En kanal Cell-festet Patch-clamp opptak

Summary

Beskrevet her er en prosedyre for å få lange strekninger av dagens opptak fra en ionekanal med celle-festet patch-clamp teknikken. Denne metoden gjør det mulig for å observere, i sanntid, mønsteret av open-nære kanal konformasjoner som ligger til grunn for biologisk signal. Disse dataene informere om kanal eiendommer i uforstyrrede biologiske membraner.

Abstract

Ionekanal proteiner er universelle enheter for rask kommunikasjon på tvers av biologiske membraner. Den temporale signaturen til det ioniske flussmiddel de genererer avhenger egenskaper iboende i hver kanal protein så vel som den mekanismen som er den genererte og kontrollert og er et viktig område for dagens forskning. Informasjon om operasjons dynamikken i ionekanal proteiner kan bli oppnådd ved å observere lange strekninger av strøm som er produsert av et enkelt molekyl. Beskrevet her er en protokoll for å skaffe en-kanals celle-festet patch-clamp dagens opptak for en ligand gated ionekanal, NMDA-reseptoren, uttrykt heterologt i HEK293 celler eller direkte i kortikale nevroner. Også gitt er instruksjoner om hvordan du kan tilpasse metoden til andre ionekanaler av interesse ved å presentere eksempel på mekano-sensitive kanal PIEZO1. Denne metoden kan gi data om kanalens konduktans egenskaper og det timelige sekvens av open lukkede konformasjoner som utgjør kanalens aktiveringsmekanismen, og dermed bidra til å forstå deres funksjon i helse og sykdom.

Introduction

Rask kommunikasjon på tvers av biologiske membraner er avhengig nesten utelukkende på oligomeriske pore forming membran proteiner, ofte referert til som kanaler. Disse proteinene er stor forskjell i aktiveringssignaler, gating mekanismer, og konduktans egenskaper. Kanal proteiner som porene er selektiv for ioner er klassifisert som ionekanaler; aktivering deres produserer ioniske strømmer gjennom membranen, og deres svar kan tas opp med høy oppløsning i sanntid ved hjelp av elektrofysiologiske teknikker. Aktiveringssignaler spenner over et bredt spekter av kjemiske og fysiske innganger, inkludert konsentrasjons graderinger, mekaniske og elektriske krefter, og temperatur; derfor videre klassifisere ionekanaler inn ligand gated, mechanosensitive, spenning gated, eller varme sensitive typer. I denne artikkelen er protokoller som er beskrevet for å ta opp en-kanal-aktivitet fra en ligand gated kanal, NMDA-reseptor, og en mechanosensitive kanal, PIEZO1, ved hjelp av patch clamp-teknikk.0;

Patch-clamp elektrofysiologi er den første og mest brukte eksperimentelle metoden tilstrekkelig følsom til å tillate observasjon av enkle molekyler ^{1, 2.} I tillegg til dette utsøkte følsomhet, har det vesentlig utvidet de biologiske preparater mottakelig for elektrofysiologiske opptak og også har gjort observasjon av ionekanaler i intakte membraner. Først, fordi begge spenningsklem og strøm-opptak er oppnådd med den samme elektrode, kan den brukes til å registrere signalene over, små celler eller membraner lapper. Teknikken avdekket at ionekanaler ikke er begrenset til hissige membraner av frosk muskler, ål electroplaques, eller blekksprut gigantiske axons ^{3, 4,} men heller at de representerer stedsnærværende inventar av transmembrane signalmekanismer og er iboende i alle mobiltelefontyper membran av uni-eller flercellede organismer, og også til intracellulære membraner. Importantly, evnen til å ta opp transmembrane strømninger ved å feste et glass pipette til en intakt celle gitt enestående mulighet til å registrere aktivitet fra ionekanaler i sine opprinnelige uforstyrret membraner. Således cellen festet patch-clamp teknikk, som er beskrevet i denne protokollen, tillater overvåking av aktiviteten av ionekanaler kontinuerlig i flere titalls min eller lengre i sitt opprinnelige miljø.

Under normale termiske svingninger, alle proteiner, inkludert ionekanal proteiner, gjennomgå strukturelle endringer over en bred tidsskala, med de raskeste og mest hyppige rearrangementer representert mest sannsynlig ved side-kjeden bevegelser og mye langsommere, mindre hyppige endringer representert ved reposisjonering av hele domener eller underenhetene, eller i noen tilfeller via post translasjonsforskning endringer eller protein-protein interaksjoner ^{5, 6.} Observasjon av lange perioder med aktivitet som genereres av et molekyl kan hjelpe til å forstå den funknale dynamikken i ionekanaler i intakte fysiologiske membraner og gir verdifull informasjon om den operative mekanismen av molekylet observert.

I motsetning til den økende forståelse for mangfoldet av ionekanaler tvers celletyper og utviklingsstadier, kunnskap om den molekylære sammensetningen av ionekanaler i innfødte membraner er fortsatt begrenset. Alle ionekanaler er multimere proteiner og de fleste innfødte ionekanaler montere fra flere typer underenheter som produserer proteiner av bred molekylær mangfold, som ofte ledsaget med ulike konduktans og gating egenskaper. Av denne grunn er ionekanaler av definerte molekyl sammensetning undersøkt ved ekspresjon i heterologe systemer. Spesielt HEK293 celler, som er en klonal linje av udødeliggjorte humane embryonale nyreceller ^7, fått bred aksept som den foretrukne system for heterolog ekspresjon av rekombinante ionekanaler. Blant manneny fordeler som forhøyet HEK293 celler som valget system for ionekanal elektrofysiologi er den enkle og kostnader i dyrking og forvalte langvarige stabile kulturer, deres evne til å utføre post-translasjonell folding, foredling og handel av pattedyrproteiner, og i mange tilfeller , deres lave nivå eller fravær av endogen ekspresjon for kanalen i området ^{7, 8.} Uttrykke rekombinante ionekanaler og studere deres funksjonelle egenskaper i HEK293 celler fortsetter å være en verdifull tilnærming for å innhente informasjon om struktur-funksjon egenskaper ionekanaler samt spesifikke egenskaper ionekanal isoformer og deres roller i innfødte vev. De protokoller som er beskrevet i denne artikkelen, kan anvendes like godt for rekombinante ionekanaler uttrykt i HEK293-celler og til å opprinnelige ionekanaler.

I sammendrag, med patch-clamp teknikk, gjennom sin enestående kapasitet løse signals fra ett molekyl er fortsatt, til dags dato, den mest direkte metoden for å observere atferden til enkle molekyler. I sin celle-tilknyttet-modus, tillater patch-clamp-opptak lange observasjonsperioder som, når den gjøres i ett molekyl, kan gi utmerket innsikt i driften av ionekanaler. Nedenfor presenteres en protokoll for å oppnå høy oppløsning løpende opptak fra celle festet patcher som inneholder en ionekanal proteiner.

Protocol

En. Cell Culture and Protein Expression

1. Oppretthold HEK293-celler (ATCC nummer CRL-1573) mellom passasjene 22 og 40, som innbefatter passasjene er utført av ATCC i monolag-kultur i DMEM supplert med 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin blandingen ved 5% _CO2 og 37 ° C. Mellom forsøkene passasje celler i T25-kolber ved 5-20 gangers fortynning i et sluttvolum på 10 ml. Merk: Bruk av celler i løpet av disse passasjene garanterer gunstige celle helse som vil gi rom for optimal tetning dannelse og patch stabilitet.
2. For transfeksjon, plate HEK293-celler i 35 mm skåler i en tetthet på ~ 10 ⁵ celler / fatet, som svarer til ~ 0,5 til 0,6 ml av cellesuspensjonen pr fatet og dyrke cellene i 2 ml medium i 18-24 timer.
3. I et sterilt 1,5 ml sentrifugerør, forberede transfeksjon blandingen i fire 35 mm skåler ved tilsetning av (i denne rekkefølge): (1) 1 mikrogram av hver cDNA (GluN1, GluN2A og GFP); (2) 315 mL avdobbelt destillert vann (DDH ₂ O); (3) 350 pl av 42 mM 4 - (2-hydroksyetyl)-1-piperazin-etansulfonsyre (HEPES), og (4) 35 pl av 2,5 M CaCl ₂ dråpe vis, som brukes til å danne bunnfall.
4. Vortex rør i 5 sek og tilsett 175 ul av transfeksjon suspensjonen i hver av de fire 35 mm skåler belagt dagen før, som nå inneholder celler på 50-60% sammenløp og inkubere cellene ved 37 ° C i 2 timer.
5. Aspirer ved transfeksjon medium, vaskes med PBS og erstatte med 2 ml vekstmedium supplert med 2 mM MgCl ₂ for å forhindre NMDA-reseptor-mediert eksitotoksisitet ^9.. Merk: Cellene kan anvendes for elektrofysiologiske målinger 24-48 timers post-transfeksjon.

2. Elektrode Forberedelse

1. Generere to symmetriske opptaks pipetter ved å trekke på borsilikatglass rør med en vertikal avtrekker. Basert på størrelsen og geometrien av den resulterende spissen, ytterligere form pipetterved hjelp av en poleringsmaskin. Merk: Spissen størrelse kan vurderes visuelt og elektrisk. Visuelt, må den ytre diameteren være i 1,4 til 5,6 pm området. Elektrisk, en optimal størrelse spiss, når den er fylt med ekstracellulær løsning, skal produsere motstander i 12-24 MΩ området (se figur 2B).
2. Bruk en pipette-løsning, som for celle festet eksperimenter representerer den ekstracellulære miljø som vil gi maksimal kanalaktivitet og høy strøm amplituder. Merk: For NMDA reseptorer, tilsvarer dette en oppløsning som inneholder mettende konsentrasjoner av agonister (glutamat og glycin), 1 mM EDTA, som chelates toverdig kationiske inhibitorer og blokkere, og har fysiologiske konsentrasjoner av natrium (150 mM) som eneste permeant ion ( i mM: 1. glutamat, 0,1 glycin, 150 NaCl, 2,5 KCl, 1 EDTA og 10 HEPBS, bufret ved pH 8,0 med 1 N NaOH).

Tre. Cell-festet Patch-clamp opptak

1. Åpen QUB datainnsamling progrre (www.qub.buffalo.edu), og velg oppkjøpet vinduet under "oppsett". Åpne en ny QUB datafil (Qdf) ved å klikke på 'nye data "under rullegardinmenyen med tittelen" Fil "og skriv inn følgende startparametre: samplingsfrekvens, 40 kHz; A / D skalering, 3000; utgangskanal, en; og A / D datastørrelse, to. Juster amplitude skalering til 0,1 V / Pa ved å høyreklikke på datafilen, velge egenskaper, og klikke på fanen 'data'. Merk: Disse parametrene kan raffineres for hvert oppsett ved hjelp av en modell-celle i celle-festet modus. Ekstra undervisning på datainnsamling med QUB programvare og Qdf egenskaper er online på www.qub.buffalo.edu.
2. Velg en 35 mm skål med ionekanal uttrykker cellene og erstatte dyrkningsmedium med 2 ml PBS inneholdende kalsium og magnesium; montere parabolen på mikroskopet scenen og fokus på mobil feltet med fasekontrastmikroskopi for å evaluere at cellene er sunt og godt festet til paraboleni monolayer mote (figur 1A). Bytt til fluorescensdeteksjon å verifisere at transfeksjon var vellykket (Figur 1B). Merk: rekke fluorescensintensiteter kan brukes som et grovt mål på protein ekspresjon.
3. For enkelt kanal opptak, satt forsterkerutgangen gevinst til x10, patch konfigurasjonen til β = 1, analog filter til 10 kHz, modus til spenning-klemme og spenningen til 100 mV. Med spenning beholdning kommandoen i AV-posisjon, velg 'segl test "-knappen.
4. Basert på fluorescens og celle helse, velger en celle å lappe. Verifiserings henhold fasekontrast at cellen er godt festet til formen, har en stor del av celleoverflaten utsettes for lapping og ellers ser frisk. Merk: Oppretthold fase kontrast belysning for å unngå bleking cellen under innflyging og patch-klem.
5. Fyll en fersk polert pipette med akkurat nok løsning så den får kontakt med Electrode og ristes forsiktig for å fjerne luftbobler som måtte være fanget i spissen. Sikre innspillingen pipetten på forsterkeren heads ved å stramme tetningsskrue av pipetteholder og sørge for at den sølvtråd er nedsenket i pipetten løsning.
6. Ved hjelp av en liten (5 cc) plastsprøyte, som er koblet til pipetteholder av rør, anvende svakt positivt trykk for å forhindre urenheter fra å komme inn og tetter spissen under metode (figur 2A).
7. Ved hjelp av mikromanipulator, dirigere pipetten inn på badet og plassere den direkte over mobil valgt for patching (figur 1C), lukker den elektriske kretsen. Legg merke til oscilloskop, som skal indikere en rektangulær bølgeform som tilsvarer forsterkerens segl testsignal (figur 2B). Merk: Ved registrering i badekaret, pipetten motstand i det optimale området er 12-24 MΩ. For en 5 mV testsignal, den målte nåværende range tilsvarer ~ 20-40 pA.
8. Mens overvåking pipette stilling visuelt gjennom mikroskopet og pipette elektrisk motstand på oscilloskop, fortsetter den tilnærmingen i små trinn inntil pipetten impinges forsiktig på cellen, og testsignalet avtar litt for å indikere økt motstand (figur 2B).
9. For å danne en tetning, plukke opp i sprøyten og anvende svakt negativt trykk gjennom siderøret ved å trekke i sprøytestempelet, som trekker den cellulære membran inn i spissen av opptaks pipette og initierer dannelsen av et GΩ motstand tetning ^10.. Legg merke til testsignal bølgeform på oscilloskop, der segl formasjonen er angitt med sin komplette utflating, med bare kapasitive transienter synlige (figur 2B). Merk: Hvis signalet ikke flate helt eller grunnlinjen blir bråkete, indikerer dette en svak tetning med betydelig nåværende lekkasje rundt forseglingen. Dette vil hindre resolving en kanal strømninger. Hvis dette er tilfelle, trekke pipetten fra cellen og bort fra badekaret, ta den ut av hodet scenen og kast den. Gjenta prosessen med en fersk polert pipette til å skaffe en sel i tilstrekkelig utvalg (≥ 1 GΩ).
10. På forsterkeren, slå om ekstern kommando veksle fra «segl test 'til' off '; slå spenningen holder kommandoen til positiv (som tidligere var satt til "off"); og øke gevinsten til x100. Observer oscilloskop for aktiviteten på kanalen, som, hvis de finnes, vil bli vist som firkantede oppover nedbøyninger fra tidligere flat baseline (figur 2C).
11. Hvis aktiviteten på kanalen vises på oscilloskop, skaffe data til den tidligere åpnet digital fil i QUB, ved å trykke på "play"-knappen etterfulgt av "record"-knappen. Slik stopper du anskaffe data, trykk på stoppknappen i QUB, og lagre Qdf filen til en lett retrievstand plassering på harddisken ved å velge 'Lagre data som ...' i rullegardinmenyen med tittelen "File".

4. Dataforhåndsbehandling og Idealise

Merk: Viktig informasjon kan hentes ut fra enkeltkanal opptak av statistiske analyser som tildeler hvert datapunkt til en passende konduktans klasse (i det enkleste tilfellet, lukket eller åpen). Denne prosessen blir referert til som dataidealisering, og en kort beskrivelse av dataidealisering med segmental k anordningen (SKM) metode ¹¹ i QUB er beskrevet nedenfor.

1. Åpne datafil i QUB, og vise gjeldende spor i "Pre 'grensesnitt under" oppsett ". Vis den innspilte filen ufiltrert (fjern digitalt filter) ved å fjerne merket i boksen merket "Fc. '
2. Skanne visuelt posten å få øye på uregelmessigheter og gjenstander (Figur 4A). Riktig korte nåværende pigger som tjenestepensjonr innenfor spor (Figur 4A) ved å velge et tilstøtende ren regionen med samme ledningsevne klasse, fremhever denne regionen, høyreklikke og velge "sett slette buffer. ' Zoom inn på piggen før enkelte prøvepunktene er synlige, velger du regionen som skal erstattes og slett ved å markere bare denne regionen, og deretter høyreklikker 'Slett'.
3. Definer null nåværende baseline for hele posten ved å velge en tidlig del av posten der grunnlinjen er stabil, høydepunkt, høyreklikk og velg "sett baseline". Kontroller at handlingsregelen som vises nøyaktig representerer utgangsverdien (lilla i figur 4B)
4. Identifisere punkter i posten der rådata baseline avviker synlig fra settet baseline. Korrigere dette ved å velge en liten del av baseline innenfor avvik region, høyreklikk og velg "Legg til en baseline node 'kommando.
5. Identifisere områder av than opptak som inneholder overflødig støy eller artefakter som ikke lett kan korrigeres (Figur 4C). Marker regionen til å bli forkastet, høyreklikk, og velg "Slett". Merk: I dette tilfellet kinetic informasjon vil gå tapt: bearbeidet posten vil bli kortere og de punktene som skjer etter skjøten punktet vil synes å være sammenhengende med den pre-støy-regionen.
6. Å idealisere poster ved hjelp av SKM algoritmen ^11, markere en del av spor inneholder både åpne og lukkede arrangementer og gå inn på "Mod"-grensesnittet under "Oppsett". I "modell" panel, markere en ren del av spor som er representant for grunnlinjen i hele filen, høyreklikker du den svarte firkanten (lukket tilstand) og velg "grip". Gjør det samme for kanalåpninger ved å markere den åpne ledningsevne, høyreklikk på den røde firkanten i "modellen" panel og velg "grip".
7. Utfør idealizasjon for hele posten ved å velge "File"-knappen under 'datakilde.' Høyreklikk på "idealisere fanen under 'Modeling"-delen for å verifisere at de ønskede parametre for analyse er riktig, og klikk deretter på "Kjør". Resultatet av idealisering, sammen med amplitude histogram for hele filen, er belagt med dataene for å tillate visuell inspeksjon av idealisering (figur 5). Merk: Mangelidealisering kan føre til generering av 'falske hendelser,' hvor QUB oppdager kanal åpninger og nedleggelser som ikke faktisk oppstår. Innen innspillingen oppløsning, som er satt av forsterkerens analoge filter og samplingsfrekvensen, kan oppløsningen som SKM oppdager åpne og lukkede arrangementer styres ved å sette en dødtid for analysene. Optimal døde ganger må velges ved prøving og feiling, og vil avhenge av samplingsfrekvens, men er en god tommelfingerregelå velge en dødtid som er 2-3 prøver ^12.
8. For å kontrollere at idealise nøyaktig representerer rådata, skanne idealiserte spor manuelt. Ved identifisering av feil i idealisering, markere spor over falske hendelsen, høyreklikk og velg "Bli Idl. ' Merk: For tilleggsmuligheter og en detaljert forklaring av ulike kommandoer og funksjoner i QUB, konsultere QUB Manual online (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Rekombinant NMDA reseptorer

NMDA reseptorer binde og svare på samtidig handling av to co-agonister: glutamat og glysin. De monterer som heterotetramers av to glycin bindende GluN1 subenheter og to glutamat bindende GluN2 subenheter. GluN2 subenheter er kodet av fire gener (AD) og av disse de mest transkriberte skjemaer i hjernen er GluN2A hos voksne og GluN2B hos unge dyr. På grunn av mangfoldet av NMDA-reseptor-undertyper i native stoffblandinger, som uttrykker reseptorer i HEK293-celler (figur 1A) gir mulighet for kontroll av subenhet sammensetning, så vel som evnen til å registrere strøm fra kanalene ved hjelp av en fint polert glass-pipette (figur 1C).

Når pipette rører cellen, en klar reduksjon i amplituden til testpulsbølgeformen forekommer (figur 2B), som viser evnen til å danne en tetning. En tilfredsstillende tetning som inneholder ettkanal produserer klar kanal aktivitet, vises som nedadgående nedbøyninger fra baseline, med et godt signal til støy-forhold på begjæring fra en positiv spenning (figur 2C). Maximal kanal aktivitet for villtype rekombinant NMDA-reseptorer kan oppnås når begge agonister er tilstede i høye konsentrasjoner, og når hemmere og kanalblokkere er fraværende. Dette er ideelt, slik at når et plaster inneholder mer enn en kanal, samtidig åpningene er umiddelbart tydelig ¹³ (figur 3B). For proteiner med meget lav aktivitet, kan sannsynligheten for at en strekning av en plan flate åpninger stammer fra bare én kanal beregnes dersom kanalens åpne sannsynlighet er kjent eller kan tilnærmes ^14.. På grunn av dette, kan lengre oppfølging være nødvendig.

Under disse betingelser og ved anvendelse av en pipette holdepotensiale på 100 mV (som fører til en omtrentlig membran potensial på -120 mV), SIngle rekombinant GluN1/GluN2A og GluN1/GluN2B er åpne med høy sannsynlighet (P _o, 0.3-0.5) til en relativt høy ledningsevne nivå (> 50 hk) (Tall 3A og 5B) ^15-17. Når du spiller inn, kan dagens støy pigger, baseline fonner, eller perioder med overdreven støy manifest (Tall 4A-C), men som nevnt, disse kan rettes opp dersom kort og moll. Det er imidlertid viktig at kanalen aktiviteten er registrert uavbrutt for en tilstrekkelig mengde tid (≥ 10 min, 10 000 hendelser) for å garantere at den fulle bredden i kanal atferd fanges.

Resultatene fra slike opptak data kan gi informasjon om både kanalkinetikk og gjennomtrengningsegenskaper. Her viser vi idealisering utført av QUB hjelp av SKM algoritmen (figur 5A), men data idealisering kan utføres ved hjelp av andre programmer som pClamp eller SCAN ^12, ennd, kan utføres under anvendelse av forskjellige algoritmer eller kriterier, som for eksempel halvparten terskelmetoden, med hvert av disse alternativer som inneholder sine egne fordeler og ulemper. Montering av disse data til kinetiske modeller kan utføres for å få ytterligere innsikt i atferd av ionekanal. Maksimal sannsynlighet montering kan utføres med programvare som QUB eller HJCFIT ^18, hvor algoritmene implementert av hvert program har sine egne fordeler. Mens idealisering vist i figur 5 bare krever den enklest mulige modell av en lukket tilstand og en åpen tilstand som skal utføres, å montere en komplett kinetisk modell for en ione-kanal krever sekvensmessig å legge lukkede og åpne tilstander frem til et bestemt kriterium er nådd. Denne prosessen har vist at villtype GluN1/GluN2A reseptorer har fem kinetisk distinkte lukkede stater og 03:58 kinetisk distinkte åpne stater (figur 5C) ^19, der dissegating egenskaper er avgjørende for bestemmelse av formen på NMDA-reseptor-formidlet synaptisk signal ^{20, 21.} Denne stilen av analysen kan utvides til andre ionekanaler av mindre ledningsevne, som AMPA reseptorer, for å få innsikt i sin egen distinkte gating mekanismer ^22,23,24. En påminnelse er, men siden AMPA reseptorer har flere konduktans nivåer, vellykket idealisering ved hjelp QUB kan kreve flere stater er innlemmet i en forhåndsbygde modell.

Disse metodene kan også bli utvidet til å få informasjon om ionekanal gjennomtrengning og konduktans ved å endre gjennomtrengende ion sammensetning og / eller konsentrasjon. Opptaks aktivitet ved engangs GluN1/GluN2A reseptorer ved hjelp av de metoder som er beskrevet her, men ved erstatning av 150 mM NaCl med 75 mM CaCl ₂ i opptaks pipette, gir strømmer med ~ 20% av konduktans (~ 10 pS). Dette viser at mens kalsium syrer NMDA reseptorer i hiGH-nivåer i fysiologiske betingelser, er det faktisk går gjennom kanalen saktere enn natriumioner, noe som indikerer at det kan være en potensiell kalsium-bindingssete i gjennomtrengningsveien. I tillegg, til tross for denne lille ledningsevne, opptakene kan være tilstrekkelig idealisert hjelp av SKM algoritmen i QUB, avslører at det foreligger et mellomliggende undernivå-konduktans, som er omtrent 50% av amplituden av hoved konduktans nivå (figurene 6A og B). Disse undernivå åpninger, men kan kun idealiserte i QUB når en ekstra konduktans klassen er innlemmet i den første kinetisk modell. Ytterligere kinetiske analyser viste at under disse forholdene, reseptorer fortsatt viser fem kinetisk distinkte lukket tilstand, men disse statene har svært forskjellige tidskonstanter og occupancies forhold til når kanalen passerer bare natriumioner (figur 6C). I tillegg er det bare to åpne tilstander observert under disse forholdene viser at, i tillegg til å påvirke kanal konduktans kalsiumioner er i stand til å modulere reseptor gating.

Det er ingen bestemt måte for å oppnå bare en kanal-lapper. I stedet kan flere eksperimentelle manipulasjoner bidra til å øke sannsynligheten for suksess. For det første tar sikte på lavt nivå av kanalen ekspresjon ved å evaluere fluorescensintensiteten av de transfekterte celler (figur 1B). Vellykkede tilnærminger kan være å: redusere den totale mengden av cDNA som brukes for transfeksjon eller for å redusere mengden av cDNA for en pålagt underenheten, som er GluN1; for å redusere tiden for inkubering med DNA / kalsiumfosfat presipitat; og for å velge for patching bare svakt fluorescerende celler fra synsfeltet. Disse metodene bør forfølges dersom de patcher innhentet ofte inneholde flere kanaler. I tillegg kan redusere størrelsen på pipettespissen også bidra til overlapping bare én kanal i patch. Til syvende og sist derimot, blir man lykkes i å skaffe en-kanals patcher ved systematisk å avstå fra innspilling i lange perioder fra patcher som tydelig inneholder mer enn én kanal.

Rekombinante PIEZO1 Kanaler

Metodene som beskrives i denne protokollen kan lett anvendes på en hvilken som helst ligand gated ionekanal, og faktisk kan være tilpasset til å ta opp en kanal-aktivitet fra en ione-kanal, enten aktivert av kjemikalier, spenning, kraft, temperatur, eller på annen måte. Ett eksempel på hvordan denne protokollen kan tilpasses for å ta opp en kanal strømmer fra andre ioner kanaler, spesielt mus PIEZO1, en ​​mechanosensitive ionekanal, presenteres nedenfor (figur 7) ^{25, 26.}

Som med NMDA-reseptor-kanalene, blir PIEZO1 og GFP uttrykt i HEK293-celler ved kalsiumfosfat-mediert transfeksjon, og cellene blir benyttet 24 til 48 timer post-transfeksjon sombeskrevet i kapittel 1.2. Fordi PIEZO1 aktiveres av membran strekning, bør man sørge for å manipulere membranen forsiktig under patch dannelse og hensiktsmessige enheter for levering og kontroll av den mekaniske kraften bør være tilgjengelig. Disse betingelser kan oppnås ved å lage større opptaks pipetter, med motstand i 2-3 MΩ avstand og ved hjelp av en høyhastighets trykkklemanordning (HSPC) forbundet med opptaks pipette gjennom pipetteholder på forsterkeren heads. Innstillingene forsterker er lik de som er beskrevet for NMDA-reseptorer i avsnitt 3.3, med unntak av å slå på "ytre 'kommandoknappen, slik at forsterkeren kan kontrolleres gjennom kjøpet programvare.

For å ta opp aktivitet fra PIEZO1, bruke et opptak pipette fylt med (i mm): 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, en CaCl _2, en MgCl _2, 10 TEA-Cl, pH 7,3 med NaOH. Under disse forholdene, kan åpninger overvåkes som jegnward natrium strøm, som vil vises på oscilloskop som nedadgående nedbøyninger fra en null nåværende baseline. Plasser innspillingen pipetten på forsterkeren hodet scenen og sørge for at skiven på HSPC er på null. Før du går inn på badet, bruke 3-5 mmHg av overtrykk. Ved hjelp av mikromanipulator, senke pipetten inn på badet, sjekk for ønsket pipette motstand, og bringe pipetten i umiddelbar nærhet til den valgte cellen som beskrevet i kapittel 3.6. Forsiktig berøre cellen under mikroskop veiledning, og ved å overvåke oscilloskop, observere en svak reduksjon i amplitude på tetningen test bølgeform på en lignende måte som på NMDA-reseptorer (seksjon 3.7). Slipp raskt overtrykk søkt gjennom pipetten ved å endre trykket eiendomsnivå fra 3-5 til 0 mmHg. Vent en GΩ tetning for å danne ved å overvåke bølgeformen tetning test. I dette tilfellet er ikke noe negativt trykk påføres for å danne en tetning. Når en optimal tetning oppnås ved å trykke på &# 8216,. Record "-knappen i QUB å begynne å skaffe data Figur 7 viser et representativt spor av mPIEZO1 enkanals strømmer aktivert ved å påføre -20 mmHg av trykk til plasteret pipette. Disse strømningene var lavpassfiltrert på 2 kHz og samplet ved 20 kHz.

I motsetning til ligand gated kanaler med ekstracellulære ligand bindingsdomener, kan stimulus aktiverer mechanosensitive kanaler varieres under 2 protokoller. Den første er "gap-fri, 'hvor et konstant negativt trykk utøves mot lappen for hele opptaks varighet. Denne protokollen er nyttig i å skaffe minutter lange opptak og er mest vellykket med mindre press stimuli (0 til 20 mmHg), som bevarer membran integritet. Aktivitet fremstilt ved høyt trykk, noe som er egnet til å briste membranen, kan best oppnås med 'episodisk' opptak, hvor pulser av varierende trykk kan brukes til plasteret i kortere tidsperioder (<strong> Figur 7). Som med ligand gated kanaler, opptak fra cellen festet en kanal patcher gir et vell av informasjon om både ledningsevne og gating egenskapene til kanalen under etterforskning.

Neuronal NMDA reseptorer

Metoden som beskrives her en-kanals opptakscelle-festet kan brukes for å skaffe informasjon om konduktans og gating egenskaper av kanaler endogent til en bestemt celletype og / eller utviklingsstadiet. Som tilfellet er med mange andre heteromeric kanaler, blir den eksakte molekylære sammensetning av fremmed NMDA reseptorer ikke kjent. Ved å sammenlikne resultatene oppnådd fra rekombinante reseptorer av kjent sammensetning med de som ble oppnådd fra opprinnelige preparater, hypoteser om subenheten sammensetning og funksjon av kanaler i sitt opprinnelige miljø kan formuleres eller prøvd ^17..

Nevronene ble isolert fra prefrontalcortex av rotte embryoer og dyrket i kultur i opp til 6 uker ^17. I tillegg til komponentene som er beskrevet for rekombinante NMDA-reseptor-opptak i avsnitt 2.2, pipetten løsningen også inneholdt CNQX (20 uM) og bicuculline (10 mM) for å hindre fremmed AMPA-og GABA-reseptorer, respektivt. Avhengig av alder av kulturen, postene innhentet fra innfødte NMDA reseptorer avslørte kinetikk som var ganske annerledes. Opptak fra tidlig (figur 8A, fem dager i vitro) kultur ligne kinetikk som er beskrevet for GluN1/GluN2B reseptorer og innspillinger fra sent (figur 8B, 27 dager in vitro) kulturer ligne kinetikk som er beskrevet for GluN1/GluN2A reseptorer nærmere (Tall 3A tettere og 5A). Denne observasjonen er konsistent med mønstre av NMDA reseptor uttrykk isoformer og med forsiktig karakterisering av strømmer opp fra celle festet ett-kanal flekker i hoftepocampal kulturer ^16.

Figur 1. Velge en HEK293 celle for celle festet opptak.. A) HEK293-celler dyrket i en 35 mm fatet plasseres på objektbordet og sett med fasekontrast ved 40X forstørrelse. B) GFP fluorescens fra samme synsfelt som i panel A identifiserer transfekterte celler. Pil viser en celle som uttrykker GFP, vises sunt, og er i en posisjon mottagelig for pipette tilgang. C) Innspillingen pipette er brakt i umiddelbar nærhet til den valgte cellen ved hjelp av en fin bevegelse manipulator henhold visuell veiledning. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Cell festet tetning formasjonen. A) En liten sprøyte som er koblet til den siden av pipetteholder tillater manuell styring av trykk inne i pipetten. B) Den strømmen som går gjennom pipetten neddykket i badoppløsningen i respons til forsterkeren test, som på 5 mV (0,5 kHz) ligger 18 pA, og tilsvarer en pipette størrelse på 28 MΩ. Ved berøring av cellen (venstre pil), nivået av de observerte aktuelle avtar, noe som indikerer økt pipette motstand. Bruk av negativt trykk gjennom pipetten (høyre pil) initierer tetning dannelse og reduserer signalet som produseres av testpuls til bare kapasitive transienter. C) I fravær av en testpuls, og hvis ingen spenning tilføres via pipette (0 V), referanse er stabil (venstre pil). Bruk av positiv spenning (pil, 100 mV) pr oduces stokastiske enhetlige strømninger som indikerer kanalåpninger. Rød stiplet linje indikerer null nåværende baseline.

. Figur 3 Cell festet strømmer opp fra GluN1/GluN2A reseptorer A) En kanal patch:. En 50 sek segment av kontinuerlig opptak illustrerer kanalåpninger til en enkelt uniform amplitude B) Multiple-kanal patch:. En 50 sek segment av kontinuerlig opptak illustrerer kanal åpninger til to amplitude nivåer som indikerer at oppdateringen inneholder minst to aktive kanaler. Rød stiplet linje viser null nåværende baseline. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

">
Figur 4. Prosessdata. A) Korreksjon for støy pigger. Vise data ufiltrert og manuelt erstatte overflødig signal (rød) med baseline signal. Utvidet visning illustrerer en pigg før (i midten) og etter (nederst) pigg (rød) ble erstattet med baseline signal. B) Korreksjon for baseline drift. Tidlig i posten, velger du et lite segment av baseline og sett den som null dagens nivå for hele posten (lilla linje). Riktig baseline drift ved å velge en liten del av drev baseline (pil) og legge en baseline node (lilla sirkel). C) Lengre perioder med rekord med støyende baseline (rød) som er vanskelig å korrigere kan slettes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Dataidealisering. A) Figur 5. Omløps spor (svart) ble registrert fra en GluN1/GluN2A reseptor passerer bare natriumioner med celle-festet patch-clamp teknikken. Idealiserte datapunkter (røde) er illustrert for en 30 sek én kanal segment. Disse overlapper hverandre godt, noe som indikerer at idealisering er korrekt. B) Histogram av dagens amplitudes illustrere en distribusjon som er godt beskrevet av bare to Gaussian funksjoner med topper på null (0,02 ± 0,8 Pa), en indikasjon på lukkede kanaler hendelser og på 10,3 ± 1,3 pA indikasjon på bare én type åpen kanal arrangementer for hele opptaket varighet (130 min). C) Lukket (til venstre) og åpen (høyre) holdetid histogram for hele opptaket vises i (A). Den probabilligheten tetthetsfunksjonen for histogramma (tykke linjer) og individuelle kinetiske komponenter (tynne linjer) er kledde og ble beregnet ved å tilpasse dataene til en modell som inneholder fem lukkede stater og tre åpne stater. Innfellinger gir tidskonstanten (τ) og tilsvarende område (a) for hver av de enkelte kinetiske komponenter.

Figur 6. Kalsium strømmer gjennom enkelt NMDA reseptorer. A) Nåværende spor (svart) ble registrert fra en GluN1/GluN2A reseptor passerer bare kalsiumioner med celle-festet patch-clamp teknikken. Idealiserte datapunkter (røde) er illustrert i 30 sek segmentet. B) Histogram av dagens amplitudes illustrere en distribusjon som er godt beskrevet av tre Gaussian funksjoner med topper på null (0 ± 0,3 pA), en indikasjon på nærtd kanal hendelser, 1,3 ± 0,4 pA indikasjon på åpen kanal hendelser til et undernivå ledningsevne, og 2,1 ± 0,3, som indikerer åpen kanal hendelser til hoved ledningsevne nivå. C) Lukket (tv), hoved konduktans nivå åpen tilstand (i midten) og undernivå ledningsevne åpen tilstand (til høyre) holdetid histogram for hele opptaket vises i (A). Sannsynligheten tetthetsfunksjonen for histogramma (tykke linjer) og individuelle kinetiske komponenter (tynne linjer) er kledde og ble beregnet ved å tilpasse dataene til en modell som inneholder fem lukkede stater, to hoved konduktans nivå åpne stater og ett undernivå ledningsevne åpen tilstand. Innfellinger gir tidskonstanten (τ) og tilsvarende område (a) for hver av de enkelte kinetiske komponenter.

Figur 7. Cell festet en kanal opptakfra mPIEZO1 uttrykt i HEK293 celler. Aktiviteten er utløst ved å bruke -20 mmHg trykk med en HSPC enhet gjennom patch pipette, under konstant bruk av spenning (80 mV). Rød stiplet linje indikerer null dagens nivå.

Figur 8. Cell festet en kanal opptak fra opprinnelige kanaler. Pipetten ble festet ved soma av et nevron som ble skilt fra den prefrontale cortex til en rotte embryo, og ble opprettholdt i kultur i 5 dager (A) eller 27 dager (B) . Kontinuerlig NMDA-reseptor-aktivitet ble registrert med pipettes oppløsninger som inneholder glutamat (1 mM) og glycin (0,1 mM), og også CNQX (20 uM) og bicuculline (10 mM) for å hindre fremmed AMPA-og GABA-reseptorer, respektivt. Aktivitet ble utløst ved å bruke 100 mV through innspillingen pipette. Rød stiplet linje indikerer null dagens nivå.

Discussion

I ionekanal-feltet, er et viktig forskningsområde dedikert til å forstå hendelsesforløpet som fører til kanal åpning eller kanalens gating mekanisme. For de fleste kanaler, denne prosessen er kompleks og involverer flere kinetiske fremgangsmåten som ikke kan utledes fra en makroskopisk flerkanalsignal. I motsetning til dette kan være utformet eksperimenter hvor observere sekvensen av åpne / lukkede hendelser enkelt kanal posten kan produsere mer detaljert informasjon om gating mekanismer. I metodene som er beskrevet her, er plassert utvendig ligand bindende domene i besittelse av NMDA-reseptorene gjør det mulig å minimalt invasive patch-clamp opptak som skal utføres under konstante betingelser. Denne protokollen kan måtte tilpasses for å være egnet for undersøkelse av andre ligand-gated ionekanaler avhengig både ligand og reseptor-egenskaper.

Registreringer av enkeltkanalaktivitet gi to typer av verdifull informasjon. Førstfordi den enhetlige værende amplitude kan måles direkte, kan eksperimenter være konstruert for å skaffe informasjon om poreegenskapene for eksempel kanal-konduktans, permeabilitet og selektivitet. For det andre, fordi varigheten av åpne og lukkede arrangementer kan også måles direkte fra plata, eksperimenter kan være konstruert for å skaffe informasjon om kinetisk gating og dermed gjøre slutninger om den operative mekanisme av kanalen. For begge typer forsøk, krever meningsfull statistisk analyse binning hvert enkelt punkt fra det aktuelle spor til en spesifikk konduktans klasse. Presenteres her var en slik metode for å gjøre dette, ved hjelp av segmentell k-midler (SKM) ¹¹ algoritmen, men dette kan gjøres ved flere mer eller mindre avanserte algoritmer inkludert halv-terskel, SCAN ^12, Baum-Welch, Viterbi, etc.

Opptak ved hjelp av celle-festet konfigurasjon er kraftig ved at ionekanaler er bevart i biologiskmembraner med uaffisert intracellulære miljøer. På grunn av dette, er det avgjørende at membran sel er tilstrekkelig dannet og bevart gjennom hele innspillingen for to formål: 1) eksperimentell kontinuitet og 2) å opprettholde en gunstig signal-til-støy-forhold (topp til topp baseline støy <2 pA). Størrelsen og formen på pipettespissen genereres bestemmer sannsynligheten for en vellykket membran tetning som inneholder nøyaktig en kanal. En flate ende sørger for at når pipetten nærmer cellen vil det berører og trykker på cellemembranen med hele spissen overflaten på en gang, noe som hjelper til å tette jevnt på cellen. En pipette med et tips som er for bred vil være mindre sannsynlighet for å resultere i en-kanal patcher; I motsetning til dette vil ved å trekke en pipette med en spiss som er for smal resultere i en omega-formet membran løkke som kan tette i bunnen og tette pipetten ^10..

En gunstig signal til støy-forhold kan håndteres ved å minimere kilder til elektriskstøy. Den headskjølefunksjonen på Axopatch 200B har åpnet for optimal signal oppløsning; imidlertid støy kan fremdeles fremstilles ved en hvilken som helst av de instrumenteringen som er involvert i den elektro satt opp, så vel som eksterne kilder som lett og ubeslektede elektronikk. Heldigvis kan flere strategier gjennomføres for å redusere støy til et ønsket nivå ^{2, 27.} Kort fortalt, sørg for at deler av utstyret som er i stand til å produsere støy er jordet til et enkelt punkt i oppsettet. Ved å gjøre dette, er det viktig å unngå at det dannes jordsløyfer som vil føre til betydelig støy. I tillegg, hvis 60 syklus støy er til stede, må du huske å slå av noen lys som kan forstyrre opptaket signal. Til slutt vil det å plassere en Faraday-bur rundt registreringsapparatet hindre nærliggende hindringer forårsaker elektrisk støy.

Observasjon av en kanal for en lang tid har vist at portstyringskonformasjonsendringer kan skje over et bredt spekter av tidsskala. Tidsmessig, er patch-clamp data begrenset på "kort" ende av båndbredden til forsterkeren, og hastigheten ved hvilken det forsterkede signalet er digitalisert og ved 'lang-enden av observasjonsvinduet. For konformasjonsendringer som er raskere enn den lave grensen, kan patch-clamp opptak kun tilby informasjon når kombinert med komplementære eksperimentelle tilnærminger. For konformasjonsendringer som oppstår med meget langsomme hastigheter, og således er prøvetatt ofte, kan man øke antallet observasjoner eller øke varigheten av plata, men dette kan ikke alltid være mulig.

Til tross for disse begrensningene, patch-clamp data, spesielt når hentet fra en enkelt kanal, inneholder ofte mer informasjon enn umiddelbart hentes ut med dagens beregningsmetodikk. Dermed er en forventning om at fremtidige økninger i regnekapasitet og i sophistication av algoritmer vil gjøre mulige tilleggsprogrammer. Ved bruk av slike fremskritt, er det påregnelig at patch-clamp opptak fra enkeltkanaler kan være i stand til å skje samtidig med FRET målinger, kalsium bildebehandling eller til og in vivo forberedelser for å gi ytterligere informasjon om struktur, funksjon og dynamikk ionekanaler i både innfødte og kontrollerte omgivelser.

Som mangfoldet av ionekanaler undersøkt øker, detaljert forståelse av sine gating mekanismer og til slutt forstå hvordan deres drift bidrar til deres unike biologiske funksjoner vil dra nytte av ett molekyl observasjoner. Spesielt data innhentet med en-kanal patch-clamp lover å informere om enhetlige konduktans egenskaper og gating sekvenser for rekombinante og innfødte kanaler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1