Summary
هذه المادة سوف تظهر كيفية رصد ديناميات الجلوتامين في الخلايا الحية باستخدام الحنق. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية وسوف تناقش لأجهزة الاستشعار الجلوتامين المشفرة وراثيا.
Abstract
أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. أصبحت مجموعة متنوعة هائلة من مثل أجهزة الاستشعار عن الجزيئات البيولوجية المتاحة في السنوات ال 15 الماضية، وأصبح بعض من الأدوات التي لا غنى عنها التي يتم استخدامها بشكل روتيني في العديد من المختبرات.
واحدة من التطبيقات المثيرة من أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا هو استخدام هذه المجسات في التحقيق في عمليات النقل الخلوية. خصائص نقل مثل حركية والخصوصيات الركيزة يمكن التحقيق على المستوى الخلوي، وتوفير الإمكانيات لتحليلات محددة من أنشطة النقل خلية من نوع. في هذه المقالة، سوف نظهر كيف يمكن ملاحظة ديناميات نقل باستخدام ترميز وراثيا استشعار الجلوتامين كمثال على ذلك. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية سيتم مناقشتها.
Introduction
بسبب التقدم الملحوظ في التقنيات التي تتيح فحص Transcriptome على وبروتيوم على المستوى الخلوي، فقد أصبح من الواضح الآن أن الكيمياء الحيوية والتدفق الناتج من المركبات والأيونات هي غاية خلية من نوع معين. على سبيل المثال، في الكبد الثدييات، تتم تدهور الجلوتامين متتابعة والتوليف في وقت واحد من قبل خلايا والخلايا حول الأوعية البابية محيط بالوريد على التوالي، والتغذية الأمونيوم لدورة اليوريا في نوع من الخلايا السابقة في حين تستهلك الأمونيا الزائدة في الأخير 1-3. في بعض الحالات، تم الكشف عن عدم التجانس البيوكيميائية كبيرة حتى في واحد "نوع من الخلايا" 4، 5. بالإضافة إلى مثل هذه النوعية المكانية، ومستويات الأيض الخلوية والأيونات هي ديناميكية للغاية (على سبيل المثال، يشير الجزيئات مثل كا 2 + والنيوكليوتيدات الحلقية). الأنماط الزمانية المكانية من المركبات والأيونات غالبا ما تلعب أدوارا حاسمة في نقل الإشارة. Monitoring ديناميات الخلوية من المركبات والأيونات، ومع ذلك، تشكل تحديا فريدا من نوعه. في كثير من الحالات التغير في تركيزات هي سريعة وعابرة، والتي تجسدت في حالة إشارة الجزيئات مثل كا 2 +، والذي يضمحل داخل ~ 20 ميللي ثانية في العمود الفقري شجيري 6. بالإضافة إلى ذلك، تجزئة المسارات البيوكيميائية داخل وبين خلايا يجعل من الصعب تحديد ديناميات الأيضية والأيونات باستخدام استخراج والعمود اللوني / تقنيات قياس الطيف الكتلي.
وتستخدم الآن على نطاق واسع أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا للجزيئات البيولوجية نظرا لدقة الزمانية المكانية العالية التي يسمح للمجرب لدراسة الديناميات الجزيئية قصيرة الأجل و / أو مجزأة (مراجعة في 7 و 8). يمكن تقريبا أن تقسم هذه المجسات المشفرة وراثيا إلى فئتين؛ أجهزة الاستشعار القائم على كثافة وأجهزة الاستشعار ratiometic. تتكون أجهزة الاستشعار القائم على كثافة عادة من مجال ملزمة والانفلونزاorescent البروتين (FPS)، والمذاب ملزم إلى المجال ملزمة بتغيير شدة الفلورسنت. أجهزة الاستشعار Ratiometic، من ناحية أخرى، وغالبا ما تستفيد من نقل الطاقة الرنين فوستر (الحنق) بين اثنين من ضباط التي تعمل كزوج الحنق. تتكون هذه المجسات من مجال ملزمة واثنين من ضباط، والمذاب ملزم الحث على التغيير في الكفاءة الحنق بين ضباط اثنين. وقد تم تطوير عدد كبير من أجهزة الاستشعار لنواتج الأيض المهمة بيولوجيا والأيونات في العقد الماضي 8، 9.
واحدة من إمكانية إثارة مثل أجهزة الاستشعار التي تقدمها المشفرة وراثيا هو استخدامها في تحليل عالية الدقة من عمليات النقل الغشاء، التي كانت في السابق ليس من السهل للكشف على المستوى الخلوي. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا تسهيل تحليل آليات النقل مثل الركيزة خصوصية ودرجة الحموضة الاعتماد 10، 11. علاوة على ذلك، في تركيبة مع الدقة الوراثيةources مثل مكتبة رني يبني للكائنات النموذج، أصبح من الممكن الآن لإجراء عمليات تفتيش على نطاق الجينوم لعمليات النقل باستخدام أجهزة استشعار الرواية المرمزة وراثيا. في الواقع، واستخدام المشفرة وراثيا الرصاص استشعار لاكتشاف نقل uncharacterized سابقا في حالات متعددة 12 و 13.
في الآونة الأخيرة، وقد وضعت مختبرنا سلسلة من أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق لالجلوتامين. لقد أثبتنا أن مستويات الجلوتامين الخلوية يمكن تصور استخدام مثل أجهزة الاستشعار الحنق الجلوتامين 10. تتكون هذه المجسات من المانحين الحنق (mTFP1) إدراجها في البروتين البكتيري الجلوتامين ملزمة glnH، ومتقبل الحنق (فينوس) في C-تيرميني من glnH (الشكل 1). الحنق كفاءة هذه المجسات على خفض ملزم من الجلوتامين، مما أدى إلى انخفاض نسبة كثافة متقبل / المانحة. تنظيم عمليات النقل غرامة الجلوتامين مهم في العمليات البيولوجية مثل neurotransmission 14 و 15 و الحفاظ على دورة اليوريا في الكبد 1، 16، 17.
نحن هنا تظهر منهجية تحليل أنشطة النقل مع أجهزة الاستشعار عن الحنق الجلوتامين، وذلك باستخدام المجهر مضان واسعة المجال انشاء. الهدف من التجارب المعروضة هنا هي للكشف عن أنشطة نقل في خلية واحدة ودراسة الركيزة خصوصية لنقل أعرب عابر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد نموذج
ملاحظة: في كثير من الحالات التجارب نضح يغسل جزءا كبيرا من الخلايا، التي يمكن أن تصبح مسألة محبطة. على الرغم من أن ليس من الضروري لجميع خطوط الخلايا، الواجهات الزجاجية غطاء طلاء مع بولي-L-يسين (إضافة 1.0 سم 2 ml/25 من الحل 0.01٪ إلى السطح، واحتضان> 5 دقائق، ويغسل مرتين مع المياه خلية ثقافة الصف، وجاف في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية) يعزز التصاق الخلية. أيضا، يكون على بينة من مستوى السلامة الأحيائية (BSL) من خط الخلية المستخدمة، واتباع إجراءات التشغيل القياسية المعتمدة من قبل مكتب الصحة والسلامة البيئية المحلية. في هذه التجربة، واستخدمت خلايا cos7 بسبب انخفاض نشاط النقل الجلوتامين الذاتية (انظر الشكل 4).
- خلايا cos7 البذور في ~ 70-80٪ confluency في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ مصل العجل الكونية و 100 U / مل البنسلين / الستربتوميسين، إما على العقيمة coverslips الزجاج 25 ملم وضعت في ثقافة 6 جيداطبق أو 8 جيدا الشرائح الزجاجية القاع. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، و 100٪ الرطوبة لمدة 24 ساعة.
- تبادل المتوسطة النمو DMEM +10٪ مصل العجل الكونية (أي المضادات الحيوية)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في 100٪ الرطوبة.
- إضافة 0.4 ملغ كل من الحمض النووي البلازميد ترميز أجهزة الاستشعار الجلوتامين (pcDNA3.1، تحمل أجهزة الاستشعار FLIPQTV3.0 تحت CMV المروج 10) وASCT2 mCherry الموسومة 10-50 مل مصل خالية سائل الإعلام (OPTI-MEM) والمزيج بلطف.
- إضافة 1 مل من كاشف ترنسفكأيشن إلى 50 مل وسائل الإعلام الحرة المصل. احتضان عند RT لمدة 5 دقائق.
- مزيج من الحلين التي تحتوي على الحمض النووي (الخطوة 1.3) وكاشف ترنسفكأيشن (الخطوة 1.4)، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
- بلطف إضافة كاشف ترنسفكأيشن على الجزء العلوي من الخلايا والمزيج بلطف بواسطة هزاز الغرفة. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، و 100٪ الرطوبة.
- بعد 24 ساعة، تبادل المتوسط إلى DMEM + 10٪ مصل العجل الكونية(CCS) + 100 وحدة من البنسلين / الستربتوميسين.
- يتم تصوير الخلايا 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
2. التجربة الإرواء
ملاحظة: للحصول على خلايا cos7 المستخدمة في هذه التجربة، تم الاحتفاظ بها وسائل الإعلام ونضح غرفة على RT والمحيط CO 2 التركيز. ومع ذلك، إذا كانت الخلايا المستخدمة تتطلب أعلى درجات الحرارة وثاني أكسيد الكربون 2 تركيز الرقابة من أجل البقاء، ساخنة المرحلة المجهر و / أو غرفة البيئية التي ينبغي استخدامها.
- إعداد نضح عازلة AF (انظر قائمة المواد). نعلق الصمامات إلى 50 مل المحاقن، وإغلاق الصمامات ثم ملئها الحلول نضح. فتح محبس لفترة وجيزة لملء مساحة الرأس في محبس مع المخزن المؤقت.
- التبديل على 8 قنوات، والجاذبية تغذية نظام الارواء مع قلم رصاص التروية، ثم حدد "وضع دليل" تحت تحديد الخيار وظيفة. وضع حاوية النفايات تحت قلم نضح.
- يدوياتفعيل الموانئ عن طريق الضغط على الأرقام المقابلة وملء الأنابيب باستخدام 10 مل حقنة تحتوي على الماء، ومن ثم إغلاق المنفذ. مرة واحدة تمتلئ الموانئ مع الماء، وتعيين الحقن التي تحتوي على مخازن AF على المنفذ 1-6 من نظام التروية، ومن ثم فتح الصمامات. فتح المنافذ مرة أخرى لتحل محل المياه في الأنابيب مع المخازن المؤقتة. وينبغي أن يكون معدل تدفق حوالي 0.8 مل / دقيقة.
- الصحافة بإلغاء مرة واحدة على وحدة تحكم نضح العودة إلى القائمة "تحديد دالة". تبديل إلى "تحرير برنامج" خيار، ثم اكتب في بروتوكول أشار نضح في الجدول 1. حفظ البرنامج الارواء.
- تأخذ الخلايا من الحاضنة. يغسل مرتين مع العازلة التروية، ثم قم بتعيين الخلايا على المسرح. ربط نظام نضح إلى غرفة. إذا تم استخدام غرفة مفتوحة، وإنشاء مضخة أخرى أن يزيل الحل نضح من الغرفة.
- فتح برنامج Slidebook. بدء شريحة جديدة.
ملاحظة:الإجراء التالي هو محددة لبرنامج Slidebook، ولكن يمكن أيضا برامج أخرى مثل MetaFluor ونيس، العنصر استخدامها لنوع من التصوير وصفها هنا. نظريا التجارب لا يمكن أن يؤديها استخدام أي من البرامج التي تتيح التصوير الوقت بالطبع، وتسلسلات الصور يمكن تحليلها بعد تجريبيا باستخدام برنامج مثل يماغيج (http://rsbweb.nih.gov/ij/) أو فيجي (http:// على / fiji.sc / فيجي). ومع ذلك، والبرمجيات التي تسمح للرصد في الوقت الحقيقي من نسبة متقبل / المانحة مفيد للغاية. - جبل الشريحة على خشبة المسرح المجهر الفلورسنت. العثور على خلايا المشترك، معربا عن أجهزة الاستشعار وASCT-mCherry باستخدام مجموعات التصفية المناسب (انظر قائمة المواد) تحت وظيفة "FOCUS". ضبط مكاسب بالنقر على "كاميرا" التبويب وانزلاق شريط الانزلاق تحت عنوان "مكاسب". أيضا، وضبط الإعداد مرشح كثافة محايدة من محايد مرشح الكثافة القائمة المنسدلة. ملاحظة: إذا لم المكعب التصفية تشمل عامل تصفية العين، لا تستخدم قطعة العين منذ الشورتي الطول الموجي ضوء الإثارة هو ضار للعيون. استخدام شاشة الكمبيوتر للعثور على الخلايا بدلا من ذلك.
- الحصول على صور من الخلايا with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (يتم تحديد المرشحات في قائمة المواد). انقر فوق "التقاط صورة"، ثم في إطار اقتناء وتحديد المرشحات التي سوف يتم استخدامها. انقر فوق الزر "اختبار" لضبط الوقت التعرض عن طريق كتابة وقت التعرض المطلوب في المربع بجانب إعدادات التصفية. ملاحظة: جميع القنوات الثلاث بحاجة إلى أن يتعرض لنفس الطول. عند ضبط المعلمات التصوير، واتخاذ الحنق التغيير الكفاءة المتوقعة وأضعاف زيادة في الاعتبار: على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع كفاءة الحنق لترتفع 2 أضعاف خلال التجربة، ينبغي تعديل المعلمات التصويرلذا يجب أن تكون شدة م القابل السابقين المانحة في حالة الراحة <50٪ من القيمة القصوى التي يمكن تسجيلها من قبل الصك، حتى لا تصبح هذه القناة المشبعة أثناء التجربة. وينبغي أن يكون إشارة من الخلايا المسمى على الأقل أعلى ثلاث مرات من تلك التي في المنطقة الخلفية.
- رسم المنطقة ذات الاهتمام باستخدام أداة المناطق في البرنامج. بدلا من ذلك، وهي وظيفة البرنامج لتحديد بكسل أعلاه كثافة معينة يمكن استخدامها، ومن ثم تحويلها إلى المناطق. للقيام بذلك، انقر فوق قناع - الجزء، ثم حرك شريط انزلاق لتسليط الضوء على المناطق المطلوب.
- حدد "الفاصل الزمني" في مربع نوع إمساك، ثم حدد الفاصل الزمني (10 ثانية في هذه التجربة) والنقاط الزمنية للتجربة.
- رسم المنطقة في منطقة دون أية خلايا الفلورسنت. ويستخدم هذا المجال لطرح الخلفية. الحق فوق منطقة تعادل ومن ثم تعيينها كخلفية. ملاحظة: من الناحية المثالية، الخلايا التي توجدر معربا عن أجهزة استشعار يجب أن تستخدم المنطقة الخلفية لحساب كل من تألق ذاتي والإزهار خلفية الكشف عنها بواسطة الكاميرا. إذا لم تتوافر مثل هذه الخلايا في مجال الرأي، على الأقل في المنطقة دون الخلايا ينبغي أن تستخدم لحساب مضان الخلفية.
- حدد البرنامج المطلوب تحت عنوان "اختر وظيفة - برامج تشغيل" الخيار. تبديل لبرنامج حفظ (راجع الخطوة 2.3)، ثم ضرب على وحدة تحكم ENTER الارواء. الآن يتم تحميل البرنامج، وسوف تصل إلى أي مفتاح بدء الارواء.
- ضمان نضح وتجربة التصوير يبدأ في نفس الوقت عن طريق النقر على زر "ابدأ" في التقاط نافذة في نفس الوقت الضغط على مفتاح على وحدة تحكم الارواء.
ملاحظة: من المستحسن لتسجيل timepoint حيث تم تبادل الحلول (وهذا يمكن أن يتم ذلك باستخدام "ملاحظات" وظيفة، وجدت ضمن علامة التبويب الاستحواذ). - أداء نضح نفس البروتوكول باليودنانوغرام الخلايا معربا عن جهاز استشعار أنه من المتوقع أن تكون إما مشبعة أو غير منضم تحت شرط التجريبية.
ملاحظة: هنا، FLIPQTV3.0_1.5μ، الذي المشبعة تحت حالة تجريبية، ويستخدم كعنصر تحكم، الشكل 6 هذه التجارب السيطرة ضرورية لتأكيد أن هذا هو بسبب التغير الفعلي في الركيزة التغيير الكفاءة والحنق لا. بسبب التغير في العوامل الأخرى مثل درجة الحموضة الخلوية.
3. تحليل ما بعد التجربة
- فحص عينة إذا حدث الانجراف أثناء التجربة. رسم المناطق ذات الاهتمام (ROI) ليالي على الصورة التي اتخذت في timepoint 0، ثم حرك شريط انزلاق في الجزء العلوي من النافذة التصوير ومعرفة ما اذا كان الخلايا تسقط من رويس في الصور التي التقطت في وقت لاحق في التجربة.
- إذا كانت الإجابة بنعم، ثم استخدم وظيفة تتبع لتصحيح الانحراف من جانب أول، وخلق أقنعة حول الخلايا عن طريق تحديد قناع - الجزء، ثم حرك الخط الذي يحدد لقطع HIGhlight المناطق التي تحتوي على الخلايا. تتبع المناطق بالضغط قناع - تتبع الجسيمات - تتبع الجسيمات الأساسية.
- إعادة رسم رويس والمنطقة الخلفية عند الضرورة.
- تصدير كثافة متوسط رويس على مدى التجربة. انقر الاحصائيات - تصدير - البيانات / نسبة timelapse.
- عندما الكفاءة الحنق والكمي لتركيز الركيزة ليست ضرورية، رسم مدار الساعة من نسبة كثافة (بحكم المانحة م والقابل، / م السابقين المانحة المانحة) كوكيل لديناميات الركيزة. لتحديد تركيز عصاري خلوي، وحساب الحد الأقصى والحد الأدنى من التغيير النسبة (أي في تشبع وغياب الركيزة، على التوالي)، Δr ماكس - Δr دقيقة، من خلال الانحدار غير الخطية من Δratio (Δr) مع المعادلة التالية:
Δr = [S] / (K + د [S]) × (Δr
حيث [S] هو تركيز الركيزة في العصارة الخلوية. ويتم احتساب القيم Δr دقيقة تم الحصول عليها، والتشبع (S) من أجهزة الاستشعار في Δr على النحو - باستخدام Δr ماكس
S = (Δr - Δr دقيقة) / (Δr ماكس - دقيقة Δr)
S يمكن تحويلها إلى مزيد من تركيز الركيزة [S] باستخدام المعادلة التالية:
S = [S] / (K + د [S])
ملاحظة: يجب أن تكون كثافة القابل السابقين القابل قناة م تآمر أيضا لفحص ما إذا كانت حالة تجريبية أثرت في مضان من متقبل مباشرة. - عندما لوحظ الانجراف خط الأساس بسبب الصورة تبيض، إجراء تصحيح خط الأساس. للقيام بذلك، رسم شدة المانحة ومتقبل على مر الزمن (الشكل 5A). ثم تحديد timepoints المستخدمة في اله الأساسية، وفقا للتأخير في نظام الارواء ونشاط النقل معينة الخلية (الشكل 5B).
- حساب المناسب polynominal التي تصف أفضل خط الأساس. ثم، وتطبيع كثافة الخام من كل timepoint إلى خط الأساس (الشكل 5C). حساب نسبة كثافة (بحكم المانحة م والقابل، / م السابقين المانحة المانحة) من شدة المانحة ومتقبل تطبيع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يتم تمثيل نموذجي التجارب الوقت بالطبع في الشكل 2. في هذه التجارب، وأجهزة الاستشعار الحنق الجلوتامين مع الانتماءات من 8 ملي (FLIPQTV3.0_8m، الشكل 2A و 2B) و 100 ميكرومتر (FlipQTV3.0_100 μ C و D) والتعاون مع أعربت واجبة مبادل الأحماض الأمينية في خلايا ASCT2 18 cos7 10. تم الكشف عن تدفق الجلوتامين كما تغير في نسب كثافة مضان بين الجهات المانحة (mTFP1) ومتقبل (فينوس) (الشكل 2A و 2C). ويتجلى أيضا هروب رأس المال من الجلوتامين في وجود الركيزة أخرى (علاء) بشكل واضح في هذه التجارب. مع كل من أجهزة الاستشعار، وتغيير شدة الفلورسنت تطبيع بالتبادل (أي شدة المانحة ترتفع ما يذهب شدة متقبل أسفل، الشكل 2B و 2D) في وجود الركيزة، والتي تشير إلى أن نسبة التغيير لوحظ في الواقع بسبب رس التغير في الكفاءة الحنق. تظهر هذه التجارب أن تركيزات الجلوتامين في هذه الخلايا تتقلب بشكل حيوي للغاية في ظل حالة تجريبية؛ من اكتشاف مجموعة من 100 جهاز استشعار ميكرومتر إلى تركيز شبه تشبع لمدة 8 الاستشعار ملي.
ويمكن أيضا أن تدرس خصوصيات ركيزة من النقل باستخدام أجهزة الاستشعار، وموضح في الشكل 3. في هذه التجارب كانت خلايا محملة مسبقا مع الجلوتامين، ومن ثم تم إضافة العديد من الأحماض الأمينية إلى سائل الإرواء خارج الخلية لدراسة ما إذا كانت تلك الأحماض الأمينية يمكن أن تحدث الجلوتامين هروب رأس المال. كما هو متوقع، ركائز ASCT2 (علاء، سر، السيستئين، الثريونين، D-سيرين) الناجم عن هروب رأس المال الجلوتامين (الشكل 3A)، في حين أن الأحماض الأمينية غير الركيزة (برو، صاحب، ليز) لم (الشكل 3B)، مع مساندة الدراسات السابقة 18. عادة، يتم قياس الركيزة خصوصية كتبها المقايسات المنافسة باستخدام النظائر المسمى الركيزة الراديو مختلطة مع الركيزة المتنافسة، والتي هي شاقة إلى حد ما ويتطلب السكان من الخلايا التي يتم التعبير عن بالتساوي نقل لدراستها. التصوير الضوئي يتضح هنا يقدم نهجا بديلا.
عندما يلاحظ أي تغيرات الكفاءة الحنق على إضافة الركيزة، ويمكن النظر في عدة أسباب. أحد الأسباب المحتملة هو قدرة امتصاص منخفضة للالركيزة التي يجري اختبارها و / أو أنشطة عالية من الإنزيمات التي تحافظ على التركيز في الخلايا. على سبيل المثال، كان الجلوتامين تغير تركيز الحد الأدنى في الخلايا cos7 لا تعبر نقل ASCT2 في ظل حالة اختبار، على الرغم من هذا الخط الخلية يمكن أن تنمو بشكل واضح في وسائل الإعلام التي الجلوتامين في مصدر النيتروجين الرئيسي (الشكل 4). بالإضافة إلى ذلك، إذا تقارب من أجهزة الاستشعار هي إما عالية جدا أو منخفضة جدا بالمقارنة مع تركيز الخلايا، فإن معظم البروتينات استشعار ستظل منضمة أو غير منضمة جوهري على التوالي؛ وبالتالي سيتم د أي تغيير الكفاءة الحنقetected.
الشكل 1. تكوين جهاز استشعار الحنق الجلوتامين. (A) فتح (السماوي) واقفل (الصفراء) التشكل من glnH، الجلوتامين ملزمة البروتين من القولونية. الموقف حيث يتم إدخال mTFP1 يتم وضع علامة في أرجواني. (B) تمثيل تخطيطي من أجهزة الاستشعار FLIPQTV_3.0.
الرقم 2. في الجسم الحي باستخدام القياسات الجلوتامين FLIPQ-TV3.0_8m وأجهزة الاستشعار 100μ. (أ) نسبة venus/mTFP1 الخلايا cos7 المشترك، معربا عن استشعار FLIPQ-TV3.0_8m وASCT2-mCherry. وقد استخدم mCherry علامة لتحديد الخلايا معربا عن النقلإيه دون التدخل القنوات الانبعاثات mTFP1 أو فينوس. تم perfused الخلايا مع العازلة HEPES مخزنة هانك (درجة الحموضة 7.35). يشار إلى Timepoints عندما أضيف الجلوتامين خارج الخلية (الأحمر) وألانين (الأزرق) إلى وسائل الإعلام نضح من المربعات فوق الرسم البياني. خطوط متصلة وانطلق تمثل اثنين من الخلايا الفردية يقاس في نفس التجربة. (ب) شدة المانحة (mTFP1) ومتقبل (فينوس) قنوات في التجربة هو مبين في (A). تم تصحيح القيم ل photobleaching وتطبيع على خط الأساس (C) و (D) تجربة مماثلة كما هو الحال في (أ) و (ب)، التي أجريت مع الخلايا cos7 التعبير عن استشعار FLIPQ-TV3.0_100μ. (الشكل معدلة من 10).
الرقم 3. القضاء على الجلوتامين الخلوية رhrough الناقل ASCT2 في وجود الأحماض الأمينية الخارجية، تصور باستخدام أجهزة الاستشعار FLIPQ-TV3.0_8m. (A) ويتم تصدير الجلوتامين عصاري خلوي من خلال إضافة خارج الخلية علاء، سر، السيستئين، الثريونين، وD-سر. يشار إلى Timepoints عندما أضيفت الجلوتامين خارج الخلية (مربعات حمراء) أو الأحماض الأمينية الأخرى (مربعات زرقاء) إلى وسائل الإعلام نضح من المربعات فوق الرسم البياني. (B) إضافة برو، ليز، صاحب (المربعات السوداء) لا يغير تركيز الجلوتامين عصاري خلوي ، في حين أن إضافة علاء (مربعات زرقاء) يشجع على تصدير الجلوتامين. خطوط متصلة وانطلق تمثل اثنين من الخلايا الفردية يقاس في نفس التجربة. تم إضافة جميع الأحماض الأمينية في تركيزات 5 ملي الخارجية. (نشرت في الأصل في الشكل 10).
الشكل 4. نسبة venus/mTFP1 الخلايا cos7 هxpressing استشعار FLIPQ-TV3.0_8m (A) والاستشعار 100μ (B). تم perfused الخلايا مع HEPES مخزنة العازلة هانك. يشار إلى Timepoints عندما أضيف الجلوتامين خارج الخلية (5 ملم) إلى وسائل الإعلام نضح من المربعات الحمراء فوق الرسم البياني. خطوط متصلة وانطلق تمثل اثنين من الخلايا الفردية يقاس في نفس التجربة.
الرقم 5. تصحيح ل photobleaching. (A) شدة الخام من خليتين ممثلة في الشكل 2A و 2C. (B) Datapoints التي تم تحديدها لحساب خطوط الأساس. وتظهر منحنيات المناسب Polynominal في الشكل (C) البئرية من القنوات هو مبين في A، تطبيع ضد خط الأساس في احتساب B. مجموعة البيانات المستخدمة في هذا الرقم هو بيئة تطوير متكاملةntical لواحد هو مبين في الشكل 2A و 2C.
الرقم 6. في الجسم الحي باستخدام الاستشعار قياسات الجلوتامين FLIPQ-TV3.0_1.5m. (A) نسبة venus/mTFP1 الخلايا cos7 المشترك، معربا عن استشعار FLIPQ-TV3.0_1.5m وASCT2-mCherry. وقد استخدم علامة mCherry لتحديد الخلايا معربا عن نقل دون التدخل القنوات الانبعاثات mTFP1 أو فينوس. تم perfused الخلايا مع العازلة HEPES مخزنة هانك (درجة الحموضة 7.35). يشار إلى Timepoints عندما أضيف الجلوتامين خارج الخلية (الأحمر) وألانين (الأزرق) إلى وسائل الإعلام نضح من المربعات فوق الرسم البياني. خطوط متصلة وانطلق تمثل اثنين من الخلايا الفردية يقاس في نفس التجربة. (ب) شدة المانحة (mTFP1) ومتقبل (فينوس) قنواتفي التجربة هو مبين في (A). تم تصحيح القيم ل photobleaching وتطبيع إلى خط الأساس.
| الوقت (دقيقة) | الحل A | الحل B | الحل C | الحل D | الحل E | الحل F | |||||||
| 0 | صمام على | ||||||||||||
| 2 | صمام قبالة | صمام على | |||||||||||
| 4 | صمام على | صمام قبالة | |||||||||||
| 6 | صمام قبالة | صمام على | |||||||||||
| 8 | صمام على | صمام قبالة | 10 | صمام قبالة | صمام على | ||||||||
| 12 | صمام على | صمام قبالة | |||||||||||
| 14 | صمام قبالة | صمام على | |||||||||||
| 16 | صمام على | صمام قبالة | |||||||||||
| 18 | صمام قبالة | صمام على | |||||||||||
| 20 | صمام على | صمام قبالة | |||||||||||
| 22 | صمام قبالة | صمام على | |||||||||||
| 24 | صمام على | صمام قبالة | 26 | صمام قبالة | صمام على | ||||||||
| 28 | صمام على | صمام قبالة | |||||||||||
| 30 | صمام قبالة | صمام على | |||||||||||
| 32 | صمام على | صمام قبالة | |||||||||||
| 34 | صمام قبالة |
. الجدول 1 مثال على بروتوكول نضح المستخدمة في هذه التجربة الحل ج: 9.7 غ من الملح هانك (H1387)، 0.35 غرام NaHCO 3، 5.96 ز HEPES إلى 1 L درجة الحموضة تعديلها إلى 7.35 مع هيدروكسيد الصوديوم الحل ب: الحل A + 0.04 ملي GLN الحل C:. الحل A + 0.2 ملي GLN Solutأيون D:. الحل A + 1 ملم GLN الحل E: الحل A + 5 ملي GLN الحل F: الحل A + 5 ملي آلا
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نجاح تجارب التصوير يعتمد على عدد قليل من العوامل الهامة. واحد من هذه العوامل هو تقارب من أجهزة الاستشعار المستخدمة، كما نوقش أعلاه. التركيز المطلق من الركيزة في مقصورة التحت خلوية من الفائدة، ومع ذلك، غالبا ما يكون غير معروف. لذا نوصي تحاول أجهزة استشعار متعددة متداخلة مع الانتماءات للعثور على احد ان يعمل بشكل أفضل في ظل حالة تجريبية المطلوب. على سبيل المثال، في حالتنا نحن transfected الخلايا cos7 مع أجهزة الاستشعار الجلوتامين مع 1.5μ، 100μ، 2M، و8M (الشكل 3 والبيانات لا تظهر).
عامل مهم آخر هو مستوى التعبير عن البروتينات الاستشعار. مستوى التعبير المطلوبة للكشف تتراوح ما بين، والتجارب، على سبيل المثال، عندما يحتاج الحدث لم يدم طويلا (على سبيل المثال، إمكانية عمل واحد) التي يتعين مراعاتها يمكن أن تصبح أعلى مستوى التعبير اللازمة 19. لذلك، في معظم الحالات، على المستوى المطلوب يجب أن يكون empiricallتحديد ذ. في حالة وجود الهدف في تركيز منخفض جدا في الخلية، يمكن اضطراب العمليات الذاتية بسبب استهداف استنزاف تصبح قضية 20. مقايسة مستقلة لتقييم مثل هذا الاحتمال، إن وجدت، لذلك مرغوبا فيه. في التجارب المعروضة في هذا المقال، تم العثور على بروتين تعبير يقودها المروج CMV أن تكون كافية. في الحالات التي تحتاج المروجين مع الأنشطة أضعف بكثير لاستخدامها، قد تصبح التعديلات لزيادة شدة الإشارة اللازمة. على سبيل المثال، وسطا بين شدة الإشارة والصورة تبيض خلال التعرض بحاجة إلى أن تم التوصل إليها. بالإضافة إلى أطول وقت التعرض، وعوامل مثل مثل سطوع fluorophores، وتغير كثافة القصوى من أجهزة الاستشعار، binning، والحساسيات من كاميرا CCD يمكن تغييرها لتعزيز كثافة الإشارة.
عندما يلاحظ أي تغيير نسبة تحت شرط التجريبية على الرغم من المعيارين أعلاه من المرجح أنأن تتحقق، فمن الممكن أن التوازن الخلوية للأيض معين أو أيون قوي بما فيه الكفاية لإخفاء نشاط النقل (راجع المقطع نتيجة). في مثل هذه الحالات، وخطوط الخلايا مع الأنشطة البيوكيميائية مختلفة قد تكون مطلوبة كخلفية للكشف عن أنشطة نقل 10، 21.
بينما هذه المجسات تسمح لأحد لمراقبة ديناميات تركيز الركيزة في القرار الزمانية المكانية أعلى بكثير من الطرق القائمة على استخراج، وتحديد التركيز المطلق يتطلب مزيدا من الخطوات التجريبية والاعتبارات. عادة، يتم حساب تركيز الركيزة على افتراض أن تقارب أجهزة الاستشعار، ويحسب عادة عن طريق المعايرة البروتين استشعار النقي هو دون تغيير عندما أعرب في الخلية. يتم حساب تركيز باستخدام الأيسوثرم ملزمة واحدة التالية،
[S] K = د س (ص - ص دقيقة) / (ص <م /> ماكس - ص)
[S] هو تركيز الركيزة، K d هو التفكك المستمر تحديدها في المختبر، ص هي نسبة متقبل / المانحة لوحظ في timepoint معين، ص دقيقة هي نسبة متقبل / المانحة عند أجهزة الاستشعار في شكل الاشتقاق، وص ماكس ونسبة متقبل / المانحة عند جميع أجهزة الاستشعار منضمة إلى الركيزة. تتأثر R دقيقة وص ماكس من قبل المعلمات مثل تركيز من أجهزة الاستشعار، وإعدادات التصوير المستخدمة وتكوين milleu الخلوية، وبالتالي يجب أن تقاس في الموقع . لتحديد ص دقيقة كحد أقصى والقيم ص، الظروف التجريبية التي تسمح بتعديل تركيز الركيزة داخل الخلايا يصبح ذلك ضروريا. على سبيل المثال، ionophores انتقائية (مثل ionomycin لكا 2 +) 22 أو كاشف تثقيب مثل ديجيتونين 23 يمكن استخدامها لتتوازن تركيز الركيزة داخل الخلايا مع تركيز الخارجية.
واحدة من القيود في نوع من التجارب أثبتت في هذا البروتوكول هو الإنتاجية المنخفضة؛ يقتصر التحليل على تحليل الأيض واحد في (<10) عدد صغير نسبيا من الخلايا. وتبذل التقدم التكنولوجي، ومع ذلك، للتغلب على هذه القيود. على سبيل المثال، مع التقدم في الآلي، وفحص عالية المحتوى، أصبح من الممكن الآن لاستخدام أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا في توليفات مع جزيء صغير أو مكتبة رني؛ الخلايا معربا عن جهاز الاستشعار البيولوجي يمكن زراعتها في شكل عالية الإنتاجية (على سبيل المثال، 96 - أو 384 أيضا)، ثم يمكن علاجها الآبار الفردية مع سيرنا إما أو المواد الكيميائية وتصويرها. تسمح مثل هذه التجارب تحديد بنيات سيرنا أو المواد الكيميائية التي تعطل عملية بيولوجية التي يمكن ملاحظتها من قبل جهاز الاستشعار البيولوجي 24 25. مثيرة inclu أخرى مسبقا الأخيرةقصر تطور تدفق وقت حل ميكروفلويديك عداد الكريات، والذي يسمح الكشف عالية الإنتاجية من الحنق التغيير الكفاءة على المستوى الخلوي 26. ومثل هذه التطورات التقنية تساعد الاكتشافات المرشحين دواء جديد وعناصر جديدة في العمليات البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس هناك شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح 1R21NS064412، ومنحة جبهة الخلاص الوطني 1052048 وJeffress التذكارية تراست منحة J-908.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D.
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P.
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
