンス（〜10 PS）の約20％の電流が得られます。これはしばらくの間、カルシウムがHiでNMDA受容体に浸透することを実証している生理的条件下でのGHレベルは、実際に透過経路内の潜在的カルシウム結合部位が存在し得ることを示す、よりゆっくりとナトリウムイオンよりもチャネルを横断する。さらに、この小さなコンダクタンスにもかかわらず、記録が十分にメインコンダクタンスレベルの電流振幅（ 図6AおよびB）は約50％である中間体サブレベルコンダクタンスの存在を発表、QUBにSKMアルゴリズムを用いて理想化することができる。追加のコンダクタンスクラスは初期運動モデルに組み込まれると、これらのサブレベル開口部は、しかし、唯一のQUBに理想化することができる。さらに動態分析は、これらの条件下で、受容体は依然としてしかしながら、これらの状態は、チャネルがナトリウムイオンのみ（ 図6C）を通過するときに比べて非常に異なる時定数と占有率を有する5つの動力学的に別個の閉状態を示す、ことを明らかにした。さらに、2つだけ開いた状態がuで観察されるチャネルコンダクタンスに影響を及ぼすことに加えて、カルシウムイオンが受容体ゲーティングを調節することができる、ことを実証し、これらの条件NDER。

唯一の1チャンネルのパッチを入手する全く特定の方法はありません。その代わりに、いくつかの実験操作は、成功の可能性を高めることに寄与することができる。まず、トランスフェクトされた細胞（ 図1B）の蛍光強度を評価することによって、チャネル低レベルの発現を目指す。 ; GluN1そのままcDNAの総量は、必要なサブユニットのcDNAの量を減少させるために、トランスフェクションのために使用増減：成功したアプローチがあってよいDNA /リン酸カルシウム沈殿物とのインキュベーションの時間を短縮すること;そして視野からだけぼんやりと蛍光細胞へのパッチ適用を選択した。得られたパッチは頻繁に複数のチャネルが含まれている場合、これらのアプローチは、追求されるべき。また、ピペットチップのサイズを小さくすることもPATCに1つのチャネルのみ捕捉に寄与することができるH。しかしながら最終的には、一方が系統的に明らかに複数のチャネルを含んでいて、パッチからの長時間記録を控えることによって1チャンネルのパッチを得ることに成功した。

組換えPIEZO1チャンネル

このプロトコルに記載された方法は、容易に任意のリガンド依存性イオンチャネルに適用することができ、実際の化学物質、電圧、力、温度、または他の手段によって活性化さどうか、任意のイオンチャネルから一つのチャネル活動を記録するように構成することができる。このプロトコルは他のイオンチャネルから一つのチャネル電流を記録するように適合させることができる方法の一例は、具体的には、マウスPIEZO1、機械受容イオンチャネルは、（ 図^7）25、26の下方に提示される。

NMDA受容体チャネルを有するように、PIEZO1およびGFPは、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、および細胞によるHEK293細胞で発現される24〜48時間後にトランスフェクションに使用されセクション1.2で説明。 PIEZO1が膜ストレッチによって活性化されるため、注意がパッチ形成時に優しく膜を操作するために取られるべきであり、適用される機械的な力の配信と管理のための適切なデバイスが利用可能であるべきである。これらの条件は、2〜3MΩの範囲で抵抗が大きく、記録ピペットを作製し、増幅ヘッドステージ上にピペットホルダを介して記録ピペットに接続された高速高圧クランプ装置（HSPC）を使用することによって達成することができる。増幅器の設定は、増幅器が入手ソフトウェアを介して制御できるように「外部」コマンド·ノブを切り換えるを除いて、3.3節のNMDA受容体について記載したものと同様である。

130のNaCl、5のKCl、10 HEPES、1のCaCl _2、1のMgCl _2、10 TEA-Clで、NaOHでpHを7.3：PIEZO1からレコードの活性のために、（単位：mm）で満たされた記録ピペットを使用しています。これらの条件下では、開口部は、iとモニターすることができるゼロ電流のベースラインから下振れなど、オシロスコープに表示されますnwardナトリウム電流、。アンプヘッドステージに記録ピペットを置き、HSPCのダイヤルがゼロであることを確認してください。お風呂に入る前に、正圧の3-5 mmHgのを適用します。マイクロマニピュレーターを用いて、浴中にピペットを下げ、希望のピペット抵抗をチェックし、3.6節で説明したように、選択したセルのすぐ近くにピペットをもたらす。優しく顕微鏡指導の下でセルをタッチし、NMDA受容体（セクション3.7）のために行われたようにオシロスコープを監視することにより、同様にシールテスト波形の振幅のわずかな減少を観察します。迅速3-5〜0 mmHgの圧力保持レベルを変化させることによりピペットを介して印加された正の圧力を解放する。シールテスト波形を監視することにより形成するために、GΩシールを待つ。この場合、負圧が、シールを形成するために適用されない。最適なシールは＆プレスを得られると＃8216;。データの取得を開始するQUBのレコード」ボタン7は、パッチピペットに圧力を-20 mmHgのを適用することによって活性化mPIEZO1シングルチャネル電流の代表的なトレースを示しています。これらの電流はローパス2 kHzでろ過し、20 kHzでサンプリングした。

細胞外リガンド結合ドメインとリガンド依存性チャネルとは対照的に、機械受容チャネル​​を活性化する刺激が2プロトコルの下で変化させることができる。最初は「ギャップのない、「一定の負圧が全体の録画時間のパッチに適用されている。このプロトコルは分の長時間録音を得るのに有用であり、膜の完全性を維持するより小さな圧力刺激（0から20 mmHgの）、最も成功している。膜を破裂する可能性がある高圧によって生成活性は、最高の変動する圧力パルスをより短い期間でパッチを適用することができる「エピソードの録音、（得られる<強い>図7）。リガンド依存性チャネルと同様に、セル結合した1個のチャンネルのパッチからの記録は、コンダクタンスと調査中のチャネルのゲーティング特性の両方に関する豊富な情報を提供しています。

神経細胞のNMDA受容体

細胞 - 結合した1チャンネル記録のためにここに記載される方法は、特定の細胞型および/または発育段階にコンダクタンスとチャネル内因性のゲーティング特性に関する情報を得るために使用することができる。他の多くのヘテロメリックチャンネルの場合と同様に、ネイティブのNMDA受容体の正確な分子組成は知られていない。天然の調製物から得られたものと知られている組成物の組換え受容体から得られた結果を比較することによって、サブユニット組成物およびそれらの天然の環境におけるチャネルの機能に処方または^17を試験することができる仮説に関する。

ニューロンは前頭前野から単離したラット胚の皮質、最大6週間¹⁷培養で増殖させる。セクション2.2における組換えNMDA受容記録のために記載された成分に加えて、ピペット溶液は、それぞれ、天然のAMPAおよびGABA受容体を阻害することCNQX（20μM）及びビククリン（10μM）を含有した。文化の年齢に応じて、ネイティブのNMDA受容体から得たレコードはかなり異なっていた動態を明らかにした。初期（ 図8（a）、in vitroで 5日間）からの記録文化より密接に遅い（ 図8B、in vitroで 27日間）からGluN1/GluN2B受容体と記録に記載され動力学に似ている文化がより密接GluN1/GluN2A受容体について記載され動態に似ている（ 図3Aおよび図5（a））。この観察は、NMDA受容体発現アイソフォームのパターンを有する股関節における細胞結合した1チャンネルのパッチから記録された電流の注意深い特徴付けと一致しているpocampal文化^16。

パネルAと同様の視野からの図1のセル装着された記録のためのHEK293細胞を選択する。35mmディッシュ中で培養A）HEK293細胞を、顕微鏡ステージ上に置き、40倍の倍率での位相コントラストで表示されている。B）GFP蛍光トランスフェクションされた細胞を識別します。矢印は、GFPを発現する細胞を示し、健康表示され、ピペットアクセス用の影響を受けやすい位置にある。C）記録ピペットを、視覚的指導の下で微動マニピュレーターを使用して、選択したセルに近接してもたらされる。 見るにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。

図2。携帯付属のシール形成。 A）ピペットホルダーの側に接続された小型の注射器、ピペット内の圧力を手動で制御することができる。B）を流れる電流は5mV（0.5 kHzの）にある増幅器試験に応答浴溶液に浸漬し、ピペットを介して18 PA、および28MΩのピペットサイズに対応します。細胞（左矢印）は、増大したピペット抵抗の指標で観察された電流が減少し、レベルをタッチする際に。ピペット（右矢印）を介して負圧を適用すると、シール形成を開始するだけの容量過渡試験パルスによって生成される信号を低減する。C）試験パルスをなし、かつ、電圧ピペット（0 V）を介して印加されていない場合には、ベースライン安定した（矢印の左側）である。正電圧（矢印、100 MV）のPRを適用チャネル開口部を示している確率論的ユニタリ電流をoduces。赤い点線はゼロ電流のベースラインを示している。

図3 GluN1/GluN2A受容体から記録された電流を添付Aセル）1チャンネルのパッチ：連続記録の50秒のセグメントは、単一の均一な振幅にチャネル開口部を示し、B）複数チャンネルのパッチ：連続記録の50秒のセグメントパッチは少なくとも2個の活性チャネルを含むことを示す2つの振幅レベルにチャネル開口を示している。赤い点線はゼロ電流のベースラインを示している。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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ノイズスパイクについては、図4のデータ処理であって、a）修正。手動でフィルタされていないと表示データは、ベースライン信号と外部からの信号（赤）を交換してください。拡大図は、（中央）の前と（下）の後にスパイクを示しているスパイク（赤）は、ベースラインドリフトを基準信号B）の補正と交換した。初期の記録では、ベースラインの小さなセグメントを選択し、レコード全体（パープルライン）のためのゼロ電流レベルとして設定します。の一部を選択して、正しいベースラインドリフトは、ベースライン（矢印）を漂流し、ベースラインノード（紫の円）を追加する。補正が困難であるノイズの多いベースライン（赤）を持つレコードのC）の長い期間を削除することができます。 表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。

図5。データ理想。A）電流トレース（黒）セル付パッチクランプ法でのみナトリウムイオンを通す1 GluN1/GluN2A受容体から記録した。理想化されたデータ点（赤色）を30秒間つのチャネルセグメントに関して示されている。これらは、理想化が正確であることを示す、十分にオーバーラップしている。、B）は 、現在の振幅のヒストグラムがよく、ゼロにピークを持つ唯一の2のガウス関数（0.02±0.8 PA）、クローズドチャネル事象を示すと10.3±1.3でで記述された分布を示している全記録時間（130分）のオープンチャネルのイベントは1種類のみを示すpAの。C）クローズ（左）と開いた（右）は（A）に示した全記録のための時間のヒストグラムを住む。 probabilヒストグラム（太線）および個々の運動成分（細線）がITY密度関数を重ねて五閉状態と3つのオープン状態を含むモデルにデータを当てはめることにより計算した。挿入図は、個々の運動成分毎に時定数（τ）との相対面積の（a）を提供する。

シングルNMDA受容体であって、a）電流トレース（黒）〜図6。カルシウム電流は、セルに接続されたパッチクランプ法でのみカルシウムイオンを通す1 GluN1/GluN2A受容体から記録した。理想化されたデータ点（赤）が30秒セグメントに対して示されている。電流振幅B）ヒストグラム0（ゼロでピークを有するウェル3のガウス関数によって記述される分布を示して±0.3 pA）で、近接の指標Dチャネルのイベント、1.3±0.4 pAの開水路事象を示すサブレベルコンダクタンス、および2.1±0.3、メインコンダクタンスレベルまで開水路事象を示す。C）クローズ（左）、メインコンダクタンスレベルのオープン状態（中央）とサブレベルコンダクタンス開状態（右）（A）に示す全体の記録のための時間ヒストグラム滞留。ヒストグラム（太線）および個々の運動成分（細線）の確率密度関数がオーバーレイされる五閉状態、二つの主要なコンダクタンスレベルのオープン状態つ下位レベルのコンダクタンス開状態を含むモデルにデータを当てはめることにより計算した。挿入図は、個々の運動成分毎に時定数（τ）との相対面積の（a）を提供する。

図7。セルは、1つのチャネル記録を添付mPIEZO1からHEK293細胞において発現した活性は、電圧（+80 mVで）の一定の適用中に、パッチピペットを介してHSPC装置と-20 mmHgの圧力を適用することによって誘発される。赤い点線はゼロ電流レベルを示します。

図8。セルは、ネイティブのチャンネルから1チャンネル録音を添付。ピペットを5日間（A）または27日間（B）のために、ラットの胚の前頭前野から解離し、培養で維持されたニューロンの細胞体に取り付けられた。連続的なNMDA受容体活性は、それぞれ、天然のAMPAおよびGABA受容体を阻害するためにピペットグルタミン酸（1 mM）およびグリシン（0.1ミリモル）を含む溶液とともに、CNQX（20μM）及びビククリン（10μM）で記録した。活動は、100 mVのTを適用することにより誘発された記録ピペットhrough。赤い点線はゼロ電流レベルを示します。

Discussion

イオンチャネルフィールドで、研究の重要な領域は、開口部またはチャネルのゲート機構をチャネルにつながるイベントのシーケンスを理解するに捧げられています。ほとんどのチャネルの場合、このプロセスは複雑であり、巨視的なマルチチャネル信号から推定することができないいくつかの動力学的工程を含む。対照的に、実験は、単一チャネル記録内のオープン/クローズイベントのシーケンスを観察する機構をゲーティングに関するより詳細な情報を得ることができる場所に設計することができる。ここに記載される方法において、NMDA受容体が有する外部に配置リガンド結合ドメインは、一定の条件下で実施される最小侵襲性パッチクランプ記録を可能にする。このプロトコルは、リガンドと受容特性の両方に依存する他のリガンド依存性イオンチャネルを調査するのに適しているために適合される必要があり得る。

単一チャネル活性のレコードは、貴重な情報の2種類を提供する。まず、単一の電流振幅を直接測定することができるので、実験は、そのようなチャネルコンダクタンス、透過性及び選択性のような細孔特性についての情報を得るように設計することができる。第二に、開閉事象の持続時間はまた、レコードから直接測定することができるので、実験は、ゲーティングについての動力学的情報を得るように設計することができ、したがって、チャネルの動作機構に関する推論を行う。実験の両方のタイプの場合は、意味のある統計解析は、特定のコンダクタンスのクラスに現在のトレースから、個々のポイントをビニングが必要です。分節k平均^（SKM）11アルゴリズムを用いてこれを行う1つのそのような方法は、あったここに提示しかしながら、これはハーフ閾値^、12 SCANを含むいくつかの多かれ少なかれ洗練されたアルゴリズムによって達成することができる、バウム-ウェルチ、ビタビ、その他

セルに接続された構成を使用して録音、そのイオンチャネルに強力ですが、生物学的に保存されている非摂動細胞内的環境を有する膜。このため、膜シールが適切に2つの目的のために記録全体にわたって形成されて保存されることが重要である：1）実験の継続性および2）良好な信号対雑音比（ベースラインノイズ<2 pAのピーク·ツー·ピーク）を維持する。生成されたピペットチップのサイズおよび形状は、1つのチャネルを含有する膜シールの成功の確率を決定する。フラットチップは、ピペットを細胞に近づくと、それが細胞に均一に封止するために貢献し、全体を一度先端面との細胞膜上に触れ、押しことが保証されます。広すぎるとピペットチップは、一チャンネルのパッチをもたらす可能性が低いであろう;対照的に、狭すぎる先端をピペットを引く際にベースのシールやピペット^10を詰まらせることがあり、オメガ状の膜ループになります。

対雑音比が良好な信号は、電気の供給源を最小にすることによって管理することができるノイズ。たAxopatch 200B上のヘッドステージの冷却機能が最適な信号の解像度を可能にした。しかし、ノイズはまだ設定され、電気生理学に関与して計測器、ならびにこのような光と無関係の電子機器などの外部ソースのいずれかによって製造することができる。幸いなことに、いくつかの戦略は、所望のレベル^2、27ノイズを最小化するために実施することができる。簡単に説明すると、ノイズを生成することができる機器のピースがセットアップ内の一点に接地されていることを確認してください。これを行う場合には、大きなノイズの原因となる接地ループの形成を防止することが重要である。 60サイクルのノイズが存在する場合に加えて、記録信号に干渉する可能性のある照明をオフにしてください。最後に、記録装置の周りにファラデーケージを配置すると、電気的なノイズの原因から近くの支障を防ぐことができます。

長期間つのチャネルを観察すると、そのゲートを実証していコンホメーション変化は、時間スケールの広い範囲で発生することがあります。時間的に、パッチクランプデータは、増幅器の帯域幅は、増幅された信号はデジタル化され、観察窓による「長い」末端にある速度によって '短い'末端に制限される。補完的な実験的アプローチと組み合わせると下限よりも高速であるコンホメーション変化のために、パッチクランプ記録は情報のみを提供することができます。立体配座の非常に遅い速度で発生する変化、従ってまれにサンプリングされるために、一つは観測値の数を増やすか、記録の持続時間を増加させることができるが、これは必ずしも可能でないかもしれない。

これらの制限にもかかわらず、個々のチャネルから得られた、特にパッチクランプデータは、多くの場合、現在の計算方法論と、すぐに抽出可能なより多くの情報が含まれています。このように、期待があるという計算能力およびSOPH、将来増加解析アルゴリズムのisticationが可能な追加のアプリケーションを作成します。このような進歩の出現時に、単一チャネルからのパッチクランプ記録は、構造、機能およびイオンチャネルの動態に関するさらなる情報を提供するために、FRET測定、カルシウムイメージング、あるいはインビボ製剤中で同時に発生することがあり得ることが予測されネイティブと制御された環境の両方。

イオンチャネルの多様性は増大し、その開閉メカニズムの詳細な理解を調査し、最終的には、それらの動作が彼らのユニークな生物学的機能に貢献する方法を理解するように単一分子の観察の恩恵を受ける。具体的には、組換えおよびネイティブのチャンネルのための単位コンダクタンス特性とゲーティング·シーケンスをお知らせするために1チャンネルパッチクランプの約束で得られたデータ。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1