Protocol
Alla animaliska förfaranden som beskrivs i detta protokoll genomfördes i enlighet med de riktlinjer för vård och användning av försöksdjur och har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUCs) vid Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.
1. Aspiration av benmärg (BM) Celler från lårbenet
- Bedöva musen som kommer att genomgå lårbens benmärg aspiration med isofluran (1-4%) som administreras med en precision Vaporizer. Djup av anestesi bör kontrolleras varje 5-10 min under hela förfarandet med att konstatera att det inte finns någon förändring i andningsfrekvensen i samband med kirurgisk manipulation och / eller öra, tå, och svans nypa. Anestesi induceras med isofluran och även upprätthållas under hela förfarandet med isofluran. En förebyggande före förfarande dos av buprenorfin i en dos av 0,05-0,1 mg / kg subkutant varje 6-12 h kan användas för att förhindra smärta i samband med det förfarande som ett adjunct till Karprofen.
- Applicera oftalmologiska salva till ögonen på musen efter induktion av anestesi för att förhindra hornhinnan torkning.
- Pälsen är noggrant klippt från ett område av hud ungefär 150% större än arean av den avsedda aspiration stället. Lös päls avlägsnas med en fuktig gasväv. Vänligen håll musen på en cirkulerande varmvatten pad eller annan säker termostatstyrd yta för att förhindra hypotermi under förfarandet.
- Desinficera hela benet innehållande lårbenet som kommer att genomgå aspiration med tre uppsättningar av alternerande skurar (alternerande med antingen en povidon-jod (Betadine) eller ett klorhexidin (Nolvasan) skrubba och 70% isopropylalkohol eller 70% etanol indränkt gasbinda svampar).
- Blöt en 0,5 ml tuberkulinspruta (volym: 0,5 cm ^; spårvidd: 27,5 G) med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) innan utsugning av BM. Fyll sprutan med 200-500 pl av PBS och omedelbart utvisa PBS. Upprepa denna procedur 2-3 tIME-program.
- Håll skenbenet böjt från lårbenet genom att trycka på skenbenet med antingen ringfingret eller lillfingret. Bekräfta att ett lämpligt bedövningsmedel plan har uppnåtts. Sprutan hålls med hjälp av tummen och pekfingret. Detta medger att kondylerna att exponeras och underlättar införandet av nålen.
- Efter blöta sprutan, för in nålen genom knäskålssenan så att nålen är ordentligt lämnats in mellan de två kondyler av lårbenet. Genom att hålla diafys nära epifysen av lårbenet med tummen och pekfingret, är nålen införd i axeln hos lårbenet lätt.
- Sväng nålen utåt och uppåt så att den är parallell med axeln hos lårbenet. Denna åtgärd underlättar hämtning av benmärgs innehåll från lårbenet axeln.
- Vrid nålen medurs och moturs samtidigt som du trycker den långsamt i lårbensmärghålan. Bekräfta rätt placering av nålen genom att försiktigt flytta syRinge sidled.
- Dra försiktigt nålen kolven tillbaka, skapar undertryck, medan nålen rör sig fram och tillbaka i BM hålighet. Obs: Volymen BM aspire kommer att vara cirka 5 l som normalt motsvarar 0,4-0,8 x 10 6 mononukleära celler. Framgångsrik aspiration bekräftas visuellt genom uppträdandet av blod i den övre delen av nålen i botten av sprutan. Om inget blod syns i sprutan är det troligt att ett litet ben eller vävnad fragment har fastnat i nålen. Detta kan tas bort från nålen genom att föra kolven upp och ned i PBS (detta är en anledning till att sprutan ska förfylld med PBS före aspirera BM). Om vävnaden inte kan rubbas ur sprutan, använd en ny nål och spruta (igen blöta sprutan med 200-500 pl PBS).
- När BM framgångsrikt sugs från lårbenet, ta ut nålen och sprutan från lårbenet och mus.
- Flytta aspire BM till ett mikrofugrör prefilled med 500 ^ il PBS. För de flesta tillämpningar bör de BM-celler sedan förvaras på is tills vidare behandling om möjligt.
- Efter slutförandet av förfarandet, administrera smärtstillande med karprofen 5 mg / kg subkutant. Ta sedan bort musen från anestesi och placera på en uppvärmd dyna tills helt återhämtat sig. OBS: Det bör inte finnas någon komplikation eller ångest upplevs efter aspirationsförfarandet om det görs på rätt sätt.
- Innan han återvände möss till bostadsområdet, se till att de kan pendla och nå mat och vatten. Beakta mössen med avseende på tecken på stress eller infektion efter proceduren i nästa 24 timmar. Tecken inkluderar: konstant blödning, anemi, letargi. Om något av dessa tecken syns efter förfarande, bör djuret (s) avlivas. OBS: BM aspiration / provtagning kan upprepas men repetitionsförfarandet bör utföras på motsatt lårbenet för att förhindra upprepade trauma på samma ben. Det finns inte mycket information om frequency att BM aspiration kan utföras. Lårbens benmärg aspiration allmänhet upprepas inte oftare än var 2 veckor.
2. Bedömning av Cell-innehåll i Aspirerad BM celler
- Pellets celler som hämtas från BM aspiration och placera i ett mikrofugrör genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C eller rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och sedan återsuspendera pelleten i 500 | il av ACK för röda blodkroppar lyseringsbuffert ("ammonium-klorid-kalium" lyseringsbuffert).
- Inkubera cellerna i rött cell-lys-buffert under 10 minuter och tillsätt sedan 1 ml PBS och centrifugera ner blandningen på nytt vid 300 x g under 5 min vid 4 ° C eller rumstemperatur. OBS: Den röda blodkroppar lyseras pellets består nu av BM mononukleära celler. Dessa kan suspenderas för FACS färgning, cellräkning, transplantation, cytospin analys och / eller annan användning (precis som BM celler skördas från offrade möss skulle användas).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Femoral BM aspiration av en levande C57/B6-mus utnyttjades för att erhålla BM mononukleära celler följt av konventionell BM skörd av samma mus efter avlivning. BM mononukleära celler som erhålls med de två metoderna analyserades sedan genom (1) cytologisk analys av BM-celler, (2) att bestämma den relativa frekvensen av hematopoietiska stam / progenitorceller (HSPCs) och (3) ex vivo-kultur av sorterade HSPCs. I det senare experimentet, linjenegativa Sca1 + c-KIT + (LSK) celler sorterades från mononukleära celler erhållna genom BM aspiration samt från konventionell BM skörd. 150 LSK celler erhållna genom varje metod ströks därefter ut i metylcellulosa halvfasta media innehållande myeloid-erytroid cytokiner för 7 dagar i teknisk duplikat. De data som visas i figur 1 A, B belyser att likartade typer och proportioner av bulkkroppar och HSPCs sågs av morfologiska och flödescytometrisk analys med användning av antingen femorala BM aspiration eller konventionell BM skörd.
För att kvantitativt bestämma andelen LSK och myeloida stamceller ses med konventionell benmärgsskörden jämfört lårbens benmärg aspiration, vi jämförde andelen LSK och MP delpopulationer som en frekvens av totala levande celler i 3 oberoende ambitioner och konventionella märg skördar. Denna information, som visas i figur 1C, visar en minskning i LSK och MP subpopulationer från benmärg som samlats in av lårbens aspiration jämfört med konventionell märg skörd (även om denna skillnad var inte statistiskt signifikant för någon population).
Sortering av LSK celler följt av ex vivo-kultur i metylcellulosa resulterade i liknande antalet kolonier och celltyper som erhållits genom femoral benmärg aspiration och konventionell BM skörd (såsom visas i figur 1D). De kolonityper som observerats och uppräknade inkluderar CFU-GEMM (den granulocyt, erytrocyter, monocyter, megakaryocyte kolonibildande enhet), CFU-GM (granulocyt, monocyt-kolonibildande enhet) och BFU-E (erytroid burst-bildande enhet).
Figur 1. Lårbens benmärg (BM) aspiration i levande möss för att underlätta undersökningen av märg innehållet utan uppoffring av möss. (A) Wright Giemsa färgade cytospins av mononukleära celler som erhållits genom BM aspiration av levande möss. Cirka 0,4 till 0,8 x 10 6 mononukleära celler kan erhållas i varje enskilt femorala aspiration. Visas här är oftast märgen innehållet i vildtyp 6 veckor gammal C57/B6 möss som erhållits genom lårbens BM aspiration (höger) jämfört med konventionella cellisolering BM genom offret av möss (till vänster) (skal stapel representerar 10 mikrometer). (B) Femoral BM aspiration ger ett tillräckligt antal celler för att bedömalingen av det hematopoetiska stam / progenitorceller facket enligt bilden här (Höger: celler från BM aspirera, Vänster: celler som erhållits genom skörd av märg från offrade möss). Lineage negativa Sca-1 + c-kit + (LSK) celler innehållande hematopoietiska stamceller såväl som linjenegativa Sca-1-c-Kit + myeloida stamceller och deras undertyper som definieras av CD34 och FcyR expression analyserades (moder grind lever , linjenegativa celler). Procentandelarna avser procent av celler inom gate. (C) Kvantifiering av LSK (celler, myeloida progenitorceller (MP)-celler, vanliga myeloida stamceller (linjenegativa Sca-1-c-Kit + CD34 + FcyR mellanliggande +), granulocyt-makrofag-föregångarceller (linjenegativa Sca-1-c-Kit + CD34 + FcyR +) och megakaryocyt-erytroida progenitorceller (linjenegativa Sca-1-c-Kit + CD34-FcyR-), i en frekvens av levande celler från konventionell märgskörd (n = 3) och lårbens benmärg aspiration (n = 3). felstaplar representerar standard dekortning. (D) Representativa fotografier av metylcellulosa koloni assayresultat en vecka efter plätering av 150 LSK celler i myeloid / erytroid innehåller metylcellulosa (ovan) och antal och typer av kolonier som observerats med hjälp av LSK celler från varje metod. De kolonityper som observerats och uppräknade inkluderar CFU-GEMM (den granulocyt, erytrocyter, monocyter, megakaryocyt kolonibildande enhet), CFU-GM (den granulocyt, monocyter kolonibildande enhet), och BFU-E (erytroid brast bildande enhet). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Serie BM aspiration är ett rutinförfarande avgörande för klinisk undersökning av hematologiska sjukdomar hos människor. Förmågan att utföra en analog serie provtagning av BM i möss för karakterisering av cellulära sammansättning och beståndsdelar i BM hela långa experiment är också mycket värdefullt. Detta förfarande är användbart för karakterisering av HSPC s utan att offra musen utan också för att påvisa förekomst av ytterligare celltyper i BM i fall där innehållet i perifert blod inte kan vara reflekterande av cellerna som bor i BM. Serial BM aspiration har använts mycket effektivt för detta senare ändamål i övervakningen av förekomsten av mänskliga celler xenografted till nedsatt immunförsvar möss till exempel 3. Med tanke på att 0,4-0,8 x 10 6 celler är oftast hämtas med varje BM aspiration, kan dessa celler användas för en rad ändamål, inklusive cytologisk analys (figur 1 A), diagnostiska flödescytometri (figur 1B), flödescytometrisk cellseparation, följt av längre nedströms användning av sorterade celler inklusive kultur av celler (Figur 1C), nukleinsyra extraktion, proteinutvinning för analyser inriktade proteomik karakterisering av ett begränsat antal cell, och ännu längre transplantation extraherad celler. På samma gång är det viktigt att notera att antalet HSCs hämtas i varje femoral aspiration begränsas av det totala antalet celler som hämtats i detta förfarande. Till exempel, med tanke på definitionen av HSCs som linjenegativa Sca1 + ckit + CD150 + CD48-CD244-celler, är frekvensen hos HSCs cirka 10 HSCs/100, 000 celler 7. Baserat på denna frekvens, är cirka 40-80 HSCs förväntas hämtas med varje aspirationsförfarandet. Dessutom, såsom noteras i Figur 1C, är frekvensen hos LSK och progenitorceller lägre, om än inte når statistisk signifikans, i ben marrow celler som erhållits via lårbens benmärg aspiration jämfört med konventionell benmärgs skörd. Vi tror att denna relativa minskning i LSK och stamfader frekvensen ses med aspirations förhållande till kirurgisk benmärgsskörden är relaterad till förorening med perifert blod som uppstår med lårbens benmärg aspiration. Dessa begränsningar av lårbens benmärg aspiration vid utvärdering av sällsynta cellpopulationer i märgen bör noteras. En kompletterande anmärkning är att vi vanligtvis har utfört denna procedur i möss av 6 veckors ålder eller äldre. Vi anser att detta förfarande skulle vara allt mer tekniskt utmanande med möss yngre än 6 veckor.
Denna teknik är också väl lämpad att bedöma chimerism av BM i motsats till den perifera blodet i samband med ett pågående konkurrens beredning experiment. I dessa analyser är den funktionella potentialen av HSC: s från en experimentell uppsättning av möss testas mot en uppsättning känt antal HSC &# 8217, s med avläsningen är perifert blod chimerism samt chimerism av HSC: s (se recension av Purton m.fl. 8.). Chimerismen av det perifera blodet kan kontrast från chimerism i BM om störningar som påverkar hematopoetiska stamceller resulterar i försämrad differentiering av HSPC s till mogna cirkulerande blodkroppar. Med tanke på att slutgiltiga blodbildningen inte är etablerad förrän minst 16 veckor efter transplantation 9 och att chimerism kan ändras efter ännu längre tidsperioder 10, tekniker som underlättar tidigare tillgång till HSPC facket såsom visas på bilderna kan vara särskilt användbart. I ett färskt exempel, konkurrenskraftig transplantation av BM-celler från möss med homozygot postnatal radering av Dnmt3a av Challen et al. Visade minskad chimerism från Dnmt3a-null möss i perifert blod, men en paradoxal ökning av HSC chimerism av Dnmt3a-Null HSC: s på BM 11. Detta resultat var ett tecken på en differentiering defekt Dnmt3a - / - HSC: s trots en ökning av självförnyelse. Dessutom var detta resultat ses endast vid tidsoffer mottagande transplanterade möss i serie konkurrenskraftiga transplantationsexperiment med intervall på 16 veckor. Därför analyser som möjliggör provtagning av BM celler parallellt med perifert blod utan att kräva uppoffringar av mössen och möjliggör kontinuerlig observation av möss är ganska bra.
Som nämnts tidigare, är den teknik som demonstreras här liknar den teknik som används för intrafemoral injektion direkt in i märghålan utrymmet av möss 2,3. Direkt intrafemoral injektionen har visat sig vara mycket användbart för att underlätta mänskliga xenograftstudier på möss, där det har visat sig ge förbättrad engraftment i direkt jämförelse med intravenös injektion 6,12,13. Denna teknik har även tillåtaed för identifiering av tidigare okänd klass av snabbt fylla mänskliga HSCs.
För närvarande är det inte känt huruvida upprepad provtagning av BM i möss genom samma lårbenet påverkar den cellulära sammansättningen av BM eller antalet märgceller som hämtats med upprepade strävanden. Dessutom är den minsta tid tillrådligt att utföra återkommande aspirations procedurer från samma lårbenet inte känd. När du utför upprepade lårbensbenmärgs ambitioner i samma mus, alternera lårbenet används för BM aspiration och utföra seriella BM aspirat i intervall på> 2 veckor. Det krävs ytterligare insatser inriktade på att förstå de potentiella effekterna, om några, av serielårbens BM aspirationsförfaranden i möss med jämna mellanrum om de typer och antal celler som hämtas från BM eller arkitektur av BM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PBS | PAA | H15-002 | |
| Bovine serum albumin | PAA | K41-001 | |
| ACK lysis buffer | Homemade | in 1 L. Adjust pH 7.2 ~ 7.4 and filter sterile with 0.22 μm vacuum filter. | |
| 8.3 g Ammonium chloride | Fisher Scientific | A661-500 | |
| 1 g Potassium bicarbonate | Fisher Scientific | P184-500 | |
| 200 μl 0.5 M EDTA pH 8 | Gibco | 15575-038 | |
| RPMI 1640 | PAA | E15-842 | |
| 0.5 ml Tuberculin syringe 27.5 G | Becton Dickinson | 305620 | |
| Sterile cell strainer 70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| Isoflurane, USP | Attane | NDC:66794-014-25 | |
| Blunt-end needle | Stemcell Technologies | 28110 | |
| PrecisionGlide needle 23 G | Becton Dickinson | 305193 | |
| 3 ml Syringe Luer-Lok tip | Becton Dickinson | 309657 | |
| Non-tissue culture treated plate, 6 Well | Becton Dickinson | 351146 | |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes | Becton Dickinson | 352054 | FACS staining |
| 12 x 75 mm 5 ml tubes with cell-strainer cap | Becton Dickinson | 352235 | FACS staining |
| NK1.1 APC-Cy7 | Biolegend | 108723 | |
| CD11b APC-Cy7 | Biolegend | 101225 | |
| CD45R (B220) APC-Cy7 | Biolegend | 103223 | |
| CD3 APC-Cy7 | Biolegend | 100222 | |
| Ly-6G and Ly-6C (Gr-1) APC-Cy7 | Biolegend | 108423 | |
| Ter119 APC-Cy7 | Biolegend | 116223 | |
| CD19 APC-Cy7 | Biolegend | 302217 | |
| CD4 APC-Cy7 | BioLegend | 317417 | |
| CD117 (c-KIT) PE | BioLegend | 105808 | |
| Ly-6A/E (Sca-1) PE-Cy7 | Biolegend | 122513 | |
| CD34 APC | Biolegend | 128612 | |
| CD16/32 e450 | eBioscience | 48-0161-82 | |
| DAPI (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) | Sigma-Aldrich | 32670 | |
| MethoCult GF M3434 | STEMCELLTECHNOLOGIES | 3434 | For methocellulose culture |
| Carprofen | Crescent Chemical Company | C11045850 | 1 dose (5mg/kg) |
| Flow cytometer, LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Puralube vet ointment (sterile petrolatum ophthalmic ointment) | Dechra-US | 17033-211-38 |
References
- Sundberg, R., Hodgson, R. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, 557-561 (1949).
- Schmitz, M., Bourquin, J. -P., Bornhauser, B. C. Alternative technique for intrafemoral injection and bone marrow sampling in mouse transplant models. Leukemia & lymphoma. 52, 1806-1808 (2011).
- Warner, J. K., et al. Direct evidence for cooperating genetic events in the leukemic transformation of normal human hematopoietic cells. Leukemia. 19, 1794-1805 (2005).
- Chiu, P. P., Jiang, H., Dick, J. E. Leukemia-initiating cells in human T-lymphoblastic leukemia exhibit glucocorticoid resistance. Blood. 116, 5268-5279 (2010).
- Guan, Y., Gerhard, B., Hogge, D. E. Detection, isolation, and stimulation of quiescent primitive leukemic progenitor cells from patients with acute myeloid leukemia (AML). Blood. 101, 3142-3149 (2003).
- Nolta, J. A. The gold standard improves: a better assay for HSCs. Blood. 106, 1141-1142 (2005).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121, 1109-1121 (2005).
- Purton, L., Scadden, D. Limiting factors in murine hematopoietic stem cell assays. Cell stem cell. 1, 263-270 (2007).
- Dykstra, B., et al. Long-term propagation of distinct hematopoietic differentiation programs in vivo. Cell stem cell. 1, 218-229 (2007).
- Jordan, C., Lemischka, I. Clonal and systemic analysis of long-term hematopoiesis in the mouse. Genes & development. 4, 220-232 (1990).
- Challen, G., et al. Dnmt3a is essential for hematopoietic stem cell differentiation. Nature genetics. 44, 23-31 (2012).
- Hess, D. A., et al. Selection based on CD133 and high aldehyde dehydrogenase activity isolates long-term reconstituting human hematopoietic stem cells. Blood. 107, 2162-2169 (2006).
- Mazurier, F., Doedens, M., Gan, O. I., Dick, J. E. Rapid myeloerythroid repopulation after intrafemoral transplantation of NOD-SCID mice reveals a new class of human stem cells. Nat Med. 9, 959-963 (2003).
