Summary
Bu makale FRET kullanarak canlı hücreler glutamin dinamiklerini izlemek için nasıl gösterecektir. Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için düşünceler genetik olarak kodlanmış glutamin sensörler için ele alınacaktır.
Abstract
Genetik olarak kodlanmış sensörler hücrealtı çözünürlükte biyolojik moleküllerin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar. Biyolojik moleküller için bu tür sensörler muazzam çeşitliliği birçok laboratuvarda rutin kullanılan vazgeçilmez araçları haline bazıları, son 15 yıl içinde kullanılabilir hale geldi.
Genetik olarak kodlanmış sensörlerin verici uygulamalarından biri hücresel nakil işlemleri araştıran bu sensörlerin kullanılmasıdır. Böyle kinetik ve zemin özgünlükleri gibi taşıyıcıların özellikleri taşımacılık faaliyetlerinin hücre tipi özel analizler için olanakları sağlayan, bir hücresel düzeyde incelenebilir. Bu yazıda, taşıyıcı dinamikleri bir örnek olarak genetik olarak kodlanmış glutamin sensörünü kullanarak görülebilir nasıl gösterecektir. Deneysel tasarım, deneysel ayarları teknik detayları ve post-deneysel analizler için hususlar ele alınacaktır.
Introduction
Nedeniyle hücresel düzeyde transcriptome ve proteomun incelenmesini sağlar teknolojilerindeki olağanüstü ilerleme için, artık biyokimya ve metabolitleri ve iyonların çıkan akı yüksek hücre türüne özgü olduğu açık hale gelmiştir. Örneğin, memeli karaciğer, ardışık glutamin bozulması ve sentez ikinci 1-3 aşırı amonyak tüketirken eski bir hücre tipinde üre döngüsü amonyum besleme sırasıyla periportal hücreleri ve perivenöz hücreleri ile aynı anda gerçekleştirilmektedir. Bazı durumlarda, önemli biyokimyasal heterojenite da tek bir "hücre tipi" 4, 5 içinde tespit edilir. Mekansal özgüllük ek olarak, metabolitlerin ve iyonların hücre seviyeleri (örneğin, Ca 2 + ve siklik nükleotidler gibi sinyal molekülleri, örneğin) son derece dinamiktir. Metabolitleri ve iyonların zamanmekansal desenler genellikle sinyal iletiminde kritik roller oynamaktadır. Mmetabolitleri ve iyonların hücre dinamikleri ZLEME Ancak, eşsiz bir meydan okuma oluşturmaktadır. Birçok durumda konsantrasyonlarda değişim hızlı ve geçici, örneğin dendritik dikenler 6 ~ 20 msn içinde azalır Ca 2 + gibi sinyal molekülleri durumunda ile örneklenmiştir. Buna ek olarak, hücreler içinde ve arasında biyokimyasal yolların bölmelere zor çıkarma ve sütun kromatografisi / kütle spektrometrisi teknikleri kullanılarak metabolitleri ve iyonların dinamiklerini ölçülmesini mümkün kılar.
Biyolojik moleküllerin için genetik olarak kodlanmış sensörler artık yaygın nedeniyle deneyci kısa ömürlü ve / veya bölümlere moleküler dinamiklerini incelemek için izin verir yüksek uzaysal çözünürlüğü için kullanılır (7 gözden, 8). Bu genetik olarak kodlanmış sensörler kabaca iki kategoriye ayrılabilir; yoğunluk-tabanlı sensörler ve ratiometic sensörler. Yoğunluk bazlı sensörler tipik olarak bir bağlama alanı ve bir grip oluşmaktadırorescent proteini (FP) ve bağlama sahasına bağlama çözünen floresan yoğunluğunu değiştirir. Ratiometic sensörler, diğer taraftan çoğu zaman bir FRET çifti olarak işlev iki FP arasında koruyucu rezonans enerji transferi (FRET) yararlanmak. Bu sensörler bir bağlama alanı ve iki FP oluşur ve bağlayıcı çözünen iki FP arasında FRET etkinliğindeki değişim olmaktadır. Biyolojik olarak önemli metabolitleri ve iyonlar için sensörler çok sayıda son on 8, 9 geliştirilmiştir.
Bu tür genetik olarak kodlanmış sensörler tarafından sunulan verici olasılığı biri daha önce hücresel düzeyde tespit etmek kolay değildi membran taşıma işlemlerinin yüksek çözünürlüklü analizi, bunların kullanılmasıdır. Genetik olarak kodlanmış sensörler, alt-tabaka özgüllüğü, pH bağımlılığı ve 10, 11 ve transport mekanizmalarını analizini kolaylaştırmak. Ayrıca, genetik res ile bir aradaRNAİ'nin kütüphane model organizmalar için inşa ources gibi, genetik olarak kodlanmış sensörleri kullanarak yeni nakil işlemleri için genom-geniş arama yapmak artık mümkün. Gerçekten de, birden çok durumda 12, 13 daha önce karakterize taşıyıcıları keşfine genetik olarak kodlanmış sensor kurşun kullanımı.
Son zamanlarda, bizim laboratuvar glutamin için FRET tabanlı sensör bir dizi geliştirdi. Biz hücresel glutamin düzeyleri gibi FRET glutamin sensörler 10 kullanılarak görüntülendi edilebilir olduğunu göstermiştir. Bu sensörler glnH arasında C-terminalleri (Şekil 1) bir bakteriyel glutamin bağlayıcı proteinin glnH içine sokulan bir FRET verici (mTFP1) ve bir alıcı FRET (venus) oluşur. Bu sensörlerin FRET etkinliği alıcı / verici yoğunluk oranının azalması ile sonuçlanan, glutamin bağlanması üzerine düşmektedir. Glutamin taşıma süreçlerinin ince düzenlenmesi gibi neurotransm gibi biyolojik süreçlerde önemliission 14, 15 ve karaciğer 1, 16, 17 üre döngüsünün bakımı.
Burada geniş bir alan floresan mikroskop set-up kullanarak, glutamin için FRET sensörleri ile taşımacılık faaliyetlerini analiz yöntemi göstermektedir. Burada gösterilen deneylerin amacı, tek bir hücrede taşıyıcı aktivitelerini tespit etmek için ve bir geçici ifade taşıyıcı alt-tabaka özgüllüğü incelemektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Numune Hazırlama
Not: Birçok durumda perfüzyon deneyleri sinir bozucu bir sorun haline, hangi hücrelerin önemli bir kısmını silsin. Poli-L-lizin ile tüm hücre hatları, kaplama, cam yüzeyler için kapak (yüzeye% 0.01 çözelti 1.0 ml/25 cm 2 eklemek gerekli değildir, ancak, hücre kültürü dereceli su ile iki kere yıkayın,> 5 dakika inkübe edilir, ve kuru biyogüvenlik kabini) hücre yapışmasını artırır. Ayrıca, kullanılan hücre hattının biyogüvenlik düzeyi (BGS) farkında olmak ve yerel çevre, sağlık ve güvenlik ofisi tarafından onaylanan standart işletim prosedürü izleyin. Bu deneyde, COS7 hücreleri (bkz. Şekil 4) bağlı olarak düşük bir endojen glutamin taşıma aktivitesi için kullanılmıştır.
- Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM) içinde% 70-80 konflüansa +% 10 kozmik buzağı serumu ve 100 U / ml penisilin / streptomisin, ya da 6-çukurlu kültür yerleştirilen steril 25 mm cam lamelleri ° 'de Tohum COS7 hücreleriçanak veya 8-iyi cam alt slaytlar. 37 ° C,% 5 CO2, 24 saat boyunca% 100 nemde inkübe edin.
- Üreticinin protokolüne göre, DMEM +% 10 kozmik buzağı serumu (no antibiyotikler) için büyüme ortamı değiştirin. % 100 nemde 37 ° C,% 5 CO2 de O / N büyütün.
- (CMV promotörü altında 10 FLIPQTV3.0 algılayıcı taşıma pcDNA3.1) glutamin sensör ve 10-50 ml serum içermeyen ortam (OPTI-MEM) mCherry-etiketli ASCT2 kodlayan 0,4 mg plasmid DNA'nın her ekleyin ve hafifçe karıştırın.
- 50 ml serumsuz ortam için transfeksiyon reaktifi 1 ml ilave edilir. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- DNA (adım 1.3) ve transfeksiyon ayıracı (adım 1.4) içeren iki çözüm karıştırın ve 20 dakika boyunca inkübe edin.
- Yavaşça hücrelerin üstünde transfeksiyon reaktifi ekleyin ve bölmeyi sallanan ile yavaşça karıştırın. 37 ° C,% 5 CO2,% 100 nemde 24 saat boyunca inkübe edin.
- 24 saat sonra, DMEM +% 10 Cosmic Buzağı Serumu için orta alışverişiPenisilin / streptomisin (CCS) + 100 birim.
- Hücreler 48-72 saat sonrası transfeksiyonunu görüntülenmiş.
2.. Perfüzyon Deney
Not: Bu deneyde kullanılan COS7 hücreleri için, ortam perfüzyon ve oda sıcaklığında tutuldu ve ortam CO2 konsantrasyonu edilmiştir. Kullanılan hücreler, yüksek sıcaklık ve CO2 konsantrasyonu kontrol hayatta kalmak için, ısıtılmış mikroskop sahne ve / veya çevresel bir odayı gerektirir, ancak, kullanılmalıdır.
- Perfüzyon tampon AF hazırlayın (Malzeme Listesi). , 50 ml şırınga stopcocks takın stopcocks kapatın perfüzyon çözümleri ile doldurun. Tampon ile vana baş boşluğu doldurmak için kısa bir süre için musluğunu açın.
- Bir perfüzyon kalem ile 8-kanal, yerçekimi beslemeli perfüzyon sistemine geçin ve sonra İşlev Seç seçeneğinin altında "Manual Mode" seçeneğini seçin. Perfüzyon kalem altında bir atık kabı yerleştirin.
- El ileilgili sayılara basarak bağlantı noktalarını etkinleştirmek ve su içeren 10 ml şırınga kullanarak borulama doldurun ve ardından bağlantı noktasını kapatın. Bağlantı noktaları su ile doldurulur sonra, perfüzyon sisteminin bağlantı 1-6 tampon AF içeren şırıngalar ayarlayın ve sonra stopcocks açın. Tamponlar ile boru içinde su yerine tekrar bağlantı noktalarını açın. Akış hızı yaklaşık 0.8 ml / min.
- Geri tuşuna basın "İşlev Seç" menüsüne gitmek için perfüzyon denetleyici kez iptal. "Düzenleme Programı" seçeneğine geçiş, daha sonra perfüzyon protokol Tablo 1'de belirtilmiştir yazın. Perfüzyon programı kaydedin.
- Kuluçka hücrelerini almak. Perfüzyon tamponu ile iki kez yıkanır ve daha sonra sahnede hücreleri ayarlayın. Bölmeye perfüzyon sistemine bağlayın. Açık bir bölme kullanılırsa, odasından perfüzyon çözeltisi kaldıran bir pompayı ayarlamak.
- Slidebook yazılımını açın. Yeni bir slayt başlatın.
Not:Aşağıdaki prosedür, Slidebook yazılımına özeldir, ancak bu MetaFluor ve Nis'te öğeli gibi diğer yazılım aynı zamanda burada tarif edilen görüntüleme türü için de kullanılabilir. Teorik deneyler zaman ders görüntüleme sağlayan herhangi bir yazılım kullanarak yapılabilir, ve görüntü dizileri gibi ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ya da Fiji gibi yazılımları kullanarak post-deneysel analiz edilebilir (http:/ / fiji.sc / Fiji). Ancak, alıcı / verici oranının gerçek zamanlı izleme sağlayan bir yazılımdır son derece yararlıdır. - Floresan mikroskop sahneye slayt monte edin. Uygun filtre setleri kullanılarak sensör ve ASCT-mCherry birlikte sentezleyen hücreleri bulmak "ODAK" fonksiyonu altında (Malzeme listesi). "Kamera" sekmesini tıklayarak ve "kazanç" altında kaydırma çubuğunu kaydırarak kazanç ayarlayın. Ayrıca, nötr yoğunluk filtresi açılır menüden nötr yoğunluk filtresi ayarını. Not: Filtre küp göz filtresi içermiyorsa, shor beri göz parçaları kullanmayınt-dalga boyu uyarım ışık gözler için zararlıdır. Yerine hücreleri bulmak için bilgisayar ekranı kullanın.
- Hücrelerin görüntülerini elde with donor ( mTFP1) ex donor(mTFP1) em , donor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em and acceptor ( mTFP1) ex acceptor(venus) em m channels (Filtreler Malzeme Listesi'nde belirtilen). "Görüntü Yakalama" tıklatın ve sonra satın alma penceresinde, kullanılan olacak olan filtreleri belirtebilirsiniz. Sonraki filtre ayarları kutuya istenen pozlama süresini yazarak pozlama süresini ayarlamak için "TEST" butonuna tıklayın. Not: Tüm üç kanalın aynı uzunluğu için açık olması gerekir. Görüntüleme parametrelerini ayarlarken, beklenen verimliliği FRET değişiklik almak ve dikkate artırmak kat: FRET verimliliği deney sırasında 2 kat gitmesi bekleniyor ise, örneğin, görüntüleme parametreleri ayarlanmalıdıro kanal deney sırasında doymuş olmaz bu yüzden dinlenme devlet Donör eski Akseptör em yoğunluğu, <aracı ile kaydedilebilir maksimum değerin% 50 olmalıdır ki. Etiketlenmiş hücrelerden sinyal arka bölgede daha en az üç kat daha yüksek olmalıdır.
- Yazılımda bölgeler aracı kullanılarak ilgi konusu bir bölge çizin. Alternatif olarak, belirli bir yoğunluk yukarıda piksel seçmek için bir yazılım fonksiyonu kullanılabilir ve daha sonra bölgeler dönüştürülür. Bunu yapmak için, Maske tıklayın - Segment, ardından istenen alanları vurgulamak için kayan çubuğu hareket ettirin.
- Yakalama tipi kutusunda "time lapse" seçin, sonra aralığını (bu deneyde 10 sn) ve deney için zaman noktaları belirtin.
- Herhangi bir floresan hücreleri olmadan bir alanda bir bölge çizin. Bu alan, arka plan çıkarma için kullanılır. Sağ çizilen bölgeyi tıklatın ve sonra bir arka plan olarak ayarlayın. Not: bir hayır vardır İdeal olarak, hücreleriSensörlerin ifade t otoflüoresanla ve kamera tarafından algılanan arka plan çiçeklenme hem de hesaba arka bölge olarak kullanılmalıdır. Böyle bir hücre, görüş alanında mevcut ise, hücrelerin olmadan en az bir bölge eşiğe hesaba katmak için kullanılmalıdır.
- Seçenek - "Run programları Select Function" altında istediğiniz programı seçin. Kayıtlı program (adım 2.3) geliniz, ve sonra perfüzyon kumanda üzerindeki ENTER tuşuna basın. Şimdi program yüklü ve herhangi bir tuşa basarak perfüzyon başlayacaktır.
- Perfüzyonu sağlamak ve görüntüleme deney perfüzyon denetleyici bir tuşa basarak aynı anda yakalama penceresinde "Başlat" düğmesini tıklayarak aynı anda başlayacak.
Not: Bu çözümler (bu satın alma sekmesi içinde bulunan "NOTLAR" fonksiyonu kullanılarak yapılabilir) alışverişinde zaman noktası kaydetmek için tavsiye edilir. - Aynı perfüzyon protokol USI gerçekleştirinDeneysel koşullar altında doymuş veya ilişkisiz ya olması beklenen bir algılayıcı ifade eden hücreleri ng.
Not: Burada, deneysel koşullar altında, doymuş FLIPQTV3.0_1.5μ, bir kontrol, Şekil 6 olarak kullanılan bu tür kontrol deneyleri FRET verim değişiklik olmayan alt-tabakanın gerçek değişim nedeniyle ve onaylamak için gereklidir. nedeniyle bu tür hücresel pH gibi diğer parametreleri değiştirmek için.
3. Post-deney Analizi
- Örnek sürüklenme deney sırasında meydana gelirse inceleyin. Faiz (ROI) Bölgeler Beraberlik timepoint 0 alınan görüntü üzerinde s, daha sonra görüntüleme penceresinin üst kısmında kayan çubuğu hareket ve hücreler deneyde sonra çekilen görüntülerde İB'nin kalkmak olmadığını kontrol edin.
- Evet, o Maskesini seçerek hücrelerinin etrafında maskeler oluşturarak, ilk olarak sürüklenme düzeltmek için izleme fonksiyonunu kullanırsanız - Segment, sonra HIG için cutoff belirten hattını kaydırınbölgeler hücreleri içeren hlight. Maskesini tıklayarak bölgeleri takip - Partikül izleme - Temel parçacık izleme.
- Gerektiğinde ROI'ler yeniden çizmek ve arka plan bölgesi.
- Deney boyunca İB'nin ortalama yoğunluğu aktarın. İstatistikler tıklayın - İhracat - Oran / timelapse veri.
- Substrat konsantrasyon FRET verimliliği ve ölçülmesi gerekli değildir iken, alt tabakanın dinamiklerinin bir vekil olarak yoğunluk oranı (Donör ex Alıcı em / Donör ex Donör em) zaman ders arsa. Sitosolik konsantrasyonunu belirlemek için, maksimal ve (sırasıyla substratın doyurma ve yokluğunda da, yani,) minimum bir değişim oranı, Ír max hesaplamak - aşağıdaki denkleme Δratio (Ír) doğrusal olmayan regresyon ile Ír min:
Ír = [S] / (Kd + [S]) x (Ír
burada [S] sitozol içinde alt-tabaka konsantrasyonudur. Ír maksimum kullanma - belirli bir Ír da sensörün Ír dakika, elde edilen değeri, doygunluk (S) olarak hesaplanır
S = (Ír - Ír dak) / (Ír max - Ír dakika)
S, bundan başka aşağıdaki denklem kullanılarak substrat konsantrasyonu [S] dönüştürülebilir:
S = [S] / (K d + [S])
Not: Alıcı ex Alıcı em kanalın yoğunluğu, aynı zamanda, deney durumu doğrudan akseptörünün floresan etkilenmiş olup olmadığını incelemek için çizilen olmalıdır. - Foto-beyazlatma için bir temel sürüklenme bakıldığında, bir temel düzeltme yapmak. Bunu yapmak için, zaman içinde verici ve alıcı arasında yoğunluklarını (Şekil 5A) arsa. Daha sonra th için kullanılan zaman noktalarında belirlenmesie taban, perfüzyon sisteminde gecikmesi ve belirli bir hücre (Şekil 5B) ve taşıma aktivitesi göre.
- En temel açıklayan bir polinominal uydurma hesaplayın. Daha sonra, taban (Şekil 5C), her bir zaman noktasında elde edilen ham yoğunluğu normalleştirmek. Normalize donör ve alıcı şiddetleri gelen yoğunluk oranı (Donör ex Alıcı em / Donör ex Donör em) hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tipik zaman süreçli deneyler, Şekil 2 de temsil edilmiştir., Bu deneylerde, 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Şekil 2A ve 2B) ve 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C ve D) afinitelere sahip glutamin FRET sensörler ile birlikte ifade edildi COS7 hücreleri 10 zorunlu bir amino asit değiştirici ASCT2 18. Glutamin akını verici (mTFP1) ile alıcı (venus) (Şekil 2A ile 2C) arasındaki flüoresan yoğunluğu oranlarında değişiklik olarak tespit edilir. Başka bir alt-tabaka (Ala) varlığında, glutamin akış aynı zamanda açık bir şekilde, bu deneylerde gösterilmiştir. Her iki sensörler ile, normalize edilmiş floresan şiddetleri gözlenen oran değiştirme gerçekten nedeniyle t olduğunu göstermektedir substrat varlığında (alıcı yoğunluğu, aşağı Şekil 2B ve 2D gider, yani verici yoğunluğu artar) karşılıklı değiştirmekFRET verimlilik değişim o. Bu deneyler, bu hücrelerde glutamin konsantrasyonu deneysel koşullar altında çok dinamik bir dalgalanma gösterir; 100 uM sensörün algılama aralığı 8 mM sensör için yakın doygunluk konsantrasyonuna.
Taşıyıcıların alt-tabaka özgüllükleri ayrıca deneylerde hücreler glutamin ile önceden yüklenmiş edildi. Şekil 3'te gösterilen sensör kullanılarak incelenebilir, ve daha sonra çeşitli amino asitler amino asitler glutamin efflux neden olup olmadığını incelemek için, hücre-dışı perfüzat ilave edildi. Beklendiği gibi, ASCT2 alt-tabakalar (Ala, Ser, Cys, Thr, D-serin) neden olduğu akış glutamin (Şekil 3 A), alt-tabaka olmayan amino asitler (Pro, His, Lys) da bu görülmemiştir (Şekil 3B) ile destekleyici önceki çalışmalar 18. Genellikle, alt-tabaka özgüllüğü rekabet alt-tabaka ile karıştırılmış bir radyo izotop etiketli substrat kullanılarak rekabet deneyleri ile ölçülür, Burada oldukça zahmetlidir ve eşit incelenmesi gereken taşıyıcı ifade hücrelerin bir popülasyonunun gerektirir. Burada örneklenen Optik görüntüleme alternatif bir yaklaşım sunmaktadır.
Herhangi bir FRET verim değişiklik substratın eklenmesi üzerine bakıldığında, birkaç nedeni olarak düşünülebilir. Olası bir nedeni, test edilen alt-tabaka ve / veya hücreler içindeki konsantrasyonunu korumak enzimlerin yüksek aktiviteleri için düşük alım kapasitesidir. Bu hücre hattı, açık bir şekilde ortam büyüyebilir bile Örneğin, glutamin konsantrasyonu değişim, test edilen koşullar altında ASCT2 taşıyıcı bildirilmemektedir COS7 hücrelerinde az olan ana nitrojen kaynağı (Şekil 4) hangi glutamin in. Sensörün afinite hücre içi konsantrasyonuna göre çok yüksek veya çok düşük olup olmadığını ya da ek olarak, sensör proteinlerin çoğu, sırasıyla yapısal olarak ilişkili veya ilişkisiz kalır; dolayısıyla hiçbir verimliliği FRET değişiklik d olacaketected.
Şekil 1. FRET glutamin sensör Yapılandırma. (A) Açık (mavi) ve glutamin E.coli bağlayıcı protein, glnH ve (sarı) yapısını kapattı. MTFP1 takılı pozisyon eflatun işaretlenir. FLIPQTV_3.0 sensörler (B) şematik gösterimleri.
Şekil 2.. FLIPQ-TV3.0_8m ve 100μ sensörlerini kullanarak in vivo glutamin ölçümleri. (A) COS7 hücreleri venus/mTFP1 oranı FLIPQ-TV3.0_8m sensörü ve ASCT2-mCherry ko-eksprese. MCherry etiket taşıma ifade eden hücreleri belirlemek için kullanılmıştırer mTFP1 veya Venüs emisyon kanal müdahale olmadan. Hücreler, HEPES-tamponlu Hank tamponu (pH 7.35) ile perfüze edildi. Hücre dışı glutamin (kırmızı) ve alanin (mavi), perfüzyon ortamına ilave edildi zaman noktalarında olarak grafiğin üstünde kutular olarak belirtilmiştir. Katı ve kesik çizgiler aynı deneyde ölçülen iki ayrı hücreleri temsil eder. (B) vericisinden (mTFP1) ve (A) 'de gösterilen deneyde alıcı (venus) kanallarının yoğunlukları. Değerler ışıkla ve başlangıç normalize için düzeltilmiştir. (C) ve (D) 'e benzer bir (A)' da deney ve (B), FLIPQ-TV3.0_100μ sensörü sentezleyen COS7 hücreleri ile gerçekleştirildi. (10 değiştirilmiş Şekil).
Hücresel glutamin t Şekil 3. ElemeDış amino asitlerin mevcudiyetinde ASCT2 taşıyıcı hrough, FLIPQ-TV3.0_8m sensörü kullanılarak görselleştirilmiştir. (A), glutamin Sitosolik hücre dışı Ala, Ser, Cys, Thr, ve D-ser eklenmesi ile ihraç edilmektedir. Pro, Lys, His (siyah kutular) hücre dışı glutamin (kırmızı kutu) ya da başka amino asitler (mavi kutu) perfüzyon ortamına ilave edildi zaman noktalarında olarak grafiğin üstünde kutular olarak belirtilmiştir. (B) eklenmesi sitosolik glutamin konsantrasyonu değiştirmez , Ala (mavi kutu) eklenmesinin glutamin ihracat teşvik ise. Katı ve kesik çizgiler aynı deneyde ölçülmek üzere, iki tek hücreleri temsil eder. Bütün amino asitler, 5 mM dış konsantrasyonlarda ilave edildi. (Şekil başlangıçta 10 yayımlanmıştır.)
Şekil 4,. COS7 hücreleri venus/mTFP1 oranı eFLIPQ-TV3.0_8m sensörü (A) ve 100μ sensörü (B) xpressing. hücreleri HEPES ile tamponlanmış Hank tamponu ile perfüze edildi. Hücre dışı glutamin (5 mM), perfüzyon ortamına ilave edildi zaman noktalarında olarak grafiğin üstünde kırmızı kutular olarak belirtilmiştir. Katı ve kesik çizgiler aynı deneyde ölçülmek üzere, iki tek hücreleri temsil eder.
Şekil 5,. Işıkla ağartma için düzeltme. (A) Şekil 2A ve 2C'de gösterilen iki hücrelerden Ham yoğunlukları. (B) taban hesaplamak için veri noktası seçildi. Polinom uygun eğrileri şekilde gösterilmiştir. A'da gösterilen kanalların (C) Parlaklıkları, normalize Bu şekilde kullanılan veri kümesi ide olduğunu B'de hesaplanan temel karşıŞekil 2A ve 2C'de gösterilen birine ntical.
Şekil 6,. FLIPQ-TV3.0_1.5m sensör kullanarak in vivo ölçümler glutamin. (A) COS7 hücreleri venus/mTFP1 oranı FLIPQ-TV3.0_1.5m sensörü ve ASCT2-mCherry ko-eksprese. MCherry etiket mTFP1 veya venus emisyon kanal engel olmadan taşıyıcı ifade eden hücreleri belirlemek için kullanıldı. Hücreler, HEPES-tamponlu Hank tamponu (pH 7.35) ile perfüze edildi. Hücre dışı glutamin (kırmızı) ve alanin (mavi), perfüzyon ortamına ilave edildi zaman noktalarında olarak grafiğin üstünde kutular olarak belirtilmiştir. Katı ve kesik çizgiler aynı deneyde ölçülen iki ayrı hücreleri temsil eder. (B) verici yoğunlukları (mTFP1) ve akseptör (venus) kanallarını(A) 'de gösterilen deneyde. Değerler ışıkla ve başlangıç normalize için düzeltilmiştir.
| Süresi (dk) | Çözelti A | Çözüm B | Çözüm C | Çözüm D | Çözüm E | Çözüm F | |||||||
| 0 | üzerinde vana | ||||||||||||
| 2 | off valf | üzerinde vana | |||||||||||
| 4 | üzerinde vana | off valf | |||||||||||
| 6 | off valf | üzerinde vana | |||||||||||
| 8 | üzerinde vana | off valf | 10 | off valf | üzerinde vana | ||||||||
| 12 | üzerinde vana | off valf | |||||||||||
| 14 | off valf | üzerinde vana | |||||||||||
| 16 | üzerinde vana | off valf | |||||||||||
| 18 | off valf | üzerinde vana | |||||||||||
| 20 | üzerinde vana | off valf | |||||||||||
| 22 | off valf | üzerinde vana | |||||||||||
| 24 | üzerinde vana | off valf | 26 | off valf | üzerinde vana | ||||||||
| 28 | üzerinde vana | off valf | |||||||||||
| 30 | off valf | üzerinde vana | |||||||||||
| 32 | üzerinde vana | off valf | |||||||||||
| 34 | off valf |
.. Çözüm Bu deneyde kullanılan perfüzyon protokolü Tablo 1 Örnek:. 9.7 g Hank tuzu (H1387), 0.35 g 3 NaHCO, 1 L pH 5.96 g HEPES NaOH solüsyonu B ile 7.35 'e ayarlandı: Çözelti A + 0.04 mM Gln Çözüm C:.. Çözüm A + 0,2 mM GIn Solutiyon D:. Çözüm A + 1 mM Gln Çözüm E:. Çözüm A + 5 mM GIn Çözüm F: Çözüm A + 5 mM Ala
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Görüntüleme deneylerin başarısı birkaç kritik faktöre bağlıdır. Bu faktörlerden biri yukarıda ele alındığı gibi, kullanılan sensörlerin eğilimidir. Ilgi konusu hücre içi bölme içindeki alt-tabakanın mutlak konsantrasyon, ancak, genellikle bilinmemektedir. Bu nedenle arzu edilen deneysel koşul altında en uygun olanı bulmak için kaydırılmış afinitelerle çoklu sensör denemenizi öneririz. Örneğin, bizim durumumuzda 1.5μ ile glutamin sensörleri ile transfekte edilmiş COS7 hücreleri, 100μ, 2m ve 8m (Şekil 3 ve gösterilmeyen veri).
Bir diğer önemli faktör sensor proteinlerin ekspresyon seviyesidir. Kısa süreli bir olayın (örneğin, tek bir eylem potansiyeli) daha yüksek bir ifade seviyesi 19 gerekli olabileceği görülmektedir gereken zaman tespiti için gerekli olan ekspresyon seviyesi Örneğin, deneyler arasında değişir. Bu yüzden, çoğu durumda, gerekli olan seviye empiricall olması gerekiry belirlenmiştir. Hedef hücre içinde çok düşük bir konsantrasyonda mevcut olması durumunda, hedef tükenmesi nedeniyle endojen süreçlerin pertürbasyon bir sorun 20 olabilir. Bu olasılığı değerlendirmek için bağımsız bir deney, mevcut ise, arzu edilen bir durumdur. Bu makalede gösterilen deneylerde, CMV promotörü ile tahrik edilen protein ekspresyonu yeterli olduğu bulunmuştur. Daha zayıf faaliyetleri ile promoterler kullanılması gereken durumlarda, sinyal yoğunluklarını artırmak için düzeltmeler gerekli olabilir. Örneğin, pozlama sırasında sinyal yoğunluğu ve foto-ağartma arasında uzlaşma gerekir. Pozlama süresi daha uzun ek olarak, bu tür florofor parlaklık, sensör, binning maksimum yoğunluk değişikliği ve CCD kamera hassasiyetleri gibi faktörler sinyal şiddetini arttırmak için değiştirilebilir.
Yukarıdaki iki kriter olasılığı olsa bile hiçbir oran değiştirme deneysel koşul altında bakıldığındakarşılanması, bu verilen metaboliti veya iyon için hücresel homeostasis (sonuç bölümüne bakınız) ulaşım faaliyetlerini maskelemek için yeterince güçlü olması mümkündür. Bu gibi durumlarda, farklı biyokimyasal faaliyetlerle hücre hatları taşıyıcı faaliyetleri 10, 21 tespit etmek için bir arka plan olarak gerekli olabilir.
Bu sensörler bir ekstraksiyon bazlı yöntemler çok daha yüksek uzaysal çözünürlük substrat konsantrasyonu dinamiklerini izlemek için izin verirken, mutlak konsantrasyonunun belirlenmesi ayrıca deneysel adımlar ve koşulları gerektirir. Genellikle, alt tabaka konsantrasyonu hücresinde eksprese edildiği zaman, genellikle, saflaştırılmış protein sensör titre hesaplanmıştır sensörün yakınlık, değişmemiş olduğu varsayılarak hesaplanır. Konsantrasyonu, aşağıdaki tek bir bağlanma izotermini kullanılarak hesaplanır,
[S] = Kd x (r - r dakika) / (r </ Em> max - r)
[S] Kd, in vitro olarak belirlenir ayrışma sabitidir, alt-tabaka konsantrasyonudur, r, belirli bir zaman noktasında gözlemlenen alıcı / verici oranı, sensörler apo formunda olduğunda dakika alıcı / verici oranı r ve r max Bütün sensörler substrata bağlı olduğu zaman, alıcı / verici oranı. R min ve R max bu sensörlerin içeriği, kullanılan görüntüleme ayarları ve hücresel milleu bileşimine ve bu nedenle yerinde ölçülebilir gerekir gibi parametreler tarafından etkilenir olduğunu . hücre içi substrat konsantrasyonu değişiklik zorunlu hale sağlar r min ve r max değerlerini, deneysel koşullarını belirlemek için. Örneğin, seçici 22, iyonoforlar veya di gibi bir perfore bir reaktif (örn., Ca 2 + ve iyonomisin)gitonin 23 dış konsantrasyonu ile hücre içi substrat konsantrasyonu denge sağlaması için kullanılabilir.
Bu protokolde gösterilen deney türü sınırlamalar biri düşük bir kapasiteye sahip olmasıdır; Analiz hücrelerin nispeten küçük (<10) sayısında bir metabolitini analiz sınırlıdır. Teknolojik gelişmeler bu tür sınırlamaları aşmak için, ancak, yapılıyor. Örneğin, otomatik, yüksek içerik tarama ilerlemesi ile, küçük molekül ya da RNAi kütüphane ile kombinasyon genetik olarak kodlanmış sensörleri kullanmak mümkündür; Bir biyosensör ifade eden hücreler, bir yüksek verimli bir biçimde (örneğin, 96 - veya 384-well) yetiştirilebilir, daha sonra tek tek kuyu siRNA veya kimyasal ya ile muamele edilmiş ve görüntülenebilir. Bu tür deneyler biyosensör 24 25 tarafından görülebilir biyolojik sürecini bozabilir SiRNA yapıları veya kimyasal tanımlanmasını sağlar. Bir başka heyecan verici yeni gelişme includes bir hücresel düzeyde 26 de verimliliği FRET değişim, yüksek verimli algılanmasını sağlar sitometresiyle zaman çözümlü mikroakışkan akışının geliştirilmesi. Bu tür teknik gelişmeler yeni ilaç adayları ve biyolojik süreçlerde yeni bileşenlerin keşifler yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe 1R21NS064412, NSF hibe 1052048 ve Jeffress Memorial Trust hibe J-908 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus | IX81F-3-5 | An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate. |
| Excitation filter (mTFP1) | Omega Optical | 3RD450-460 | Band width 450-460 nm |
| Excitation filter (Venus) | Chroma | ET500/20 | Band width 490-510 nm |
| Emission filter (mTFP1) | Chroma | HQ495/30m | Band width 475-505 nm |
| Emission filter (Venus) | Chroma | ET535/30m | Band width 520-550 nm |
| Dichroic mirror (FRET channels) | Chroma | 470dcxr | Long pass, 470 nm cut off |
| Dichroic mirror (YFP channel) | Chroma | 89002bs | Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm |
| mCherry filter set | Chroma | 49008 | Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm |
| Light source | Olympus | U-LH100L-3-5 | LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended |
| CCD camera | Qimaging | Rolera-MGi EMCCD | |
| Apochromatic fluorescence objective | Olympus | ||
| Perfusion system, ValveBank II | AutoMate Scientific | [01-08] | Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work |
| Laminar-flow chambers | C&L Instruments | VC-MPC-TW | Other larminar-flow chambers would also work. |
| Chambered slide | Lab-Tek | 154534 | For open-chamber experiments |
| Perfusion pump | Thermo Scientific | 74-046-12131 | For open-chamber experiments |
| Software supporting ratiometric measurements | Intellegenent Imaging Innovation | Slidebook 5.5 | |
| Laminar flow biosafety cabinet | ESCO | LA-3A2 | |
| Isotemp CO2 Incubator | Thermo Scientific | 13-255-25 | |
| Dulbecco's MEM (DMEM) | Hyclone | SH30243.01 | |
| Cosmic calf serum | Hyclone | SH3008703 | |
| Penicillin/streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I) | Invitrogen | 31985 | Used with Lipofectamine 2000 |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma | P4707 | |
| 25 mm circular glass cover slips | Thermo Scientific | 12-545-102 | In case VC-MPC-TW is used |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668027 | Other transfection reagents can also be used. |
| Solution A (Hank's buffer) | 9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH | ||
| Solution B | Solution A + 0.04 mM Gln | ||
| Solution C | Solution A + 0.2 mM Gln | ||
| Solution D | Solution A + 1 mM Gln | ||
| Solution E | Solution A + 5 mM Gln | ||
| Solution F | Solution A + 5 mM Ala |
References
- Haussinger, D. Regulation of hepatic ammonia metabolism: the intercellular glutamine cycle. Adv Enzyme Regul. 25, 159-180 (1986).
- Haussinger, D.
- Watford, M., Chellaraj, V., Ismat, A., Brown, P., Raman, P.
- Mustroph, A., et al. Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci USA. 106, 18843-18848 (2009).
- Sasagawa, Y., et al. Quartz-Seq: a highly reproducible and sensitive single-cell RNA sequencing method, reveals non-genetic gene-expression heterogeneity. Genome Biol. 14, R31 (2013).
- Sabatini, B. L., Oertner, T. G., Svoboda, K. The life cycle of Ca(2+) ions in dendritic spines. Neuron. 33, 439-452 (2002).
- Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative imaging with fluorescent biosensors. Annu Rev Plant Biol. 63, 663-706 (2012).
- Newman, R. H., Fosbrink, M. D., Zhang, J. Genetically encodable fluorescent biosensors for tracking signaling dynamics in living cells. Chemical reviews. , 111-3666 (2011).
- Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr Opin Biotech. 21, 45-54 (2010).
- Gruenwald, K., et al. Visualization of glutamine transporter activities in living cells using genetically encoded glutamine sensors. PLoS One. 7, e38591 (2012).
- Chaudhuri, B., et al. Protonophore- and pH-insensitive glucose and sucrose accumulation detected by FRET nanosensors in Arabidopsis root tips. Plant Journal. 56, 948-962 (2008).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499, 295-300 (2013).
- Jiang, D. W., Zhao, L. L., Clapham, D. E. Genome-Wide RNAi Screen Identifies Letm1 as a Mitochondrial Ca2+/H+ Antiporter. Science. , 326-147 (2009).
- Barnett, N. L., Pow, D. V., Robinson, S. R. Inhibition of Muller cell glutamine synthetase rapidly impairs the retinal response to light. Glia. 30, 64-73 (2000).
- Rothstein, J. D., Tabakoff, B. Alteration of Striatal Glutamate Release after Glutamine-Synthetase Inhibition. J Neurochem. 43, 1438-1446 (1984).
- Gu, S., Villegas, C. J., Jiang, J. X. Differential regulation of amino acid transporter SNAT3 by insulin in hepatocytes. J Biol Chem. 280, 26055-26062 (2005).
- Palmada, M., Speil, A., Jeyaraj, S., Bohmer, C., Lang, F. The serine/threonine kinases SGK1, 3 and PKB stimulate the amino acid transporter ASCT2. Biochem Bioph Res Co. 331, 272-277 (2005).
- Bröer, A., et al. The astroglial ASCT2 amino acid transporter as a mediator of glutamine efflux. J Neurochem. 73, 2184-2194 (1999).
- Wallace, D. J., et al. Single-spike detection in vitro and in vivo with a genetic Ca2+ sensor. Nature. 5, 797-804 (2008).
- Haugh, J. M. Live-cell fluorescence microscopy with molecular biosensors: what are we really measuring. Biophys J. 102, 2003-2011 (2012).
- San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PLoS One. 8, e57712 (2013).
- Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Measuring calcium signaling using genetically targetable fluorescent indicators. Nat Protoc. 1, 1057-1065 (2006).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. Embo Rep. 5, 1176-1180 (2004).
- Joseph, J., Seervi, M., Sobhan, P. K., Retnabai, S. T. High throughput ratio imaging to profile caspase activity: potential application in multiparameter high content apoptosis analysis and drug screening. PLoS One. 6, e20114 (2011).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
- Ma, H., Gibson, E. A., Dittmer, P. J., Jimenez, R., Palmer, A. E. High-throughput examination of fluorescence resonance energy transfer-detected metal-ion response in mammalian cells. J Am Chem Soc. 134, 2488-2491 (2012).
