Summary
SIVQ-LCM은 레이저 캡처의 microdissection (LCM) 프로세스를 구동하는, 컴퓨터 알고리즘 공간적 불변 벡터 양자화 (SIVQ)를 마구 혁신적인 접근법이다. SIVQ-LCM의 흐름은 크게 연구와 임상 모두에서 응용 프로그램과 함께, 미세 절제의 속도와 정확성을 향상시킵니다.
Abstract
SIVQ-LCM은 자동화하고 전통적인, 사용자에 의존하는 레이저 해부 과정을 간소화 새로운 방법론이다. 그것에는 진보, 신속하게 사용자 정의 레이저 해부 플랫폼 기술을 만드는 것을 목표로하고있다. 이보고에서는, ArcturusXT 기기에 이미지 분석 소프트웨어 공간적 불변 벡터 양자화 (SIVQ)의 통합을 설명한다. ArcturusXT 시스템은 특정 세포 또는 넓은 지역의 해부를 허용, 적외선 (IR) 및 자외선 (UV) 레이저 모두 포함되어 있습니다. 주된 목표는 속도, 정확도, 및 샘플 처리량을 증가시키는 레이저 절개의 재현성을 향상시키는 것이다. 이 새로운 접근 방식은 동물 연구와 임상 워크 플로우에있는 인체 조직 모두의 미세 절제를 용이하게한다.
Introduction
원래 1990 년대 중반에 개발 된 레이저 캡처 미세 절제 (LCM)는 정밀 현미경 시각화 1, 2를 통해 조직 학적 조직 섹션에서 특정 셀 또는 셀 영역을 캡처 할 수 있도록합니다. 조직 부스러기 대 LCM의 분자량 분석을 비교하는 많은 연구 방법 3-12의 값을 나타낸다. 또한, 13, 14를 볼 사용할 수있는 기술에 대한 3 개의 비디오 프로토콜 출판물이있다. 관심의 대상이 이종 조직 절편 때, 또는 세포의 큰 숫자가 같은 단백질 체학과 같은 특정 다운 스트림 응용 프로그램에 필요한에있는 분산 된 세포 집단이다 그러나, 검증 된 값에도 불구하고, LCM은 지루하고 힘든 될 수 있습니다. 인간의 연산자에 배치 부담이 LCM 공정 (15)를 안내하는 강력한 이미지 분석 알고리즘을 결합하여 LCM을위한 반자동 절개 접근법을 개발하기 위해 우리를 안내했다.
<미시간 대학과 공동으로 P 클래스 = "jove_content">, NIH에서 우리 연구소 확장 이전에 개발에 고유의 조직 선택 과정을 반 자동화 할 수 있도록하는 방식으로 공간적으로 불변 벡터 양자화 (SIVQ) 알고리즘을보고 따라서 마음의 병리학 자 또는 생명 과학자와 함께 사용할 수있는 도구를 만들고, 미세 절제를 유도. 공간적으로 불변 벡터 양자화 (SIVQ) 사용자가 단순히 통계 임계 값을 조정, 전체 조직 학적 이미지를 검색하는 데 사용할 수있는 반지 벡터 (술어 이미지 기능)을 만들 관심의 조직 학적 특징에 "클릭"할 수있는 알고리즘 로 16-21했습니다. 결과 열 맵은 초기 조건의 이미지 기능에 경기의 질을 표시하고 이후 단일 색상 LCM 악기로 가져올 수 있습니다 (빨간색) 주석지도로 변환된다. 자동 선택 소프트웨어, AutoScanXT은 다음을 기준으로지도를 그리는 데 사용되는SIVQ의 주석이 조직 샘플에서 표적 세포의 포착을 안내하기에. 아래의 자세한 프로토콜은 미세 절제 워크 플로우에 SIVQ의 구현을 설명합니다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
기술 된 프로토콜은 인간 조직 샘플의 사용에 관한 NIH 규칙에 따라 사용 하였다.
1. 조직 준비
- 이전 처음으로, 임상 시험 심사위원회 (IRB) 프로토콜에 따라 인간의 조직 표본을 구하십시오.
- 조직 / 세포 블록의 유형 및 대응 처리 방법 [냉동 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 (FFPE), 또는 에탄올 고정 파라핀 (EFPE)]를 선택합니다. 포르말린 고정 에탄올 고정 및 플래시 냉동 한 다음, 최적의 조직학을 제공합니다. 그러나, 고정 조직 처리 방법은 DNA, RNA 및 단백질 양 및 하류 분자 분석을위한 품질에 영향을 미칠 수 있으며 고려되어야한다.
- 선택의 슬라이드 타입 (유리, 막 유리, 금속 프레임 막) 상에 조직 / 셀 블록 섹션을 잘라. SIVQ 분석은 세 가지 슬라이드 타입에 동일하게 작동합니다. 주의하시기 바랍니다 의사의 coverslip 방법 크실렌과 에단 (아래에 설명)슬라이드가 무대에 반전해야하기 때문에 올 금속 프레임 막 슬라이드에 수행 할 수 없습니다.
- 배경에서 관심의 세포를 식별하는 화학 물질 또는 IHC 기반 조직 얼룩을 선택합니다. 그 염색 방법은 또한 DNA, RNA 및 단백질 품질과 조직의 양에 영향을 미칠 수 있습니다. 프로토콜을 진행하기 전에 생체 분자의 초기 품질을 평가하기 위해 염색 후 조직을 테스트합니다. DAB (15), 면역, 빠른 빨강, 드 노보 빨강, 파랑 톨루이딘, 헤 마톡 실린과 에오신 (H & E) (게시되지 않은 데이터)과 면역 조직 화학 (IHC) : SIVQ-LCM은 염색 조직 / 세포 검사 슬라이드에 수행되었습니다.
2. 표본 영상
- 로드 미세 절제 장비의 자동화 단계에 슬라이드 및 관련 소프트웨어를 실행합니다. 로드 슬라이드의 위치를 지정하고 캡처 한 이미지 파일을 JPEG 형식으로 저장 될 수 있도록 확인란을 선택합니다.
- 메신저를 최적화연령 매뉴얼 포커스 휠 또는 절개를 통해 기기의 소프트웨어를 사용하여, 스크린에 이미지의 밝기와 초점을 조절함으로써 품질.
- 해부 기기의 소프트웨어 내에서 이미지 도구를 사용하여 적절하게 램프 밝기와 카메라 게인을 설정합니다. 값의 예는 확산기와, 휘도 = (60) 및 게인 = 220이다.
- 수동으로 또는 소프트웨어의 자동 초점 기능으로 초점을 맞 춥니 다.
- 박리 과정에 대한 로드맵을 제공하는 슬라이드의 썸네일 개요 이미지를 캡처.
- uncoverslipped 슬라이드의 최적의 이미지 품질을 위해 악기의 콘덴서 아래의 확산을 이용하거나, 내화 지수 (의사 커버 슬립)을 개선하기 위해 에탄올, 자일 렌 하나의 작은 양 (~ 30 μL)를 추가합니다. 크실렌을 사용하는 경우, 흄 후드와 보호 실험실 코트, 보안경 및 장갑의 사용을 포함하여, 그들이 독성 및 적절한 안전 대책을 사용해야되어 인식.
- 에탄올, 자일 렌 용액이 완전히 삭제되거나 캡의 중합체가 왜곡 될 때까지 슬라이드의 LCM 캡을 씌우지 마십시오.
- 10X, 20X, 또는 40 배 배율로 해부 할 영역의 슬라이드와 이미지를 캡처 이동합니다. 필요한 경우, 이전에 22 설명 등 (마이크로 소프트 오피스 이미지 관리자) 자동 고침과 같은 소프트웨어를 사용하여 이미지를 향상시킬 수 있습니다. 이미지들을 자동 선택 소프트웨어로 다시 가져올 수 있도록 JPEG 형식으로 캡처해야합니다.
이미지 3. 알고리즘 분석
- 전송 SIVQ 폴더로 미세 절제 기기에서 이미지를 캡처. 설치 및 해부 기기에 연결된 컴퓨터에 ArcturusXT, 자동 스캔 및 SIVQ 소프트웨어 패키지를 엽니 다. SIVQ 소프트웨어에 액세스 할 경우, 박사 율리시스 Balis (ulysses@med.umich.edu)에 문의하시기 바랍니다.
- 열기 SIVQ과 캡쳐 된 이미지의 관심 (JPEG)을로드합니다. </ 리>
- 관심 영역으로 이동 및 / 또는 디스플레이 창 (뷰포트 5 & 6)의 크기를 조정합니다. SIVQ 소프트웨어에서 뷰포트 5는 사전 처리 된 이미지를 도시하고 뷰포트 6은 후 처리 된 이미지 (16)를 나타낸다.
- 반지 벡터와 사용하는 링의 수의 크기를 선택합니다.
- 뷰포트 6에서 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 캡처 할 수있는 조건 이미지 기능을 선택합니다.
- 이미지를 분석하는 "검색"을 클릭합니다.
- 두 슬라이드 막대를 사용하여 이미지 일치의 통계적 확률을 조정합니다. 상단 표시 줄에 전체 벡터 특이성을 조정하고 (선택한 "합계"변수에 의해 정의 된 감도) 과도한 포함 영역을 나타낼 수가 초기 검사에서 영역을 제외하는 데 사용됩니다. 반대로, 낮은 슬라이더 스캔이 수행 된 후 매치 것으로 분류된다 증가 영역의 의도로, 감도를 증가시키기 위해 이용된다. 이러한 슬라이더 컨트롤은 모두 요로 감염초기 기준 감도 임계 값으로 LIZE "합계"변수.
- 이미지를 저장하기 위해 (이미지는 현재 C :/ vq_test 폴더 / 갤러리에 저장됩니다) "JPEG로 저장"을 클릭합니다.
- 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석합니다. 알고리즘 분석의 출력은 SIVQ-LCM에 사용하는 주석 화상 초래할 필요가있다. 현재, SIVQ 코어 엔진의 현재 버전은 전체 생산 판 (가능한 Q1 2014)의 단순화 된 통합 전체 소프트웨어 개발 키트 (SDK) 및 애플리케이션 프로그래밍 인터페이스 (API)를 통합 할 것이란 가정 베타 버전 테스트입니다 사용자 생성 공간 필터 및 코어 링 매칭 엔진과 하류 플로 데이터 처리 단계. 이 SDK는 문서의 완전한 세트와 함께 배포됩니다.
- SIVQ의 히트 맵이 균일 한 붉은 색으로 변경되어 있는지 확인합니다.
- 이미지를 내 보냅니다. 그것은 P의 위치 좌표를 다시 삽입하는 것이 필수적입니다원래 해부 악기 이미지에서 파일 헤더에 붙여 HEX 편집기를 사용하여 OST 분석의 JPEG 이미지. 해당 데이터는 "영상의 시작"마커 (를 0xFF, 0xD8)와 제 "양자화 테이블을 정의"마커 (를 0xFF, 0xDB) 사이에서 발견 할 수있다.
4. 미세 절제
- 이미지가 SIVQ 분석에 캡처 된 관심 영역의 중심에 LCM 뚜껑을 놓습니다.
- 보정 및 품질 관리 (QC) UV / IR 레이저와 전력, 기간, 레이저의 위치 및 (제조업체에서 권장하는) UV 절단 속도 등의 매개 변수를 최적화 할 수 있습니다. 분석 된 이미지를 다시 가져 오기 전에이 교정을 수행합니다.
- 오픈 AutoScanXT (자동 선택 소프트웨어) 및 C :/ vq_test 폴더 / 갤러리에서 분석 된 이미지를 가져옵니다.
- SIVQ 주석을 인식하고 해부지도를 만들 수있는 자동화 된 선택 소프트웨어를 교육합니다.
- TRAI를 만들려면닝 파일 SIVQ 분석 이미지의 "빨간 페인트"를 ( "블루 원 '으로 표시) 그 4 개의 영역을 선택합니다.
- 해부 할 수 없습니다 ( "빨간색 사각형"로 표시) 배경 영역을 선택합니다.
- 이후의 사용을 위해 저장 될 수있는 교육 파일을 생성하려면 "분석"버튼을 클릭합니다.
- 적절한 적외선 (IR) 및 / 또는 자외선 (UV) 레이저를 이용하여 미세 절제를 수행합니다.
- "라이브"이미지에 선택된 영역을 복사합니다.
- "microdissect"도구 상자에서 적절한 IR 캡처 또는 UV 커팅 버튼을 선택합니다.
- 박리가 완료되면, QC 역 LCM 캡을 이동하고 해부 조직 / 세포의 이미지를 캡처. 또 다른 방법은 이전의 QC 역으로 이동하는 슬라이드의 빈 영역에 뚜껑을 배치하는 것입니다, 이것은 사용자가 다양한 배율의 사진을 촬영 할 수 있습니다.
- 더 효율을 올려 평가하는 미세 절제 한 후 그 조직 영역의 이미지를 캡처합니다.
- 원하는 세포가 성공적으로 해부 한 경우, ArcturusXT 소프트웨어의 "현재 단계"버튼을 클릭 스트림 분석을위한 분자 추출 과정을 시작하기 위해 LCM 캡을 제거합니다.
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Representative Results
FFPE 인간의 유방 조직 섹션은 표준 IHC 프로토콜 23을 사용 AE1/AE3를 아세포 면역 염색 하였다. 염색 후, 조직 슬라이드 ArcturusXT 스테이지 상에 배치하고, 전술 한 바와 같이 SIVQ-LCM 프로토콜이 개시되었다. 조직이 미세 절제를위한 coverslipped 할 수는 없으므로, IHC 염색 된 세포 + 외형 (도 1a)를 분별하기 어렵다. 따라서, 더 나은 인덱스 매칭 및 개선 된 이미지를 제공하기 위해, 크실렌은 의사 - 커버 슬립 (15) (도 1B)를 만들기 위해 조직 절편에 첨가 하였다. JPEG 이미지는 다음 의사 coverslipped 영역의 캡처 및 알고리즘 분석을위한 SIVQ으로 수입되었다. 사용자가 선택한 조건 이미지 기능 (어두운 갈색 DAB의 얼룩) 이미지 (그림 1C)을 분석 할 수 SIVQ 알고리즘을 시작했다. SIVQ의 히트 맵은 다음 자동 선택 소프트웨어 (그림 1에 의해 인식되는 "빨간 페인트"로 변환 된D). 자일 렌은 증발 허용하고, SIVQ의 히트 맵이 자동으로 선택 소프트웨어 (그림 1E)로 가져온 강조 표시된 셀은 IR 레이저로 해부했다. LCM 캡은 다음 ArcturusXT 장비의 품질 관리 스테이션으로 이동하고 시각적으로 해부 효율 (그림 1 층)을 평가하기 위해 검사를했다. 나머지 조직은 검사 하였다 (그림 1G)과 SIVQ의 히트 맵이 더 미세 절제 효율 (그림 1H)을 평가하기 위해 다시 가져 왔습니다.
IHC의 그림 1. SIVQ-LCM은 FFPE 유방 조직을 스테인드. 패널 A의 A) 아세포 AE1/AE3의 Uncoverslipped 이미지 FFPE 유방 조직을 스테인드. B) 자일 렌 코팅 (의사 coverslipped) 이미지
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Discussion
우리는 FFPE 인간의 유방 조직에서 면역 염색 상피 세포를 microdissect하는 SIVQ-LCM의 응용 프로그램에 대한 프로토콜을 제시한다. 그러한 SIVQ 같은 이미지 분석 알고리즘의 사용은, 실습의 microdissection 처리에 요구되는 시간을 감소시킨다. 작업자의 시간과 노력은 일반적으로 그 세포의 정확한 해부 대한 속도 제한 단계이기 때문에이 필드에 대한 잠재적으로 중요한 발전이다. 그것은 가능성이 아니라 다른 상업적으로 이용 가능한 미세 절제 장비에 SIVQ과 다른 알고리즘을 적용 할 수있을 것입니다하지만, 본 프로토콜에서는, 우리는 특별히 ArcturusXT 계기로 우리의 절차를 적용. 효율을 향상시킬뿐 아니라,이 새로운 방법은 비 - 병리학 전문가 사용자는 미세 절제를 수행 할 수있다. 최종적으로, 미세 절제 프로세스를 구동 알고리즘의 사용은 O 식별 세포에서 사용자 주관성을 제거하여 사이트 간에서보다 재현성을 가능하게 할 수있다 F 관심.
SIVQ 조직학 포함한 화상 본안의 여러 클래스로 확장 적응성을 나타내고 있지만, 그것은, 그것이 보편적 화상 처리 / 분할 도구의 역할을하도록 의도되지 않은 것을 인식하는 것이 중요하다 아니라 고효율 제 통과 전경 선택뿐만 도구입니다. 이 용량에서 사용, 그것은 이미지의 주제의 특정 클래스가 수치 분할 방식에 적합한 지 여부를 예측하는 높은 실용성을 가지고 있습니다. )보다 세련되고 대상 이미지 분석 / 분할 방식은 매우 성공적으로 될 것입니다 및 / 또는 b) 최적화, 기계 선택 SIVQ 벡터 렌더링에 효과적 일 것입니다 임상 : SIVQ이 성공하면 높은 예측 능력 중 하나가 워크 플로 솔루션을 준비. 어느 상황에서, SIVQ의 사용은 전경 segmentability 측면에서 계산적으로 취급 용이 한 솔루션을 포즈 이미징 요지를 식별하는 효과적인 triaging 도구로서 기능한다.
우리는 이전에 단지 mRNA 발현 마이크로 어레이 실험 15 SIVQ-LCM 프로토콜의 사용을 설명하지만 ntent ">, 우리는 프로토콜을 가장 하류 분자 분석에 적용 가능하고, 전지를 다수 필요로 분자 분석에 특히 유용 할 수있다 믿는다 그러한 프로테오믹스 같이. 이들 연구의 경우, 세포를 대량으로 인해 단백질을 증폭하는 무능력을 조달 할 필요가있다. 또, 차세대 시퀀싱 (NGS)와 같은 새로운 기술의 출현 등으로 시작하는 필요성을 강조 가능한 샘플의 순수. 두 형태 학적 특징 및 / 또는 염색 품질을 통해 세포를 분리하기 SIVQ-LCM위한 능력은 더 쉽게 순수한 세포 집단을 분리하는 기능을 활성화 할 수 있습니다.그것은 SIVQ 분석과 미세 절제 모두 재현 결과를 제대로 준비 조직을 가지고하는 것이 중요합니다. LCM을위한 최적의 조건은 습도가 낮은 방에서 해부를 수행하고 제대로 dehy 유지하는 것이 가장 좋습니다조직을 drated. 또한, 조직의 염색이 재현되도록. 마지막으로, 절개 악기와 친숙 성공 SIVQ-LCM에 필수적이다.
여기에 제시된 SIVQ-LCM 프로토콜은 현재 절개 방법은 많은 워크로드를 처리 할 수있는 간단하지 않기 때문에 미래의 임상 시험에서 응용 프로그램이있을 수 있습니다 반자동 미세 절제, 향한 첫 번째 단계입니다. 요약하면, 우리는 SIVQ-LCM은 자동화 된 미세 절제의 필드에 새로운 입성이며 조사자 및 알고리즘 개발자는 상기 기술을 향상시킬 수있는 출발점을 제공한다고 믿는다.
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Disclosures
마이클 R. Emmert 벅 레이저 캡처 미세 절제를 포함하는 NIH 개최 특허에 발명자이며 NIH 기술 이전 프로그램을 통해 로열티 기반의 지불을받습니다.
Acknowledgments
연구는 건강의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램, 국립 암 연구소, 암 연구 센터에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
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