Summary
蜂窝三维电子显微镜的瓶颈是特征提取（分割）的高度复杂的三维密度图。我们已经制定了一套标准，这对于提供指导的分割方式（手动，半自动或自动）最适合于不同的数据类型，从而提供了一个起点，有效区隔。
Abstract
现代三维电子显微镜的方法最近已允许前所未有的洞察的细胞和组织的三维组织超微结构，从而实现了大的大分子机，如粘合性复合物，以及较高阶结构，如细胞骨架和细胞器的可视化的各自的细胞和组织的上下文。定细胞体积的固有的复杂性，有必要先提取，以允许可视化，量化，并因此理解他们的三维组织的所关注的特征。每个数据集由不同的特性的数据， 例如 ，信号与噪声比，脆性（清晰度）中所定义，其特征拥挤的特征，存在或不存在的特征的形状，使其易于识别的，并且百分数异质感兴趣的特定区域占据了整个体积。所有这些特征需要考虑决定时，其方法采取分割。
通过三种不同的成像获得提出的六种不同的三维超微结构数据集方法：树脂嵌入彩色电子断层扫描，聚焦离子波束和串行块面朝扫描电子显微镜（FIB-SEM，SBF-SEM）的轻度染色和大量的染色样品的分别。对这些数据集，四个不同的分割方法已被应用：（1）完全手工建立模型随后仅由模型的可视化，（2）手动跟踪接着面绘制的数据的分割，（3）的半自动化方法遵循通过表面绘制，或（4）自动定制设计的分割算法后表面绘制和定量分析。取决于数据集的特性的组合，我们发现这四个类别的方法典型地是一个优于其它的，但依赖于标准的确切序列，莫重比的一种方法可以是成功的。基于这些数据，我们建议将其归类两个目标数据集的特性和主观个人准则的不同数据集的分析分流方案。
Introduction
传统上，电子显微镜（EM）场被分为1）使用高和超高分辨率透射电子显微镜的结构生物学分支，通常是结合隐式或显式的数据平均化，调查大分子复合物的三维（3D）结构定义的组合物和典型地为相对小的尺寸1-4，和2），其中整个细胞的风景可视化1,5,6蜂窝成像分支。而结构生物学的分支已经发生了惊人的发展，在过去的四十年中，细胞生物学分支多限于两个维度，经常在低于最佳保存的样品。只有在电子断层扫描，在过去十年中出现了细胞生物学超微结构成像扩展到第三维5,7，这里通常均不能作为细胞的风景，因此感兴趣的功能进行的，通常是唯一的。
虽然可视蜂窝场景常常是惊人的眼睛，所关注和这样高度复杂的细胞体积的后续定量分析的特征有效地提取落后，部分是因为精确的蛋白质组合物，通常是未知的，因此使得它具有挑战性解释这些蜂窝3D卷。至目前为止，广泛的生物学专长通常需要以解释复杂的断层图像，或者甚至以确定在3D体积的重要区域和基本组分。作为进一步的复杂化，3D卷可视化是非常不平凡的。三维体积可以被看作和由此显现为堆叠的2D图像。连续的二维图像的切片通过切片检查减少了复杂性，但它也限制了特征提取，从而定量分析的两个维度。然而，对于大多数的3D对象，3D体积的描绘仅仅是一个堆栈的连续面导致的不完全的ð倾斜角度为特定系统的3D特性。视力检查的替代模式要求无论是体绘制和面绘制，其中，给予细胞的往往密集性质体积很容易导致嵌套对象的阻挠观点或完全压倒用户，从而使交互式手动分割困难。
来补救这些障碍，大量的各种自动化的特征提取（分割）方法已经被发展为通常或者密度-或基于梯度的8-10。然而，这些方法倾向于段的整个容积而不管哪个区或特征是感兴趣的专家，虽然最近的一些方法可以针对感兴趣的特定特征，如肌动蛋白丝11。此外，在执行自动分段的程序有时导致产生了大量的子体积的（ 例如 ，施加分水岭观鱼时Ñ分割），通常需要手动回合并成包含整个感兴趣的功能或进行进一步分割。这也适用于特别复杂和拥挤的数据集，从而最渲染的计算机算法将无法由一个专家，提取与保真度只有感兴趣的特性，和大量的策努力常常需要产生所希望的分段体积。
此外，定制的解决方案，以一种高度特异性的问题往往是发布的科学会议论文，几乎没有强调让他们广泛而全面的工具接触到谁没有数学，计算机科学和/或领域的深入了解研究人员计算机图形学。可定制的编程软件环境，包含了一系列的图像分析库，可以是一个强大的工具集，允许用户有效地写自己的模块进行精确分割。然而，这种方法需要转ensive培训和计算机科学的背景，以充分利用其众多的功能及图像分析功能的优势。人们可以在这样一个通用的软件环境中工作，对某些数据集，其中功能较为稀疏， 例如 ，通过使用它依靠的“模板”感兴趣的对象，从他们的周围12,13分开的独特几何形状的强大为基础的方法。
计算机图形可视化软件包公平存在多种交互式手动分割和建模。有些软件包是市售的，而有些则是学术渊源和免费分发的，如：加州旧金山科罗拉多州的IMOD 15大学大学奇美拉14，和德州大学奥斯汀分校VolumeRover 16。然而，特性和功能这些方案具备广泛和复杂陡对EA的学习曲线CH。某些可视化程序提供简单的几何模型，例如球和各种尺寸，其可以被放置在密度图中以创建复杂的三维体积的简化模型的棒。这些模型则允许简单的几何和体积测量，因此超越只是“漂亮的图片”。对象的这种手动跟踪可以很好地用于卷，其中只需要一个小数目的对象要跟踪和萃取。然而，大体积三维超微结构成像使用最近开发或者聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）17-20或串行块面扫描电子显微镜（SBF-SEM）21给出了额外的复杂的三维数据的大小集的范围可以从千兆字节到几十，数百GB的，甚至TB级。因此，这样的大的三维体积几乎是不可访问的，以手动的特征提取，从而有效的用户引导的半自动化技艺固定装置提取将成为瓶颈的三维体积的在可预见的未来有效的分析之一。
这里介绍的是通常用于在大范围内的生物图像类型四种不同的分割方法。这些方法然后比较它们对不同类型的数据集的效果，允许编入的帮助指南生物学家决定什么可以是用于自己的数据有效特征提取的最佳分割方法。至于详细的用户手册可以为大多数所描述的方案，其目的是不是让潜在用户熟悉这些特定的软件包中的任何一个。相反，我们的目标是通过将其应用到6示例数据集具有不同的特性，以表明这些不同的分割策略的各自的优点和局限性。通过这样的对比，已经制定了一套标准的要么基于对目标图像特征三维数据集，如数据相反，爽口感，拥挤，以及复杂性，或茎从主观因素，例如对分割了预期的目的，特征形貌进行分割，对所感兴趣的特征的人口密度，这意味着馏分由所感兴趣的特征，和怎样的收益优化的有限的资源，例如时间和人员的可用性所占据的体积。这些不同实施例的数据集示出如何将这些客观和主观标准可以按顺序在多种组合被应用，以产生一定的特征提取方法在某些类型的数据集的配对。给予希望能帮助新手的建议面对种类繁多的细分选项中选择适合自己的3D体积最有效的分割方法。
虽然本文的重点是特征提取，重视数据收集和预处理的数据是非常重要的高效Šegmentation。通常情况下样品的染色可以是不均匀的，因此，潜在染色工件应的分割过程中予以考虑。然而，染色通常给出较高的信号与噪声，因此需要较少的过滤和细胞体积，这可能也导致工件的其他数学处理。相应的原始图像数据集需要在正确的对比度和相机的像素设置要获取的，对齐，并重建为3D体积。对X线断层图，对齐的图像通常被重建使用加权反投影，然后将数据集通常进行去噪算法，例如非线性的各向异性扩散22，双边滤波23，或递归中值滤波24。 FIB-SEM和SBF-SEM图像数据通过互相关的连续切片中的XY利用项目，如ImageJ的25对齐。对比度增强和滤波可以应用于增强的功能息，从而去噪声的图像栈。滤波可以执行任一给子体积的选择或所选择的子卷之前的整个体积上，作为过滤的方法可以是计算昂贵的。下采样的数据（分级），其有时用于降低噪声和/或文件大小的减少，只建议数据是否比预期的分辨率被显著过取样。
降噪后，将处理过的图像然后可以通过不同的方法分割，并在此研究中的重点是在以下四种：（1）手动的抽象模型的生成，通过创建一个球和棒模型，（2）手动跟踪通过对项目的具体分割脚本的利益，（3）自动化的基于阈值的密度，以及（4）量身定制的自动分割功能。边界分割8和身临其境的分水岭分割10顷以简单的阈值更好的选择，但在T哎属于同一类别，并没有被明确列入这次讨论。
密度的手动跟踪要求概述所关注的特征，片逐片，它允许各个亚细胞区域的原始的保留密度。这种方法允许分割过程中最大的控制，但它是一个繁琐和费力的过程。
自动化的基于阈值（和相关的）密度分割方法是半自动，其中基于一组用户定义的参数的算法选择像素。一些学术（免费）的可视化软件包，如UCSF嵌合体，IMOD，斐济26和VolumeRover是可用的，以及商用（需要支付许可证）的包，并且这两种类型通常包括一个对这些分割方法或更多。在这项工作中来说明这些不同的方法软件包包括商业计划和学术开放源代码环境允许的程序，用于手动产生的抽象模型，以及手动和自动密度分割。然而，开源软件有时可以通过提供定制化的可能性更高级的选项。
这些技术的使用不同类型的数据集的比较导致的规则下面的介绍和指导对如何处理不同的生物数据的3D体积，这在我们的知识还未出版的分割。因此，这是对不同方法的第一个系统的比较及其有效性的数据集具有不同的特性，为用户提供不同的目的。
Protocol
1，手动抽象模型生成
注意：该方法的细节如下所述特定于嵌合体的，但也可以使用其它的软件包来代替。使用这种方法时，其唯一目的是为了使几何测量，而不是显示的对象的体积的形状创建的几何模型（ 例如 ，球和棒型）。
- 导入数据量到合适的程序进行手动抽象模型生成。
- 选择文件 > 打开地图拉起打开文件对话框。导航到所需的地图文件位置。
- 拉起卷器（ 工具 > 量数据 > 音量浏览器 ），然后选择功能 > 显示样式来显示不同的渲染风格的数据。
- 通过拖动垂直栏上的直方图中的音量调节器的阈值显示窗口。
- 浏览3D体积（ 例如 ，通过切片切片），选择的细分感兴趣的领域和裁剪出更小的子卷，如果有必要的。
- 在音量浏览器对话框中，单击轴 ，然后选择X，Y或 Z。
- 在音量查看器对话框，选择功能 > 飞机 。点击其中一个设定深度显示对应于左边框中的数字的平面，然后单击全部显示所有飞机。
- 在音量查看器对话框，选择功能 > 次区域的选择 。
- 单击并拖动以创建感兴趣的区域周围的矩形框。
- 放置标记物沿着所感兴趣的特征以及与接头酌情（通常由程序自动完成的），直至该模型是完整的连接它们。
- 从成交量浏览器菜单栏，选择工具 >成交量示踪对话框打开音量示踪对话框。在音量示踪对话框中，选择文件 > 新建标记集 。
- 在音量示踪对话框中，选中鼠标 > 高品质地标，地点标记上的数据机，移动和调整标志，连接新标记选择标记 ， 链接连续选择标记 。
- 点击标记颜色样本，并选择一种颜色。重复链接的颜色这一步。
- 输入半径的标志和链接模式建设的内容。
- 在音量示踪窗口中，使用[右]鼠标右键选择地点标记 ，并插入半径标记和链接。
- 右键点击量数据开始放下标记。标记会自动连接。
- 在音量示踪对话框中，选择File> Save 当前标记集 ，然后文件 > 关闭标记集 。
感兴趣的特征2。手动追踪
注意：该方法的细节如下所述特定于阿米拉，但也可以使用其它的软件包来代替。使用这种方法时，人口密度相对较小，并且当特征提取的准确性是非常重要的，因为手动跟踪是一个耗时的方法。
- 进口量数据与人工跟踪选项的程序。软件具有这种能力通常至少提供一个基本的画笔工具。
- 对于大量或断层（ 例如 ，16位2,048点¯x2,048或以上.REC或.mrc断层中的IMOD生成）：选择打开数据 >右键点击filename.rec>格式...> 选择原始的LargeDiskData 确定 > 负载 。从标题信息选择合适的原始数据参数> 确定 。切换并保存为新filename.am在下面的步骤使用的文件。
- 对于较小的3D图像的堆栈文件（ 例如 ，3D .TIF或.mrc或.REC）： 打开数据 >选择filename.tif或filename.mrc。切换并点击右键> 另存为 filename.am 。如果发生错误或者程序没有响应，该文件可能过大，可以通过以下步骤2.1.1打开。
- 浏览切片选择3D分卷的分割，然后裁剪感兴趣这个领域。
- 在3D查看器窗口中，选择Orthoslice打开图像文件。使用滑块底部导航片。
- 要裁剪开辟为LargeDiskData较大的数据，在切换窗口游泳池文件名>右键点击> LatticeAccess。恩特ř所需的箱体尺寸> Apply（应用）。保存新文件。
- 创建分割文件。
- 切换在泳池窗口中的文件>右键点击> 标记 > 的labelField。一个新的文件将被创建，并在分割编辑器选项卡自动加载。
- 跟踪感兴趣的第一特征的边界，然后填充迹用手或通过使用特定于所使用的软件的命令。按照通过所有切片感兴趣的功能，重复手动跟踪分割。使用使用阿米拉当下面的命令：
- 要使用画笔工具，改变画笔大小根据需要，然后用鼠标指针跟踪感兴趣的特征的边界。
- 填充快捷键“F”的追踪区域。通过点击按钮的加号，或者快捷键“A”添加选择。如果需要，按“U”撤销，而“S”减去或删除。
- 产生的表面呈现为可视化和基本定性或按软件用户指南指令定量分析。
- 在对象池选项卡，切换文件名 ，labels.am在泳池窗口>右击> SurfaceGen。
- 选择所需表面性能 > 应用 。一个新的文件filename.surf将在池中创建。
- 以可视化的分段式音量，切换filename.surf在泳池窗口>右击> 的SurfaceView。
- 使用在3DViewer窗口中的工具来移动，旋转和缩放3D体积。
- 提取精确的密度，并确定测量，例如体积或表面积。导出到其他程序的更先进的显示，分析和模拟。
- 在3DViewer窗口中，单击测量工具 > 选择相应的选项 （2D长度和二维角度测量在一个二维平面，三维长度和3D视角对于三维体积上测量）。
- 点击网面来测量所需要的长度，距离和角度。该值将被列在属性窗口。
3，自动化的基于密度的分割
注意：该方法的细节如下所述特定于阿米拉，但也可以使用其它的软件包来代替。
- 使用数据集的这种做法与任何品种对比，脆度，或拥挤的撤回感兴趣的密度。
- 进口量数据转化为配备阈值，魔棒，或者其他基于密度的工具，用于自动分割程序。按照手动追踪的方向2.1-2.1.2介绍的步骤。
- 浏览切片和分割选择区域。如果有必要，裁剪出一个较小的3D分卷的分割。按照手动追踪的方向2.2-2.2.2介绍的步骤。
- 选择的密度所关注的特征，通常是通过点击或放置标记或锚定点上的特征。如果该软件允许输入一个数字范围，围绕这些要素的像素密度，并根据需要调整这个能力。属于该特征的密度将被拾起根据锚点的像素或公差值的强度。阿米拉使用时，请使用以下命令。
- 使用魔术棒工具用于区分利润率的特点。
- 点击感兴趣的区域，然后调整显示器和屏蔽滑块捕捉到正确的数值范围，这样的功能是完全凸显。添加选择与快捷键“A”。
- 使用的功能的阈值工具没有明显区别的利润率。
- 选择阈值图标。调整滑块在理想范围内调整密度，这样的利率只有功能被屏蔽。点击选择按钮，然后选择添加快捷方式与220;了“。
- 细分整卷，选择加入选择之前所有切片 。
- 去除噪声，选择分割 > 删除群岛和/或分割 > 光滑标签 。
- 使用魔术棒工具用于区分利润率的特点。
- 生成可视化分析和定性分析的表面如人工跟踪部分2.6-2.6.2描述。如果需要的话，出口到其他程序有足够的3D显示，定量分析和模拟。
4，为客户量身定做的自动分割
注意：使用这种方法来创建自动分割，这需要在计算机科学背景经验，但允许从一个大容量创建一个精确的密度模型的能力，定制脚本。
- 工具（形状监督分割的MATLAB中27特例）
- 图像预处理：进行去噪，去除背景和图像增强通过使用下面的管道：
- 使用imread命令加载图像。
- 在命令行中输入：>> IM = imread（$ image_path），其中$ image_path是图像要分析的位置。
- 从图像处理工具箱中，使用估计的或已知的噪声功率与信号比（NSR）称维纳滤波。
- 在以前处理过的图像，调用IMOPEN估计背景层图片开启功能，那么分配的结果是不同的面具。
- 在命令行中输入：>>背景= IMOPEN（IM，strel（$ shape_string，$大小）），在此方法中，$ shape_string等于'盘'变量$大小由分析器，即给出>>背景= IMOPEN（IM，strel（'盘'，15））。
- 减去与背景的滤波图像。
- 在命令行中输入：>> IM2 = IM -背景
- 根据结果的质量，执行图像归一化具有或不具有自适应的Otsu的方法28，它可以使用从图像处理工具箱函数imadjust被调用。
- 在命令行中输入：>> IM3 = imadjust（IM2）
- 制备所关注的特征的图像分割，通过裁剪规格化图像限定的感兴趣的区域。
- 使用imtool命令，探索的兴趣是要裁剪的区域和提供的坐标的命令：>> im3_crop = imcrop（IM3，[X1 Y1 X2 Y2]），其中所述载体[X1 Y1 X2 Y2]对应方形区域被裁剪。
- 使用imread命令加载图像。
- 形状识别/监督形状分类：训练算法通过（通过所关注的特征线性痕迹在2D图像）提供具体的例子，每一个不同的类的对象。
- 检查VLFEAT 29 API被成功安装并访问VLFEAT的网站进行更深入的文档。
- 在命令行中输入：>> [树ASGN] = VL_HIKMEANS（im3_crop，千元，$ NLEAVES），其中千元是用于集群的数量或观察者要安排数据到班数，美元NLEAVES是叶簇所需要的数量，即 >> [树ASGN] = VL_HIKMEANS（im3_crop，4,100）
- 使用手工分割特征作为输入VLFeat。
注：此开源的基于C语言的库将执行像素修补，修补集群和集群中心的定位取决于方法的选择最适合的数据集的类型。可用的选项的范围从K-均值聚类，以纹理基元为基础的方法30，输出是一个数值数组，它描述了功能所需的基于给定的范例。
- 图像预处理：进行去噪，去除背景和图像增强通过使用下面的管道：
- 分割：使用此福LLY自动化的，虽然计算量很大，办法段多个类同时对象，这将写出作为进一步的可视化和分析的单独的地图。
- 加载先前产生的标记数组（模型）。
- 调用VLFeat支持向量机（SVM）的功能，使用该模型与所述图像被划分为输入。
- 在命令行中输入：>> [W，B = vl_svmtrain（X，Y，0.1），其中x是原始裁剪图像im2_crop和y是客观的形象，已经被人工分割的图像。使用>> ISEG = VL_IMSEG（I，标签等），根据由聚类生成的标签上进行着色的结果。
注：根据模型的特点，VLFeat会在图像上的班级数目从一开始就分配（利益特征）进行分类。根据精度等级需要的话，也可以将此方法与其它方法或估计clust结合呃参数，如船体和聚类中心。支持向量机算法的输出是一个概率模型，并在新的数据集所希望的类别的多个二进制掩模。
- 在命令行中输入：>> [W，B = vl_svmtrain（X，Y，0.1），其中x是原始裁剪图像im2_crop和y是客观的形象，已经被人工分割的图像。使用>> ISEG = VL_IMSEG（I，标签等），根据由聚类生成的标签上进行着色的结果。
- 通过输入以下命令将结果保存：>> imwrite（IM，$格式，$文件名），其中$格式为“TIFF”和$ filename是输出文件的路径。
- 用于可视化图像，请输入以下命令：>> imshow（IM）。
Representative Results
图1显示了一个典型的工作流的三维电子显微镜细胞成像，包括电子断层扫描，FIB-SEM，和SBF-SEM。该工作流包括原始数据收集，数据对齐和重建成三维体积，通过过滤噪声降低，并且在必要时，裁剪到感兴趣的区域，以便最大限度地选择的分割软件的有效性。这种预处理的数据，然后准备进行特征提取/分割。
图2示出布置在图1中有四个不同的数据集（其将被引入进一步说明），其中两个是记录通过电子断层扫描（ 图2A，2B）树脂包埋标本的工作流程中，与来自FIB的其他两个词干-SEM和SBF-SEM，分别为（ 图2C，2D）。在图2中第1栏图像投影次（ 图2A1，2B1）和块表面的图像（ 图2C1，2D1），分别为，其在对准和重建被组装成三维体积。塔2示出了通过这样的三维体积，其在过滤（第3栏）显示出显著减少噪声并因此经常出现更脆切片。选择和种植的大三维体积到感兴趣的区域（第4列）之后，所关注（第5列）分段的特征的三维透视图，可以得到和进一步检查，彩色编码和定量分析。
一共有六个三维数据组，每个都包含一个堆栈或者通过电子断层扫描（3数据集）中得到的图像，FIB-SEM（2数据集），或者SBF-SEM（1数据集）被用于比较每一个如何四分割方法进行（ 图3）。该数据集由各种不同的研究项目，在实验室中干，从而提供AReasonably多样化的典型实验数据集。所有的数据集是由四个独立的研究人员，他们每个人都最熟悉的一个特定方法检查，他们被指控提供最佳的结果为每六个数据集。
该数据集是从样本如下：1。 图3A1-3A5：高压冷冻，冷冻干燥，取代的和树脂包埋小鸡内耳毛细胞的纤毛31，2， 图3B1-3B5：高压冷冻，冷冻取代的和树脂包埋的植物细胞壁（未发表），3。 图3C1-3C5：高压冷冻，冷冻干燥，取代的和树脂包埋内耳毛细胞kinocilium（未发表），4。 图3D1-3D5：高压力-冷冻，冷冻干燥，取代的和位于在人乳腺上皮细胞中的HMT-3522 S1腺泡，这已被培养在层粘连蛋白丰富extracell线粒体的树脂包埋块ular矩阵32,33，五图3E1-3E5：未染色的台式处理，对硫酸减速细菌生物膜树脂包埋块（在撰写中），和6 图3F1-3F5：在HMT的相邻小区的边界膜-3522 S1腺泡。
如可以从图3中可以看出，不同的分割方法可导致大多相似的结果为一些数据组的类型，但完全不同的结果，对于其它数据类型。例如，毛细胞纤毛数据组（ 图3A）中，产生合理分割体积与全部四种方法中，与由一个专家用户是最清晰的解释和测量所产生的人工抽象模型。在这种情况下，这样的模式允许对灯丝灯丝距离快速测量，计数的细长灯丝之间找到链接的密度图的丢失部分的相应的数量，以及确定到那里的标本样品制备34中受损的位置。这样的信息是困难得多用其他三个分割的方法来获得，尽管定做的自动分段提供了比单纯的基于密度的阈值更好的结果。
对植物细胞壁（ 图3B），手动模式生成似乎是最有效的在输送的顺序感的细胞壁，它没有任何的其它方法实现。然而，该抽象模型不捕获在数据集中的对象的拥挤。手动跟踪感兴趣的功能，似乎给了比基于密度和形状监督方法更好的结果。另一方面，手动跟踪是非常劳动密集的和的特征识别的边界是有些主观的。因此，自动化的方法可以优选用于分割大量精确和之间的电位折衷资源用在手动分割。
为kinocilium数据集（ 图3C），手动抽象模型生成产生干净的结果，揭示了三个微管意想不到架构在kinocilium，一个细节是在所剪切的数据随时可见的中心，但在所有其他方法丢失，大概是由于染色不均匀性。然而，该密度图的其他潜在的关键特征被错过在手动生成的抽象模型。这是因为，在主观的手工模型地层性质导致一个理想化和所观察到的实际密度的抽象化，并因此在模型形成主观解释这一事实。因此，本实施例很好地证明了抽象模型生成如何手动使人们把注意力集中在3D体积的一个具体方面。但是，选择性知觉和简化未能给予所有的蛋白质共同全面考虑mplexes存在于数据集。因此，如果目标是要显示的数据的复杂性，再一个是更好地与任何其它三个方案的提供。
在3D基质培养的乳腺腺泡（ 图3D）的情况下，实现高对比度的线粒体由所有四种方法容易分段，与特征不太令人惊奇地产生具有污染的最低量的最佳效果。手动跟踪（ 图3D3）。然而，手动跟踪是非常劳力密集的，因此使用有限的大容量。无论是密度阈值和基于形状监督自动分段提取的线粒体相当不错，而且会导致一个近乎完美的分割，如果再窍门清理受雇（ 如消除以下像素密度的特定阈值的所有对象）可用在不同的包。在这种情况下，手动抽象模型建筑物没有屈服有希望的结果，部分是因为线粒体不能容易地近似用球和棒的型号。
相对于所述细菌土壤小区/生物膜（ 图3E），三这四种方法的产率合理的结果，与手动模型生成效果不理想的，由于代表生物物体，如细 菌，通过几何形状的挑战。胞附属物从细菌始发所用的自动分割的方法来检测，但不同时在手动特征跟踪。形状监督定做的自动分段可以进一步分离从细菌细胞外的功能，尽管它们具有相似的密度（数据未示出），使之易于量化甚至非常大的数据集。因为这是本来是一个非常大的数据集时，定做的自动分段清楚outcompeted所有其他的方法，但可能会从低复杂度中受益和相对稀疏分布感兴趣的对象（低拥挤）。
当检查2的真核细胞之间的界面上的组织样上下文（ 图3F），对所关注的特征只有手动跟踪产生良好的结果。自动化的基于密度的分割方法不能完全检测相邻小区之间的边界膜，甚至是定做的方法失败，部分原因是电池的形状不容易接近或等同的形状，尽管它明显成功的菌在所述生物膜（ 图3E5）。
从图3中观察到的分割方法做好对某些数据集，但不能在其他导致什么特点每个这些数据组的问题，并确定是否有可能进行分类的数据的特性，或出现于个人目标的类型他们respectiv匹配良好ê方式。本课题的系统研究还没有得到之前进行的，因此作为第一步的机构的形象特征和个人的目标进行了实证列表可以指导一个新手在他们试图找到各自的数据集的特征提取的最佳方法。
被确定为显著示于图4八个标准，并且它们可以分为两大类：（1）中固有的数据集，并在特征（2）的研究人员的个人目标和其他考虑，是较为主观，尽管同样重要。示是主要是从六个数据集绘制在图3中，与被引入三个附加数据集的例子：1（ 图4A1）是冷冻断层像拟南芥植物细胞壁的低温部分，所述第二（ 图4A2 ，4B1，4D1 图3F1-3F5所示的类别，但更复杂的基本上一个高度复杂难懂的组织和第三（ 图4B2 ，4D2）是内耳毛细胞纤毛的剖视图的树脂部断层图像，类似于在Figuress 2A1-2A5和3A1-3A5纵向视图中所示的样本内容。
对的客观标准等的图像特性，类别固有的数据集4性状建议是重要的：
- 数据对比可以是（1）低（ 图4A1），为典型的冷冻电镜断层图像，（2）中间体（ 图4A2），例如在蜂窝式的风景与没有明确的细胞器或其他显着特征的信誉，或（3）高（ 图4A3），为的是为kinoci的情况下liary断层图像或在横截面中的纤毛，由于z方向内明显分开的丝状元件的对齐。
- 该数据可以是模糊（ 图4B1），具有两个紧密定位的目的，之间没有明显的界限清楚，如细 胞中的组织，或脆（ 图4B2），具有清晰的边界。这部分的数据集的分辨率，这是由大约2-4相比，FIB-SEM电子断层图像的一个因素本身更高的功能。当然，更清晰的界限是可取的手动和自动分割方法为，但必不可少的一种方式。
- 该密度图可以是拥挤（ 图4C1）的紧密间隔的植物细胞壁成分所反映，或人烟稀少（ 图4C2）一样，都是细菌的菌落，这体现呈现的自动图像分割大大简化了分离。
- 密度图可以是具有完全不同的特征往往具有不规则的形状，例如周围的血管的血管纹组织（ 图4D1）或具有类似的组织良好定义的细胞器状的物体，如在横截面中的纤毛（高度复杂图4D2）。
另外要注意在所有不同的例子千差万别尺度，使得比较有点困难。
除了更客观的标准，如图像的特点，4个高度主观标准，将指导合适的路径的选择也提出：
- 期望的目的：目的可以是可视化的发束stereocilium在其复杂性，并确定与检查对象（ 图4E1）的形状，或创建内置在密度图的简化和抽象球和棒模型和可以快速计数几何对象的次测量（纤维长度，距离和连接数）（ 图4E2）。
- 的特征形态可以是高度不规则和样细胞，如细 胞间相互作用的区域（ 图4F1），有点类似形状的一些变化，如线粒体（ 图4F2），或者主要是形状相同，如肌动蛋白丝和交叉复在纵方向（ 图4F3）发束链接。
- 利息（人口密度）的功能的比例是非常重要的，因为一个可能要段三维数据集中的所有特征，是植物细胞壁（ 图4G1），或细胞体积只有一小部分的情况下，因为是线粒体中的非均相蜂窝场景（ 图4G2）的情况。根据不同的数据集的大小和体积的需要分割的百分比，它可能是最有效的是使用手动的方法。在其他情况下，比如当一个人热衷于各种功能，根本就没有办法使用半自动化的分割方法。
- 另一个关键的主观标准是资源量人愿意投入到细分的过程，什么级别的保真度要求回答一个生物学问题。人们可能想要和需要量化的特征的体积参数（如尺寸，体积，表面积，长度，距离从其他特征， 等等 ），在这种情况下，更多的照顾，可能需要获得准确的定量信息（ 图4H1），或目的可能是只捕捉其3D形状（ 图4H2）的照片。在一个理想的世界里，资源是无限的，人们显然不想做出任何妥协，而是选择用户手动辅助特征提取的最准确路径。而这可以为许多数据集一起使用，在不久的将来三维卷西港岛线升是在10K的顺序由10K由10K或更高，和手动分割将不再能够在分割这么大的空间，发挥了突出的作用。根据不同的数据和其他数据的特性的复杂性，半自动化的分割可能成为必然。
在图5中，优势和局限性做了简要列出的四个细分方法。在图4中确定的个人目标和图像的特点，可以搭配每种方法进行了概述，以及。在图6中，个人目标和六个数据集的图像特征举例说明如何以分流数据，并决定最好的方法。两图5和6时，在讨论展开。
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图1的工作流程生物成像重建和分析。此图表可采取以收集和由断层扫描采集的各个步骤的过程图像的概述，聚焦离子束扫描电镜和串行块面的SEM。原始数据收集的结果在二维倾斜串联或连续切片。这些2D图像集必须对准并重建为3D，则为了降低噪声和提高的所关注的特征的对比度过滤。最后，可以将数据分割和分析，最终导致3D模型。 请点击这里查看该图的放大版本。
图2。。工作流从断层和FIB-SEM数据采集后的工作流程中的每个步骤的不同的数据类型的实例是通过四个数据集（行AD）所示：树脂的嵌入式纵向剖面纤毛的彩色成像，树脂嵌植物细胞壁的彩色成像大肠杆菌的纤维素，FIB-SEM乳腺上皮细胞的线粒体和SBF-SEM 大肠杆菌细菌。通过对原始数据二维切片示于第1列，并从对准及三维重建后的数据的图像包含有以下2列3列中施加的过滤技术：中值滤波器（A3），非各向异性扩散滤波器（B3），高斯模糊（C3）和MATLAB的imadjust过滤器（D3）。对于每个数据从感兴趣（第4栏）裁剪区域设定最佳的分割的一个例子被显示为3D渲染中柱5， 比例尺 ：A1〜A3 = 200nm时，A4 = 150纳米，A5 = 50nm时， B1〜B3 = 200nm时，B4-B5 = 100纳米，C1-C3 = 1毫米，C4-C5 = 500nm时，D1〜D3 = 2毫米，D4，D5 = 200纳米。 请点击这里查看该图的放大版本。
四分割图3的应用方法，以实例的数据集六大例如数据集是由四个分段方式：手动抽象模型生成，人工跟踪，自动基于密度的分割，以及量身定制的自动分割。手动抽象模型生成是有效的嵌入式纤毛（一）彩色成像的树脂，因为其目的是建立一个模型，定量的目的，而不是提取密度。用于树脂嵌入植物细胞壁（B）中，自动化的基于密度的分割，对彩色成像化是最有效的方法，通过多片，其中以手动方式把更多的精力上的数据只有几片快速提取的纤维素。手动抽象模型生成产生的kinocilium（三）染色断层扫描微管三线，而其他分割方法也没有，但两国的自动化方法更快速提取的密度并因此首选。由于从FIB-SEM乳腺上皮细胞（D）的线粒体的形状，手动跟踪所提供的清洁的结果，而人口密度低，结合使用允许为快速分割的插值方法。考虑到需要分割的大容量，量身定制的自动分割被证明是最有效的细分SBF-SEM细菌数据（E），但两者的自动方法具有可比性。虽然费时，提取的FIB-SEM乳腺上皮细胞膜（F）的唯一方法是手动跟踪标尺。：为A1-A5 = 100nm时，B1-B5 = 100nm时，C1-C5 = 50纳米，D1〜D5 = 500nm时，E1-E5 = 200nm时，F1〜F5，酒吧= 500纳米。 请点击这里查看更大的版本这个数字。
图4目的图像特征和主观个人目标为归类（triaging）的数据集。使用数据的例子设置的特性，提出了标准，以告知为要使用的分割方法的决定。相对于目标的特性，数据可本质上具有对比度是低，中或高（A1-A3），是模糊或脆（B1-B2），隔开或拥挤的（C1-C2），并具有复杂的或简单地有组织的特征（D1-D2）。主观个人目标包括所需Ø BJECTIVE针对一个简化的模型，提取准确的密度（E1-E2），识别旋绕片材，令人费解的体积或线性形态存在利益（F1-F3）的特点，选择感兴趣的特征的高或低人口密度（G1-G2），并决定在高保真，高资源分配之间的权衡上的投资，如时间型（H1-H2） 比例尺递减的回报：A1 = 50纳米，A2 = 1500纳米，A3 = 100nm时，B 1 = 1500纳米，B2 = 200nm时，C1 = 100nm时，C2 = 200nm时，D1 = 10mm时，D 2 = 200nm时，E1 = 100nm时，E2 = 50纳米，F1-F2 = 500纳米，F3 = 50纳米，G = 100纳米，G2 = 1毫米，H1，H2 = 100纳米。 请点击这里查看该图的放大版本。
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数据特性图5比较表格和主观目的是适用于不同的分割方法。下表汇总了每个细分方法的优势和局限性。从图4中的条件可以帮助确定哪些数据集是合适的量的分割方法。这些客观的形象特征和主观的个人目标被选为每种方法的最佳使用，但不同的组合可能会阻碍或帮助细分的效率。 请点击这里查看该图的放大版本。
图6：决策流程的效率吨分割riage数据集的方法具有不同的特点。基于特征图4强调，这张图说明了这四个标准贡献最大的为每个数据从图3中设置的最佳分割方法的最终决定权。每个数据集颜色编码，以快速跟随表示主决策过程的粗线，以及反映可能会或可能不会导致相同的方法的替代路径的虚线。该kinocilium，细菌和植物细胞壁的数据集进行分段最好用两条自动化的方法。相比之下，细胞膜和线粒体途径总是导致手动跟踪，因为它们很难特点。 请点击这里查看该图的放大版本。
Discussion
迫切需要，以跟上数据的海啸已创出近期的生物成像的三维电磁量相关特征提取的有效战略。而数据可在数小时或数天来产生，它需要许多个月来分析三维体积中的深度。因此，很显然，在图像分析已成为科学发现的瓶颈;没有对这些问题的适当解决方案，成像科学家成为自己成功的受害者。这部分是由于高的数据的复杂性，也大分子拥挤通常存在于生物的细胞，其中的蛋白质和蛋白质复合物的边界彼此并且基本上显示为灰度密度的连续梯度。该问题是由样品制备和成像缺陷复杂，并且在某些情况下，图像重建伪影，从而导致可构成为完全自动化的方法的挑战不完美的容积数据ES。最显著，但是，是一个事实，即专家在样品制备，成像和生物解释很少精通计算机科学的，因此需要对如何有效地接近的特征提取和分析的指导。因此，通过使用各种实施例中，协议说明如何准备数据的分割，以及以下步骤进行手动抽象模型生成的，自动化的基于密度的分割，对所关注的特征手动跟踪，和定做的自动分段。在该过程中概述的手动和自动方法可在大量不同的分割软件，其中一些在此处提及的被发现，但其他执行类似的功能和同样适合。
结果表明，每一个三维分割方法的有效性而变化为每个不同类型的数据集。虽然不同的方法产生质的Šimilar三维渲染图作为最终产品，时间和努力的量时显著变化后的分割处理在每个使用了。适当的图像特征，每个分割方法的个人目标的建议汇总在图5中 ，这是在以下四个小节进一步解释。这些标准被应用到6的数据集， 如图6的决定流程图中虽然图5和图6仅仅是为了提供设置每个数据的基本原理，以及如何每个标准进行加权，在决策过程中他们不提供万无一失的指导，而是一个起点。有根本影响的决策过程太多的标准：有些是客观的标准，如数据集的特性，而其它的是更多的主观标准，如所期望的目标。它是安全地说，显示高列夫的数据集与锐利清晰的边界对比EL，有功能，有很好的分离和相对均匀（不要太不同），并展示了大量对象的密度模型的目标进行处理，自动化的方法将是出众，如果不是事实上，人工的办法很简单，资源（时间）-prohibitive。另一方面，如果对比度低时，数据是模糊，因此需要一个专家的知识，该对象是拥挤，并且特征显示出高的多样性，因而异类，可以没有任何其他的选择比手动特征提取/分割。
手动抽象模型生成
手动抽象模型跟踪是特别有效的分割线性元件，提供种子点（球），可以自动连接（枝）。这样的球，棒，模型可以是非常强大的测量长度ND的定性检测和定量分析这种模式的方向，并提供足够的抽象模型。手动抽象模型生成最小化花费在分析资源时，通常使用比绝对忠实于原始数据的形状更重要。它是与感兴趣的线性和均匀的功能（ 例如 ，细丝，管）最成功的。数据对比，爽口感，与拥挤不允许确定本方法的成功中起主要作用，只要人眼可识别的感兴趣的对象。有时这样的模型也可以用作骨架链段的3D地图中围绕骨架区。虽然该模型是抽象的，而不是精确的密度的反映，它代表了3D密度的镂空版本，从而允许整洁的可视化和定性分析。定量的测量，如长度，也可以从近似模型来确定。对于例如，软件有手动抽象模型生成，请访问奇美拉的详细的用户指南在网上http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/current/docs/UsersGuide/index.html 。
感兴趣的特征手动追踪
手动画笔跟踪效果很好，几乎所有的数据特点，但它也是最耗时的方法。有时，它是由含有大量的各种特性，如细而曲折的细胞膜的复合图像集合中提取所关注的特征的唯一技术。在某些程序中提供一个有用的工具，允许间歇分割切片之间插值时所感兴趣的特征变化平稳。如果数据是脆并且具有中到高对比度手动跟踪，可以最有效地应用，但它也可用于对于更有挑战性的数据集，只要用户熟悉的感兴趣的对象。的数据的复杂性可以从离散的物体，以复杂和拥挤的数据集，其中对象是紧密堆积。在后者的情况下，手动分段可能是唯一的选择，自动方法往往很难段所需要的体积，并提取过多或过少。困难特征形貌，如卷积片或卷，也可以用这种方法来提取。但是，用户应该记住，有几个困难的特征的数据集，只能分段如果感兴趣的功能，人口密度低，为感兴趣的功能，人口密度高的分割变得时望而却步。对于软件有手动跟踪的例子，请访问阿米拉的详细的用户指南在网上http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_GuidE.pdf规格。
自动化的基于密度的分割
与此相反的手工技术，自动化的方法一般是耗时少，这是分割图像的大叠时要考虑的一个重要因素。然而，简单的阈值可能不准确，以及更多的时间，可以在精化的自动分割的体积和策使用了。自动化的基于密度的分割工程中显示了大量的关注类似的特征，所有需要分割数据集最好。如果数据是更复杂的，这些自动化的技术还可以作为一个初始步骤，但可能会需要一些手动向下行干预，以指定含有感兴趣的特征的子体积。这种策略通常工作良好的线性形态或回旋卷，但它是用薄的旋绕片材如很少成功细胞膜。使用自动方式最少的用户干预使通过分割或大或小的体积，同时花费很少的用户资源，如时间，以换取较高的保真度。对于软件与自动化基于密度的分割的例子，请访问阿米拉的详细的用户指南在网上http://www.vsg3d.com/sites/default/files/Amira_Users_Guide.pdf 。
量身定制的自动分割
定做的自动分段允许为特定的数据集的算法的功率定制，但它往往是特定设置数据或数据类型，适合的功能特性的数量有限，并不能很容易地推广。这里展示的过程不同于一般的自动分割方法，如流域浸泡等级别一套方法，这依赖于种子的关键点的确定程序，然后快速移动立方体算法的扩展，从这些种子点。关于这个主题的变体是边界分割，其中梯度矢量信息通知功能界限。与此相反，这里使用的自定义脚本依赖于训练阶段，其中用户手动跟踪的几个例子。通过机器学习，具体的算法可以检测并学会独立识别的痕迹一致发现属性和数据的特点。专家用户可以重新训练算法，并通过包括更多的例如提高分割的精度跟踪提供了一套功能标准较大。总体而言，阈值和相关方法，甚至量身定制的方案未必是从复杂的细胞器或形状多样性的图像中提取感兴趣的一个功能是有益的，因为策展可能只是作为劳动密集型的手动跟踪。
“>策略归类（triaging）的数据，并选择一个分割方法
定在图5中示于图4和合适的数据集的概要的主观和客观的标准，在图6中所描绘的决策方案可以协助的特征提取策略的有效评估了大量的各种数据集。该数据集被分流在四个连续的决定，其中每一个可包括在图4中引入的四个相应的目标，以及四个主观标准的任何一种。作为一个例子， 图6是合理的归类（triaging）每六个数据的如图3套，毫无疑问，每个数据集有没有一个唯一的路径，而是通过这个矩阵如下不同的标准进行决策，可能会导致吨，而不同的路径Ø数据分割相同或不同的建议。虽然每个数据集都会有它自己的属性，这是无法预料的，六个例子，给出各搭配背后的优选特征提取/分割方法的基本原理的解释。大多数还包括一个命题的替代路线的决定，要么导致使用相同或不同的分割方法（ 图6）。
该kinocilium是一个清晰的数据集，具有明确的边界，这使得自动化的方法更有可能取得成功。感兴趣的所有功能完全分开，又利于自动化的方法。此外，所关注的特征是彼此相似，使得它相对均匀的数据集的理想选择定做的分割。最后，该目的是要提取的全部特征，有利于半自动化方法。因此，得出的结论是一个自动化的阈值（绿色实线），以及定制设计的（ 如形状监督分割）方法（绿色虚线）都可能要做好这些数据集。
相似的标准，虽然放置在不同的顺序，在决策网络，适用于细菌的情况。一个自定义的定制方法，建议这部分是因为这组数据是非常大的;因此，有限的资源，禁止劳动密集型人工干预/分割方法。而阈值会产生可接受的结果，在自定义设计的方法是能够执行该研究的主要目标为圆形的细菌形状，从细胞外金属沉积物，位于任一在两者之间的细菌或旁边的细菌中分离出来，并因此在量身定制的方法是首选。
对于纤毛的数据集，首先考虑的是所期望的目标：目标既可以显示整个密度或创建几何模型。感兴趣的体积是一个拥挤的领域，并且目标是段中的大量对象中以便随后执行定量体积分析，包括长度，数量，距离，方向等 ，这是有益的分离的对象的对象兴趣主要是线性的，并且这使几何模型跟踪所选择的方法。然而，如果不是目标一直是显示整个密度，则线性特征的形态以及相对较高的对比度和轮廓分明的边界将成为一个自动阈值的协议是可行的。
细胞膜和线粒体的数据情况下是具有挑战性的自动化方法，因为它们的类别特征形态：曲板和卷，分别为。我们的目标是要跟踪的细胞或线粒体轮廓准确，但也有只有有限的资源，这样做的。间的，此外，在功能EST是复杂的，不能很容易地自动检测或形状编码的，虽然对于线粒体数据集采取的细菌中自定义脚本的方法有可能被进一步定制应用。幸运的是，膜和线粒体本身仅代表总体积的一小部分，因此，手动跟踪是一个简单虽然费时的方法。手动跟踪也是这样的数据集选择的方法时的对比度是相当低和界限是相当模糊。这样一来，即使它们构成的数据集显著部分，这样错综复杂的表必须手动跟踪，只是由于缺乏一个更好的选择。
该工厂的数据集带来了挑战，因为目标是段中的所有对象，这是密集的间隔，使了一个拥挤的风景。显示所述密度原样将使关于形状和组织的对象，，但是B的测量ecause手动分割每个丝状物是成本太高，自动阈值被改聘。
的各种步骤和相应的结果中创建3D模型已经在这里显示，但更重要的是，发现该数据特征和个人条件是决定分割的最佳路径也已阐明的关键。的图象数据本身的重要特性包括这里所描述的相反，拥挤，脆度，和不同的形状或特性（例如细胞器，长丝，膜）的数量。主观标准来考虑包括分割的期望目标（测量/计算，镂空的代表性数据/显示在3D渲染体积）中，感兴趣的特征的形态特性（线性的，细长的，网络的，复杂的，错综复杂的），密度的有关感兴趣的特征的整个体积（即是对象的一部分重要的且需要被提取），并且平衡花费资源来对原始数据的分割的保真度的折衷和上导致的增量改进对资源的基本配置较高的投资的收益递减。
图像分割领域在最近几年显著成熟，尚没有银弹，没有算法或程序，可以做到这一切。数据集的大小从几百兆到千兆常规的几十人发展，他们现在也开始超过千兆字节，使得手动分割几乎是不可能的。因此，更多的资源需要投入在模仿人类的决策过程中，巧妙地和时间效益的特征提取方法。需要这种努力与（1）地理信息系统（GIS）相结合为基础的语义层次数据库（类似于谷歌地球），（2）数据抽象技术（ 即过渡从体素到几何/体积表示）与计算机辅助设计（CAD）软件以显著减少数据量，从而使较大体积35的显示，（3）的模拟技术，因为它们经常用于在兼容工程学科，以及（4）先进的动画及电影制作功能，包括即时通动画（类似于发达的博彩业）。
显然，有效的特征提取与分割位在蜂窝高分辨率成像即将来临的革命的心脏，并同时更好的办法永远是必要的，原则呈现在这里，还有什么办法的例子是采取不同的数据类型，将提供一些有价值的信息，使在其上的方法来作出决定。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira | FEI Visualization Sciences Group | http://www.vsg3d.com/amira/overview | |
| Chimera | UCSF | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Fiji/ImageJ | National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji, http://rsbweb.nih.gov/ij/ | |
| IMOD | Boulder Laboratory for 3D Electron Microscopy of Cells | http://bio3d.colorado.edu/imod/ | |
| Photoshop | Adobe | http://www.adobe.com/products/ photoshopfamily.html | |
| MATLAB | MathWorks | http://www.mathworks.com/ | |
| VLFeat | VLFeat | http://www.vlfeat.org/ |
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