Un canal celular conectado a Patch-clamp grabación

Summary

Descrito aquí es un procedimiento para la obtención de largos tramos de grabación actual de un canal de iones con la técnica de patch-clamp de células-adjunto. Este método permite observar, en tiempo real, el modelo de open-close conformaciones de canales que son la base de la señal biológica. Estos datos informan acerca de las propiedades de los canales en las membranas biológicas inalteradas.

Abstract

Proteínas de los canales iónicos son dispositivos universales para la comunicación rápida a través de membranas biológicas. La firma temporal del flujo iónico que generan depende de las propiedades intrínsecas a cada proteína del canal, así como el mecanismo por el cual se genera y se controla y representa un área importante de la investigación actual. Información acerca de la dinámica de funcionamiento de proteínas de los canales de iones se puede conseguir mediante la observación de largos tramos de corriente producida por una única molécula. Descrito aquí es un protocolo para la obtención de patch-clamp grabaciones de corriente de la célula-adjunto de un canal para un canal de iones cerrada ligando, el receptor de NMDA, expresado de forma heteróloga en células HEK293 o de forma nativa en las neuronas corticales. También se proporcionan instrucciones sobre cómo adaptar el método a otros canales iónicos de interés al presentar el ejemplo del canal PIEZO1 mecano-sensible. Este método puede proporcionar datos con respecto a las propiedades de conductancia del canal y la secuencia temporal de Opeconformaciones n cerrados que componen el mecanismo de activación del canal, lo que ayuda a comprender sus funciones en la salud y la enfermedad.

Introduction

Comunicación rápida a través de membranas biológicas depende casi exclusivamente de las proteínas de membrana oligómeros formadores de poros, comúnmente conocidos como canales. Estas proteínas son muy diferentes en las señales de activación, los mecanismos de activación periódica y propiedades de conductividad. Proteínas de los canales cuyos poros son selectivos para iones se clasifican como canales iónicos; su activación produce corrientes iónicas a través de la membrana, y sus respuestas se puede grabar con alta resolución en tiempo real utilizando técnicas electrofisiológicas. Las señales de activación abarcan una amplia gama de insumos químicos y físicos, incluyendo gradientes de concentración, las fuerzas mecánicas y eléctricas y la temperatura; por lo tanto, la clasificación más canales iónicos en ligando cerrada, mechanosensitive, voltaje cerrados o tipos sensibles al calor. En este artículo, se describen protocolos para registrar la actividad de un canal de un canal de ligando cerrada, el receptor de NMDA, y un canal de mechanosensitive, PIEZO1, utilizando la técnica de patch-clamp.0;

Electrofisiología Patch-clamp es el primer y más utilizado método experimental suficientemente sensible para permitir la observación de moléculas individuales ^{1, 2.} Además de esta exquisita sensibilidad, que se ha expandido enormemente las preparaciones biológicas susceptibles de grabación electrofisiológico y también ha permitido la observación de los canales iónicos en membranas intactas. En primer lugar, debido a que ambos de fijación de tensión y de grabación actual se llevan a cabo con el mismo electrodo, que puede ser utilizado para grabar señales a través de células pequeñas o parches de membranas. La técnica reveló que los canales iónicos no se restringen a las membranas excitables de músculos rana, electroplaques anguila, o axones gigantes del calamar ^{3, 4,} sino que representan accesorios ubicuos de los mecanismos de señalización transmembrana y son intrínsecas a todos los tipos de membranas celulares de uni-o los organismos multicelulares, y también a las membranas intracelulares. Importaciónantly, la capacidad para registrar las corrientes transmembrana con sólo conectar una pipeta de vidrio de una célula intacta proporcionó la oportunidad sin precedentes para registrar la actividad de los canales iónicos en las membranas ininterrumpido nativas. Así, el adjunto técnica de patch-clamp de células, que se describe en este protocolo, permite el seguimiento de la actividad de los canales iónicos de forma continua durante decenas de minutos o más en su ambiente nativo.

Bajo las fluctuaciones térmicas normales, todas las proteínas, incluyendo las proteínas de los canales iónicos, sufren cambios estructurales a lo largo de una escala de tiempo amplio, con los reordenamientos más rápidos y más frecuentes representados muy probablemente por los movimientos de las cadenas laterales y los cambios mucho más lentos y menos frecuentes representados por el reposicionamiento de toda dominios o subunidades, o en algunos casos por modificaciones post traduccionales o interacciones proteína-proteína ^{5, 6.} Observando largos periodos en actividades generadas por una molécula puede ayudar a comprender la funcióndinámicas internacionales de los canales iónicos en las membranas intactas fisiológicos y proporciona información valiosa sobre el mecanismo de funcionamiento de la molécula observado.

En contraste con la creciente comprensión de la diversidad de los canales de iones a través de tipos de células y etapas de desarrollo, el conocimiento sobre la composición molecular de los canales iónicos en membranas nativas es aún limitada. Todos los canales de iones son proteínas multiméricas y la mayoría de los canales de iones nativos ensamblan a partir de varios tipos de subunidades que producen proteínas de diversidad molecular amplia, que a menudo se acompaña con diversas propiedades de conductancia y de activación periódica. Por esta razón, los canales iónicos de composición molecular definido se estudiaron después de la expresión en sistemas heterólogos. En particular, las células HEK293, que son una línea clonal de células embrionarias humanas inmortalizadas de riñón ^7, ganado amplia aceptación como el sistema preferido para la expresión heteróloga de los canales iónicos recombinantes. Entre el hombreY ventajas que elevaron las células HEK293 como el sistema de elección para la electrofisiología de canales de iones son la facilidad y asequibilidad de cultivo y mantener los cultivos estables de larga duración, su capacidad para llevar a cabo después de la traducción de plegado, el procesamiento y el tráfico de proteínas de mamíferos, y en muchos casos , su bajo nivel o incluso ausencia de la expresión endógena para el canal de interés ^{7, 8.} Expresando los canales iónicos recombinantes y estudiar sus propiedades funcionales en células HEK293 sigue siendo un enfoque valioso para obtener información sobre las propiedades de estructura-función de los canales iónicos así como las propiedades específicas de las isoformas de los canales iónicos y sus roles en el tejido nativo. Los protocolos que se describen en este artículo se pueden aplicar igualmente a los canales iónicos recombinantes expresadas en células HEK293 y para los canales iónicos nativas.

En resumen, la técnica de patch-clamp, a través de su capacidad sin precedentes para resolver señals de una molécula sigue siendo, hasta la fecha, el método más directo para observar el comportamiento de las moléculas individuales. En su modo celular conectado, la grabación de patch-clamp permite períodos largos de observación que, cuando se hace por una molécula, pueden proporcionar una visión excepcional sobre el funcionamiento de los canales iónicos. A continuación se presenta un protocolo para la obtención de alta resolución grabaciones actuales de parches adjuntos de células que contienen una proteína de canal iónico.

Protocol

1. Cultivo Celular y Expresión de proteínas

1. Mantener las células HEK293 (número de ATCC CRL-1573) entre los pasajes 22 y 40, que incluye pasajes realizados por la ATCC, en cultivo en monocapa en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina / estreptomicina a la mezcla de 5% de CO ₂ y 37 ° C. Entre los experimentos, las células de paso en matraces T25 a 5-20 diluciones en un volumen final de 10 ml. Nota: El uso de células durante estos pasajes garantiza la salud celular favorable que permita la formación de sellado óptimo y estabilidad parche.
2. Para la transfección, la placa de células HEK293 en placas de 35 mm a una densidad de ~ 10 ⁵ células / placa, que corresponde a ~ 0,5-0,6 ml de suspensión de células por plato y crecer las células en 2 ml de medio de 18-24 h.
3. En un tubo estéril de centrífuga de 1,5 ml, preparar la mezcla de transfección durante cuatro platos de 35 mm mediante la adición de (en este orden): (1) 1 g de cada ADNc (GluN1, GluN2A, y GFP); (2) 315 l deagua doblemente destilada _(ddH2O); (3) 350 l de 42 mM de 4 - (2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico ácido (HEPES), y (4) 35 l de _CaCl2 2,5 M gota a gota, que se utiliza para formar el precipitado.
4. Tubo Vortex durante 5 segundos y añadir 175 l de suspensión de la transfección en cada uno de los cuatro platos de 35 mm chapada el día anterior, que ahora contiene células a 50-60% de confluencia, e incubar las células a 37 ° C durante 2 horas.
5. Aspirar el medio de transfección, se lava con PBS y se reemplaza con 2 ml de medio de crecimiento suplementado con 2 mM de MgCl ₂ para evitar que la excitotoxicidad mediada por receptor de NMDA ^9. Nota: Las células se pueden utilizar para registros electrofisiológicos mensaje 24-48 h de la transfección.

2. Preparación del electrodo

1. Generar 2 pipetas de registro simétricas tirando de tubos de vidrio borosilicato con un extractor vertical. Basándose en el tamaño y la geometría de la punta resultante, más pipetas formausando una pulidora. Nota: El tamaño de la punta puede ser evaluado visualmente y eléctricamente. Visualmente, el diámetro exterior debe estar en el rango de 1.4 a 5.6 micras. Eléctricamente, una punta de tamaño óptimo, cuando se llena con solución extracelular, debe producir resistencias en el rango MΩ 12-24 (véase la Figura 2B).
2. Use una solución de la pipeta, lo que para los experimentos con células adjunta representa el medio extracelular que producirá la actividad del canal máximo y altas amplitudes de corriente. Nota: Para los receptores de NMDA, esto corresponde a una solución que contiene concentraciones de saturación de los agonistas (glutamato y glicina), EDTA 1 mM, que quela inhibidores catiónicos divalentes y bloqueadores, y tiene concentraciones fisiológicas de sodio (150 mM) como único ion permeable ( en mM: 1 glutamato, glicina 0,1, NaCl 150, KCl 2,5, EDTA 1, y 10 lambda HepBs, tamponada a pH 8,0 con NaOH 1 N).

3. Patch-clamp grabación celular conectado

1. Abrir softwa adquisición de datos QuBre (www.qub.buffalo.edu), y seleccione la ventana de adquisición en virtud de 'diseño'. Abra un nuevo archivo de datos QuB (QDF) haciendo clic en 'New Data "bajo el menú desplegable titulado' File 'e introduzca los siguientes parámetros iniciales: la tasa de muestreo, 40 kHz; A escala / D, 3000; canal de salida, 1; y el tamaño de los datos A / D, 2. Ajuste la escala de amplitud de 0,1 V / pA haciendo clic derecho en el archivo de datos, la selección de propiedades, y hacer clic en la pestaña 'datos'. Nota: Estos parámetros pueden ser refinados para cada configuración usando un modelo de células en el modo de célula-adjunto. Instrucción adicional sobre la adquisición de datos con el software QuB y propiedades QDF están en línea en www.qub.buffalo.edu.
2. Seleccionar un plato de 35 mm que contiene células que expresan canal iónico y reemplazar el medio de cultivo con 2 ml de PBS que contiene calcio y magnesio; montar el plato en la platina del microscopio y se centran en el campo celular mediante microscopía de contraste de fases para evaluar que las células están sanas y bien unidos al platoen la moda monocapa (Figura 1A). Cambiar a la detección de fluorescencia para verificar que la transfección ha sido satisfactoria (Figura 1B). Nota: El rango de intensidades de fluorescencia se puede utilizar como una medida cruda de la expresión de la proteína.
3. Para la grabación de un solo canal, ajuste la salida de ganancia del amplificador para x10, la configuración de parche para β = 1, filtro analógico de 10 kHz, el modo de fijación de voltaje y el voltaje aplicado a 100 mV. Con la orden de retención de voltaje en la posición OFF, seleccione el botón de 'prueba del sello'.
4. Basado en la fluorescencia y la salud de las células, elija una célula para reparar. Compruebe bajo contraste de fase que la célula es bien unidas a la placa, tiene una gran parte de la superficie de la célula expuesta para parches, y de lo contrario se ve saludable. Nota: Mantenga la iluminación de contraste de fase para evitar el blanqueo de la célula durante la aproximación y patch-sujeción.
5. Llenar una pipeta recién pulida con suficiente solución para que haga contacto con la electrodelectrónico y agite suavemente para eliminar las burbujas de aire que puedan estar atrapadas en la punta. Asegure la pipeta de la grabación en el headstage amplificador apretando el tornillo de sellado del soporte de pipetas y asegurarse de que el alambre de plata se encuentra inmersa en la solución de la pipeta.
6. El uso de un pequeño (5 cc) de la jeringa de plástico, que está conectado a la titular de la pipeta por tubo, se aplica una suave presión positiva para evitar que entren impurezas en y la obstrucción de la punta durante la aproximación (Figura 2A).
7. Usando el micromanipulador, dirija la pipeta en el baño y colocar directamente sobre la celda seleccionada para parchar (Figura 1C), cerrando el circuito eléctrico. Tome nota del osciloscopio, que debe indicar una forma de onda rectangular correspondiente al sello de la señal de prueba del amplificador (Figura 2B). Nota: Al entrar en el baño, la resistencia de la pipeta dentro del rango óptimo es 12-24 MΩ. Para una señal de prueba 5 mV, la corriente medida range corresponde a ~ 20-40 pA.
8. Durante la supervisión de la posición de la pipeta visualmente a través de la resistencia microscopio y pipeta eléctricamente en el osciloscopio, continuar la aproximación en pequeños incrementos hasta que la pipeta suavemente incide sobre la célula, y la señal de prueba disminuye ligeramente para indicar aumento de la resistencia (Figura 2B).
9. Para formar un cierre hermético, recoger la jeringa y aplicar una ligera presión negativa a través del tubo lateral tirando del émbolo de la jeringa, que tira de la membrana celular en la punta de la pipeta de grabación e inicia la formación de un sello resistencia GΩ ^10. Tome nota de la forma de onda de la señal de prueba en el osciloscopio, en el que la formación del sello se indica por su aplanamiento completo, con sólo transitorios capacitivos visibles (Figura 2B). Nota: Si la señal no se aplane completamente la línea de base o hace ruido, esto indica un sellado débil con fuga de corriente sustancial alrededor del sello. Esto evitará que Resolving uno corrientes de los canales. Si este es el caso, retirar la pipeta de la célula y fuera de la bañera, retírelo de la etapa de la cabeza y lo descarta. Repita el proceso con una pipeta recién pulida hasta obtener un sello en el rango adecuado (≥ 1 GΩ).
10. En el amplificador, cambiar la palanca de mando externa de 'prueba de sellado' en 'off'; cambiar el orden de tensión que sostiene a positivo (lo que se ha establecido previamente en 'off'); y aumentar la ganancia de x100. Observar el osciloscopio para la actividad del canal, que, si está presente, se muestra como desviaciones al alza cuadrados desde la línea de base previamente plana (Figura 2C).
11. Si se muestra la actividad del canal en el osciloscopio, adquirir datos en el archivo digital abierto previamente en QuB, pulsando el botón "play" seguido del botón "record". Para detener la adquisición de datos, pulse el botón de parada en QuB, y guarde el archivo QDF a una facilidad retrievubicación capaces en el disco duro del ordenador seleccionando "Guardar datos como ..." en el menú desplegable titulado 'Archivo'.

4. Datos de preprocesamiento y la idealización

Nota: Información adicional se puede extraer de las grabaciones de canales individuales mediante análisis estadísticos que asigna a cada punto de datos a una clase de la conductancia apropiado (en el caso más simple, cerrado o abierto). Este proceso se conoce como idealización de datos y una breve descripción de la idealización de datos con los medios k segmentarias (SKM) Método ¹¹ en QuB se describe a continuación.

1. Abra el archivo de datos en QuB, y ver las huellas actuales de la interfaz 'Pre' bajo 'layout'. Visualice el archivo grabado sin filtrar (eliminar filtro digital) desmarcando la casilla 'Fc.
2. Escanear visualmente el registro para detectar las irregularidades y los artefactos (Figura 4A). Picos de corriente breves correctos que ocur dentro de la traza (Figura 4) mediante la selección de una región limpia adyacente de la misma clase de la conductancia, destacando esta región, haciendo clic derecho y seleccionando 'búfer de borrado ajustado. Zoom sobre la espiga hasta que los puntos de muestreo individuales son visibles, seleccione la región que sustituir y borrar resaltando sólo esta región y haga clic en "borrar".
3. Definir la línea de base cero de corriente para el registro completo seleccionando una primera parte del registro donde la línea de base es estable, lo más destacado, haga clic derecho y seleccione 'línea de base set'. Verifique que la guía que aparece con precisión representa el nivel básico (púrpura en la Figura 4B)
4. Identificar puntos en el disco donde la línea de base de datos en bruto se desvía visiblemente desde la línea de base establecida. Corrija esto seleccionando una pequeña sección de la línea de base en la región de desviarse, haga clic derecho y seleccione el comando 'agregar un nodo de referencia ».
5. Identificar las regiones del tque la grabación que contiene el exceso de ruido o los artefactos que no se pueden corregir fácilmente (Figura 4C). Resaltar la región para ser desechados, haga clic y seleccione 'Eliminar'. Nota: En este caso la información cinética se pierde: el registro procesado será más corto y los puntos que se producen después de que el punto de empalme parecerá ser continuo con la región pre-ruido.
6. Para idealizar registros utilizando el algoritmo de SKM ^11, resalte una parte de la traza que contiene tanto abierto como cerrado acontecimientos y entrar en la interfaz 'Mod' bajo 'Layout'. En el panel "modelo", resalta una parte limpia de la traza que es representativa de la línea de base en todo el archivo, haga clic en el cuadrado negro (estado cerrado) y seleccione "agarrar". Haga lo mismo para las aberturas de los canales, poniendo de relieve la conductancia abierto, haga clic derecho en el cuadrado rojo en el panel de "modelo" y seleccione "agarrar".
7. Realice la idealizaciónción para el registro completo seleccionando el botón 'File' en 'Origen de datos.' Haga clic en la pestaña "idealizar" debajo de la sección 'Modeling' para verificar que los parámetros deseados para el análisis son correctos y, a continuación, haga clic en "Ejecutar". El resultado de la idealización, junto con el histograma de amplitud para el archivo completo, se superpone con los datos para permitir la inspección visual de la idealización (Figura 5). Nota: idealización inadecuada puede conducir a la generación de los "eventos falsos, 'en el que QuB detecta aperturas y cierres de canales que no ocurren en realidad. Dentro de la resolución de grabación, que se establece por el filtro analógico del amplificador y la frecuencia de muestreo, la resolución con la que SKM detecta eventos abiertos y cerrados se puede controlar mediante el establecimiento de un tiempo muerto para los análisis. Tiempos muertos óptimos deben ser seleccionados por ensayo y error y dependerán de la frecuencia de muestreo, sin embargo, una buena regla general espara seleccionar un tiempo muerto que es de 2-3 muestras ^12.
8. Para comprobar que la idealización representa con precisión los datos en bruto, escanear manualmente la traza idealizada. Tras la identificación de errores en la idealización, resalte la traza sobre el evento falso, haga clic derecho y seleccionar "Unirse Idl. ' Nota: Para obtener opciones adicionales y una explicación detallada de los distintos comandos y funciones en QuB, consulte el Manual QuB línea (www.qub.buffalo.edu).

Representative Results

Recombinante receptores NMDA

Los receptores NMDA se unen y responden a la acción simultánea de dos co-agonistas: glutamato y glicina. Se reúnen como heterotetrámeros de dos subunidades de unión a glicina GluN1 y dos glutamato vinculante subunidades GluN2. GluN2 subunidades están codificadas por cuatro genes (AD) y de éstos las formas más ampliamente transcritas en el cerebro son GluN2A en adultos y GluN2B en animales jóvenes. Debido a la diversidad de los subtipos de receptores de NMDA en preparaciones nativas, que expresan los receptores en las células HEK293 (Figura 1A) permite el control de la composición de subunidades, así como la capacidad de grabar la corriente de los canales utilizando una pipeta de vidrio finamente pulido (Figura 1C).

Una vez que la pipeta toque la célula, una clara reducción de la amplitud de la forma de onda de impulso de prueba se produce (Figura 2B), lo que indica la capacidad de formar un sello. Un sello adecuado que contiene unocanal produce la actividad del canal claro, muestra como las desviaciones a la baja de la línea de base, con una buena relación señal-ruido al aplicar una tensión positiva (Figura 2C). La actividad del canal máxima para los receptores de NMDA recombinante de tipo salvaje se puede lograr cuando ambos agonistas están presentes en altas concentraciones, y cuando los inhibidores y bloqueadores de los canales están ausentes. Esto es ideal, de modo que cuando un parche contiene más de un canal, aberturas simultáneas son inmediatamente evidentes ¹³ (Figura 3B). Para las proteínas con los niveles de actividad muy bajas, la probabilidad de que un tramo de uno aberturas nivel tiene su origen en un solo canal se puede calcular si la probabilidad de apertura del canal se conoce o se puede aproximar ^14. Debido a esto, los periodos de observación más largos pueden ser necesarios.

Bajo estas condiciones, y cuando se aplica un potencial de mantenimiento de pipeta de 100 mV (que conduce a un potencial de membrana aproximada de -120 mV), SiGluN1/GluN2A recombinante ngle y GluN1/GluN2B están abiertas con una alta probabilidad (P _o, 0,3-0,5) para un nivel de conductancia relativamente alta (> 50 pS) (Figuras 3A y 5B) ^15-17. Durante la grabación, los actuales picos de ruido, derivas de línea de base, o períodos de exceso de ruido puede manifestarse (Figuras 4A-C), sin embargo, como se mencionó, estos pueden ser corregidos si breve y menor. Es importante, sin embargo, que la actividad del canal se registra ininterrumpida durante una cantidad de tiempo suficiente (≥ 10 min, 10.000 eventos) para garantizar que la amplitud completa de los comportamientos de los canales es capturado.

Los datos obtenidos a partir de dichas grabaciones pueden proporcionar información sobre la cinética de ambos canales y propiedades de permeación. Aquí, demostramos idealización realiza por QuB utilizando el algoritmo SKM (Figura 5A), sin embargo idealización de datos se puede realizar usando otros programas de software como de ordenador pClamp o SCAN ^12, unaND se puede llevar a cabo utilizando diferentes algoritmos o criterios, tales como el método de umbral medio, con cada una de estas opciones que contienen sus propias ventajas y desventajas. De montaje de estos datos a los modelos cinéticos se pueden realizar con el fin de obtener una mayor comprensión de los comportamientos de la canal iónico. Ajuste de máxima verosimilitud se puede realizar con software tal como QuB o HJCFIT ^18, en el que los algoritmos implementados por cada programa tiene sus propias ventajas. Mientras que la idealización demostrado en la Figura 5 sólo requiere el modelo más simple posible de un estado cerrado y un estado abierto a realizar, la instalación de un modelo cinético completo para un canal iónico requiere la adición secuencial cerrado y estados abierto hasta que se alcanza un cierto criterio. Este proceso ha demostrado que los receptores de tipo salvaje GluN1/GluN2A tienen cinco estados cerrados cinéticamente distintas y de dos a cuatro Estados abiertas cinéticamente distintas (Figura 5C) ^19, en la que estoscaracterísticas de activación periódica son cruciales para la determinación de la forma de la señal mediada por receptor de NMDA sináptico ^{20, 21.} Este estilo de análisis se puede extender a otros canales de iones de conductancia más pequeño, tales como los receptores AMPA, para comprender mejor a sus propios mecanismos de activación periódica distintas ^22,23,24. Una advertencia es, sin embargo, ya que los receptores AMPA tienen múltiples niveles de conductancia, idealización éxito utilizando QuB pueda requerir estados adicionales se incorporan en un modelo de pre-compilados.

Estos métodos también se pueden ampliar para obtener información sobre la permeación de los canales iónicos y la conductancia mediante la alteración de la composición de iones que impregna y / o concentración. Grabación de la actividad a través de receptores GluN1/GluN2A individuales utilizando los métodos descritos aquí, pero reemplazando de NaCl 150 mM con 75 mM de _CaCl2 en la pipeta de grabación, produce corrientes con ~ 20% de la conductancia (~ 10 ps). Esto demuestra que mientras que el calcio penetra en los receptores NMDA en hilos niveles de GH en condiciones fisiológicas, lo que realmente atraviesa el canal más lentamente que los iones de sodio, que indica que puede ser un sitio potencial de unión de calcio dentro de la vía de permeación. Además, a pesar de esta pequeña conductancia, las grabaciones pueden ser idealizadas adecuadamente utilizando el algoritmo de SKM en QuB, revelando la existencia de un subnivel de conductancia intermedia, que es alrededor del 50% de la amplitud actual del nivel de conductancia principal (Figuras 6A y B). Estas aberturas de subnivel, sin embargo, sólo pueden ser idealizadas en QuB cuando una clase de conductancia adicional se incorpora en el modelo de cinética inicial. Otros análisis cinéticos revelaron que, en estas condiciones, los receptores todavía exhibir cinco estados cerrados cinéticamente distintas, sin embargo, estos estados tienen muy diferentes constantes de tiempo y ocupaciones en comparación con cuando el canal pasa sólo iones de sodio (Figura 6C). Además, T se observaron sólo dos estados abiertonder estas condiciones que demuestran que, además de influir en la conductancia del canal, los iones de calcio son capaces de modular la activación periódica del receptor.

No hay manera determinada para obtener sólo uno parches de canal. En lugar de ello, varias manipulaciones experimentales pueden contribuir a aumentar la probabilidad de éxito. En primer lugar, el objetivo de bajo nivel de expresión de los canales mediante la evaluación de la intensidad de fluorescencia de las células transfectadas (Figura 1B). Los enfoques exitosos pueden ser para: disminuir la cantidad total de ADNc usado para la transfección o para disminuir la cantidad de cDNA para una subunidad necesaria, como es GluN1; para disminuir el tiempo de incubación con el fosfato precipitado de ADN / calcio; y para seleccionar para parchear sólo las células débilmente fluorescentes del campo de visión. Deben perseguirse Estos enfoques si los parches obtenidos con frecuencia contienen múltiples canales. Además, la disminución del tamaño de la punta de pipeta también puede contribuir a atrapar sólo un canal en el PATCh. En última instancia, sin embargo, uno se convierte en un éxito en la obtención de parches de un canal por abstenerse sistemáticamente de grabación durante largos períodos de parches que contengan claramente más de un canal.

Canales PIEZO1 recombinantes

Los métodos descritos en este protocolo se pueden aplicar fácilmente a cualquier canal de iones cerrada ligando, y de hecho se pueden adaptar para registrar una actividad de canal de cualquier canal de iones, ya sea activado por productos químicos, tensión, fuerza, temperatura, u otros medios. Un ejemplo de cómo este protocolo se puede adaptar para grabar uno corrientes de los canales de otros canales de iones, específicamente ratón PIEZO1, un canal de iones mechanosensitive, se presenta a continuación (figura 7) ^{25, 26.}

Al igual que con los canales de los receptores de NMDA, PIEZO1 y GFP se expresan en células HEK293 por fosfato de calcio y transfección mediada por células se utilizan 24-48 h después de la transfección como sedescrito en la sección 1.2. Debido a PIEZO1 se activa por estiramiento de la membrana, se debe tener cuidado para manipular la membrana suavemente durante la formación de parche y dispositivos apropiados para la entrega y el control de la fuerza mecánica aplicada debe estar disponible. Estas condiciones se pueden lograr haciendo que las pipetas de registro más grandes, con la resistencia en el rango de 2-3 MΩ y el uso de un dispositivo de abrazadera de presión de alta velocidad (HSPC) conectado a la pipeta de grabación a través de la titular de la pipeta sobre la headstage amplificador. Los ajustes del amplificador son similares a los descritos para los receptores de NMDA en la sección 3.3, a excepción de la conexión de la perilla de comando "externo" de manera que el amplificador se puede controlar a través del software de adquisición.

Para registrar la actividad de PIEZO1, utilizar una pipeta de grabación lleno de (en mM): 130 NaCl, 5 KCl, 10 HEPES, 1 de CaCl _2, 1 de MgCl _2, 10 TEA-Cl, pH 7,3 con NaOH. En estas condiciones, las aberturas pueden ser controlados como ilas corrientes de sodio nward, que aparecerán en el osciloscopio como desviaciones a la baja de una línea de base cero de corriente. Coloque la pipeta de grabación en la etapa de la cabeza del amplificador y asegúrese de que el dial en el HSPC está en cero. Antes de entrar en el baño, aplicar 3-5 mmHg de presión positiva. Usando el micromanipulador, baje la pipeta en el baño, la verificación de la resistencia de la pipeta deseada, y traer la pipeta en las proximidades de la celda seleccionada como se describe en el apartado 3.6. Toque suavemente la celda bajo la guía del microscopio y mediante la supervisión del osciloscopio, observe una ligera reducción en la amplitud de la onda de prueba de sellado de una manera similar como se hizo para los receptores NMDA (sección 3.7). Liberar rápidamente la presión positiva aplicada a través de la pipeta cambiando el nivel de mantenimiento de la presión 3-5 a 0 mmHg. Espere a que un sello GΩ para formar al monitorear la forma de onda de prueba del sello. En este caso, no se aplica ninguna presión negativa para formar un sello. Una vez que un sellado óptimo se obtiene pulse la Y# 8216;. Botón de grabación "en QuB para iniciar la adquisición de datos de la figura 7 muestra una traza representante de mPIEZO1 corrientes de un solo canal activados mediante la aplicación de -20 mmHg de presión al parche pipeta. Estas corrientes fueron de paso bajo filtrada a 2 kHz y muestreada a 20 kHz.

En contraste con los canales dependientes de ligando con dominios de unión de ligando extracelular, el estímulo activante canales mechanosensitive se puede variar de 2 protocolos. La primera es "sin huecos", donde se aplica una presión negativa constante al parche para toda la duración de la grabación. Este protocolo es útil en la obtención minutos grabaciones de larga duración y es más exitoso con estímulos menores de presión (0 a 20 mmHg), que conservan la integridad de la membrana. Actividad producida por la alta presión, que es probable que la ruptura de la membrana, se obtiene mejor con grabaciones 'episódicos', donde los pulsos de diferentes presiones se pueden aplicar para el parche para períodos de tiempo más cortos (<strong> Figura 7). Al igual que con los canales ligando cerrada, grabaciones de células unidas uno parches de canal ofrecen una gran cantidad de información con respecto tanto a la conductancia y las propiedades de compuerta del canal bajo investigación.

Neuronal receptores NMDA

El método descrito aquí para la grabación de un canal de la célula-adjunta se puede utilizar para obtener información acerca de la conductancia y las propiedades de activación periódica de canales endógena a un tipo de célula particular y / o etapa de desarrollo. Como es el caso con muchos otros canales heteroméricos, no se conoce la composición molecular exacta de los receptores de NMDA nativos. Mediante la comparación de los resultados obtenidos a partir de los receptores recombinantes de composición conocida con los obtenidos a partir de preparaciones nativas, las hipótesis acerca de la composición de subunidades y la función de los canales en su ambiente nativo se pueden formular o probado ^17.

Las neuronas fueron aisladas de prefrontalcortezas de embriones de rata y crecido en cultivo durante hasta 6 semanas ^17. Además de los componentes descritos para las grabaciones de los receptores de NMDA recombinantes en la sección 2.2, la solución de la pipeta contenía también CNQX (20 M) y bicuculina (10 M) para inhibir los receptores de AMPA y GABA nativas, respectivamente. Dependiendo de la edad del cultivo, los registros obtenidos de los receptores de NMDA nativos revelaron cinética que eran bastante diferente. Las grabaciones de principios (Figura 8A, 5 días in vitro) la cultura se asemejan más a la cinética descritos por los receptores y grabaciones GluN1/GluN2B desde finales (Figura 8B, 27 días in vitro) culturas se asemejan más a la cinética descritos por los receptores GluN1/GluN2A (Figuras 3A y 5A). Esta observación es consistente con los patrones de expresión del receptor de NMDA isoformas y con caracterizaciones cuidadosas de corrientes registradas desde teléfonos adjunta parches de un canal en la caderaculturas pocampal ^16.

Figura 1. Selección de una célula HEK293 para la grabación adjunta celular. Una) HEK293 células cultivadas en una placa de 35 mm se colocan en la platina del microscopio y vieron con contraste de fase a un aumento de 40X. B) la fluorescencia de GFP a partir del mismo campo visual como en el panel A identifica las células transfectadas. La flecha indica una célula que expresa GFP, se ve saludable, y está en una posición susceptible para el acceso de la pipeta. C) La pipeta de grabación se llevó, muy cercana a la celda seleccionada usando un manipulador de movimiento fina bajo guía visual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.

Figura 2. Celular adjunta la formación del sello. A) Una pequeña jeringa conectada a un lado del soporte de pipeta permite el control manual de la presión dentro de la pipeta. B) La corriente que pasa a través de la pipeta inmersa en el baño de solución en respuesta a la prueba de amplificador, que a 5 mV (0,5 kHz) es 18 pA, y corresponde a un tamaño de pipeta de 28 MΩ. Al tocar la célula (flecha izquierda), el nivel de la corriente disminuye observados, indicativo de aumento de la resistencia de la pipeta. La aplicación de presión negativa a través de la pipeta (flecha derecha) inicia la formación del sello y reduce la señal producida por el impulso de prueba a sólo transitorios capacitivos. C) En ausencia de un impulso de prueba, y si no se aplica voltaje a través de la pipeta (0 V), la línea de base es estable (a la izquierda de la flecha). La aplicación de un voltaje positivo (flecha, 100 mV) pr oduces corrientes unitarias estocásticos que indican aberturas de los canales. Línea punteada roja indica la línea de base cero de corriente.

. Figura 3 celulares corrientes adjuntos grabados desde los receptores GluN1/GluN2A A) de parches de un canal:. Un segmento de 50 segundos de grabación continua ilustra las aberturas de los canales a una sola amplitud uniforme B) parche de múltiples canales:. Un segmento de 50 segundos de grabación continua ilustra aberturas de los canales a dos niveles de amplitud que indica que el parche contiene al menos 2 canales activos. Línea punteada roja indica la referencia cero actual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4. Tratamiento de la información. A) Corrección de picos de ruido. Visualizar los datos sin filtrar y reemplazar manualmente la señal extraña (rojo) con la señal de la línea de base. Vista ampliada ilustra un pico antes (en el centro) y después (abajo) de la espiga (rojo) fue sustituido por la señal de referencia. B) Corrección de la deriva de la línea base. Temprano en el registro, seleccione un pequeño segmento de la línea de base y establecerlo como el nivel de corriente cero para todo el registro (línea morada). Correcta deriva de referencia mediante la selección de una pequeña parte de la deriva de línea de base (flecha) y la adición de un nodo de referencia (círculo morado). C) Los períodos más largos de registro con una situación basal ruidoso (rojo) que son difíciles de corregir se pueden eliminar. Haga clic aquí para ver la una versión más grande de esta cifra.

Figura 5. Idealización de datos. A) trazas actuales (negro) se registraron a partir de un receptor GluN1/GluN2A pasar sólo los iones de sodio con la técnica de patch-clamp de células inscritos. Puntos de datos idealizados (rojo) se ilustran para un 30 segundos de un segmento de canal. Estos se superponen bien, lo que indica que la idealización es exacta. B) Histograma de amplitudes de corriente ilustrar una distribución que está bien descrito por sólo dos funciones gaussianas con picos a cero (0,02 ± 0,8 Pa), indicativa de los eventos de los canales cerrados y en 10,3 ± 1,3 pA indicativo de un solo tipo de eventos de canal abierto para toda la duración de la grabación (130 min). C) Cerrado (izquierda) y abiertas (derecha) moran histogramas de tiempo para toda la grabación se muestra en (A). La probabilidadfunción de densidad dad de los histogramas (líneas gruesas) y componentes de cinéticos individuales (líneas finas) se superponen y se calcularon ajustando los datos a un modelo que contiene cinco estados cerrado y tres estados abierto. Inserciones proporcionan la constante de tiempo (τ) y área relativa (a) para cada uno de los componentes cinéticos individuales.

Figura 6. Corrientes de calcio a través de los receptores NMDA individuales. A) trazas de corriente (negro) se registraron a partir de un receptor GluN1/GluN2A pasar sólo los iones de calcio con la técnica de patch-clamp de células inscritos. Puntos de datos idealizados (rojo) se ilustran por 30 segmentos sec. B) Histograma de amplitudes de corriente ilustrar una distribución que está bien descrito por tres funciones gaussianas con picos en cero (0 ± 0,3 pA), indicativo de cercaeventos de canal d, 1,3 ± 0,4 pA indicativo de eventos de canal abierto a una conductancia subnivel, y 2,1 ± 0,3, indicativo de eventos de canal abierto con el nivel de conductancia principal. C) Cerrado (izquierda), el nivel de conductancia principal estado abierto (centro) y estado abierto conductancia subnivel (derecha) moran histogramas de tiempo para toda la grabación se muestra en (A). La función de densidad de probabilidad para los histogramas (líneas gruesas) y componentes de cinéticos individuales (líneas finas) se superponen y se calcularon ajustando los datos a un modelo que contiene cinco estados cerrados, dos estados principales de nivel de conductancia abiertos y un estado abierto de la conductancia subnivel. Inserciones proporcionan la constante de tiempo (τ) y área relativa (a) para cada uno de los componentes cinéticos individuales.

Figura 7. Celular adjunta una grabación del canalde mPIEZO1 expresó en células HEK293. Actividad se provoca mediante la aplicación de -20 mmHg de presión con un dispositivo de HSPC a través de la pipeta de parche, durante la aplicación constante de la tensión (80 mV). Línea punteada roja indica el nivel actual de cero.

Figura 8. Celulares unidos uno grabación del canal de los canales nativos. La pipeta se adjunta en el soma de una neurona que se disocia de la corteza prefrontal de un embrión de rata y se mantuvo en cultivo durante 5 días (A) o 27 días (B) . La actividad del receptor de NMDA continua se registró con soluciones de pipeta que contienen glutamato (1 mM) y glicina (0,1 mM), y también CNQX (20 M) y bicuculina (10 M) para inhibir los receptores de AMPA y GABA nativas, respectivamente. Actividad se obtuvo mediante la aplicación de 100 mV tediante la pipeta de grabación. Línea punteada roja indica el nivel actual de cero.

Discussion

En el campo de los canales iónicos, un área importante de la investigación se dedica a la comprensión de la secuencia de acontecimientos que conduce al canal de apertura o mecanismo de compuerta del canal. Para la mayoría de los canales, este proceso es complejo e implica varios pasos cinéticos que no se puede deducir a partir de una señal multicanal macroscópica. Por el contrario, los experimentos pueden ser diseñados, donde la observación de la secuencia de los eventos de apertura / cierre en el registro de un solo canal puede producir una información más detallada acerca de los mecanismos de gating. En los métodos descritos aquí, el dominio de unión al ligando situado externamente poseído por los receptores NMDA permite patch-clamp grabaciones mínimamente invasivas que se realizan bajo condiciones constantes. Este protocolo puede necesitar ser adaptado con el fin de ser adecuado para la investigación de otros ligandos de canales iónicos cerradas dependiendo tanto de ligando y las propiedades del receptor.

Los registros de la actividad de un solo canal proporcionan dos tipos de información valiosa. En primer lugar,porque la amplitud de la corriente unitaria se puede medir directamente, los experimentos pueden ser diseñados para obtener información acerca de las propiedades de poro tales como la conductancia del canal, la permeabilidad y la selectividad. En segundo lugar, debido a que la duración de los eventos abiertos y cerrados también se puede medir directamente a partir del registro, los experimentos pueden ser diseñados para obtener información cinética sobre compuerta y por lo tanto, hacer inferencias sobre el mecanismo de funcionamiento del canal. Para ambos tipos de experimentos, análisis estadístico significativo requiere binning cada punto individual de la traza actual a una clase de conductancia específica. Se presenta aquí fue uno de esos métodos de hacer esto, mediante el uso de las segmentarias k-medias (SKM) ¹¹ de algoritmo, sin embargo, esto se puede lograr mediante varios algoritmos más o menos sofisticados, incluyendo media-umbral, SCAN ^12, Baum-Welch, Viterbi, etcétera

Grabaciones utilizando la configuración de la celda-adjunto son poderosas en que los canales iónicos se conservan en biológicaLas membranas con entornos intracelulares no perturbadas. Debido a esto, es crucial que los sellos de membrana se forman adecuadamente y se conservan a lo largo de la grabación para dos fines: 1) Continuidad experimental y 2) el mantenimiento de una relación favorable entre señal y ruido (pico a pico de ruido de línea de base <2 pA). El tamaño y la forma de la punta de pipeta generada determina la probabilidad de un cierre hermético de membrana éxito que contiene exactamente un canal. Una punta plana asegura que cuando la pipeta se acerca la célula que va a tocar y presionar sobre la membrana celular con toda la superficie de la punta a la vez, lo que ayuda a sellar de manera uniforme sobre la célula. Una pipeta con una punta que es demasiado ancha será menos probable que resulte en parches de un canal; en contraste, al tirar una pipeta con una punta que es demasiado estrecha se traducirá en un bucle de membrana en forma de omega que puede sellar en la base y obstruir la pipeta ^10.

Una señal favorable a ruido puede ser gestionado por minimizar las fuentes de electricidadruido. La función de refrigeración headstage en el Axopatch 200B ha permitido la resolución óptima de la señal; sin embargo el ruido todavía se puede producir por cualquiera de la instrumentación involucrada en la electrofisiología de configurar, así como de fuentes externas como la luz y la electrónica no relacionados. Afortunadamente, varias estrategias se pueden implementar para minimizar el ruido a un nivel deseado ^{2, 27.} En pocas palabras, asegúrese de que las piezas de equipo que son capaces de producir ruido se basan en un único lugar para toda la instalación. Al hacer esto, es importante para evitar la formación de bucles de tierra que causará ruido significativo. Además, si el ruido de ciclo 60 está presente, asegúrese de apagar todas las luces que pueden interferir con la señal de grabación. Por último, la colocación de una jaula de Faraday alrededor del aparato para la impresión evitará obstáculos cerca de causar ruido eléctrico.

La observación de un canal durante un largo periodo de tiempo ha demostrado que la activación periódicacambios conformacionales pueden ocurrir más de una amplia gama de escalas de tiempo. Temporalmente, los datos de patch-clamp se limitan al término "corto" por el ancho de banda del amplificador y la velocidad a la que la señal amplificada se digitaliza y al final 'de largo' de la ventana de observación. Para los cambios conformacionales que son más rápidos que el límite inferior, patch-clamp grabaciones sólo pueden ofrecer información cuando se combina con enfoques experimentales complementarios. Para los cambios conformacionales que se producen con tasas muy lentas, por lo que se muestrean con poca frecuencia, se puede aumentar el número de observaciones o aumentar la duración de la grabación, sin embargo, esto no siempre es posible.

A pesar de estas limitaciones, los datos de patch-clamp, especialmente cuando se obtiene de un canal individual, a menudo contienen más información que de inmediato extraíble con metodologías computacionales actuales. Por lo tanto, la expectativa es que los futuros aumentos de la capacidad computacional y en la sophistication de algoritmos de análisis hará posibles aplicaciones adicionales. Tras la llegada de estos avances, es previsible que los patch-clamp grabaciones de canales individuales pueden ser capaces de ocurrir simultáneamente con las mediciones de FRET, imágenes de calcio o incluso en preparaciones in vivo para proporcionar más información sobre la estructura, función y dinámica de los canales iónicos en tanto en entornos nativos y controladas.

Como la diversidad de los canales iónicos investigó aumenta, la comprensión detallada de sus mecanismos de activación periódica y en última instancia, la comprensión de cómo su operación contribuye a sus funciones biológicas únicas se beneficiarán de observaciones de una sola molécula. En particular, los datos obtenidos con la promesa de un canal de patch-clamp para informar acerca de las propiedades de conductancia unitaria y secuencias de activación periódica para los canales recombinantes y nativas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1x51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1