Summary
मेटाबोलिक विकार मनुष्य में सबसे आम बीमारियों में से एक के बीच में हैं. आनुवंशिक रूप से विनयशील मॉडल जीव डी. मेलानोगास्टर चयापचय को विनियमित कि उपन्यास जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस पत्र में उनके सह 2 उत्पादन को मापने के द्वारा मक्खियों में चयापचय दर का अध्ययन की अनुमति देता है जो एक अपेक्षाकृत सरल विधि का वर्णन करता है.
Abstract
मेटाबोलिक विकार मानव स्वास्थ्य को प्रभावित करने के लिए एक लगातार समस्या है. इसलिए, चयापचय को विनियमित तंत्र समझ है कि एक महत्वपूर्ण वैज्ञानिक कार्य है. मानव में कई रोग के कारण जीन ड्रोसोफिला विभिन्न विकारों के विकास में शामिल संकेत दे रास्ते अध्ययन करने के लिए एक अच्छा मॉडल बनाने, एक मक्खी सजात है. इसके अतिरिक्त, ड्रोसोफिला की शिक्षणीयता चयापचय को विनियमित करते हैं कि उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों की पहचान करने में सहायता करने के लिए आनुवंशिक स्क्रीन सरल करता है. इस तरह के एक स्क्रीन प्रदर्शन करने के क्रम में मक्खियों की चयापचय राज्य में परिवर्तन की पहचान करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि आवश्यक है. सामान्य में, कार्बन डाइऑक्साइड उत्पादन सब्सट्रेट ऑक्सीकरण और ऊर्जा खर्च चयापचय राज्य के बारे में जानकारी उपलब्ध कराने का एक अच्छा संकेत है. इस प्रोटोकॉल में हम मक्खियों से सीओ 2 के उत्पादन को मापने के लिए एक सरल विधि का परिचय. इस तकनीक को संभावित चयापचय दर को प्रभावित करने आनुवंशिक perturbations की पहचान करने में सहायता कर सकते हैं.
Introduction
जैव रासायनिक क्रेब के चक्र कार्बोहाइड्रेट, वसा, और सीओ 2 के उत्पादन प्रोटीन से व्युत्पन्न एसीटेट के ऑक्सीकरण के माध्यम से एटीपी उत्पन्न करता है. ड्रोसोफिला में, ओ 2 इनपुट सीधे सीओ 2 उत्पादन के साथ सहसंबद्ध और चयापचय 1 के स्तर को दर्शाता है. इस प्रकार, सीओ 2 उत्पादन की माप सफलतापूर्वक उम्र बढ़ने और चयापचय 2-5 से संबंधित अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है. यहाँ हमारी प्रयोगशाला किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता के बिना अप करने के लिए अठारह नमूनों में सीओ 2 के उत्पादन की माप की अनुमति, पहले से डिज़ाइन किया प्रयोगात्मक setups में संशोधन किया है. दूसरों के लिए और हम पहले से पेशी dystrophy जुड़े प्रोटीन, dystroglycan (डीजी) 6-8 में कमी कर रहे हैं कि मक्खियों में चयापचय दर में अंतर दिखाने के लिए इस विधि का इस्तेमाल किया है.
हे oxidative चयापचय के लिए इस्तेमाल किया 2 सांस की बर्बादी के रूप में निष्कासित कर दिया है जो सीओ 2, में बदल जाती है. निर्माणहाथ से बनाई गई respirometers की tion ओ 2 भस्म की दर के निर्धारण के लिए अनुमति देता है वर्णन किया गया है. मक्खियों कुशलतापूर्वक गैसीय चरण से इसे नष्ट करने, सीओ 2 निष्कासित अवशोषित करने वाला एक पदार्थ के साथ एक मोहरबंद कंटेनर में रखा जाता है. गैस की मात्रा (कमी आई दबाव) में परिवर्तन बंद respirometer से जुड़ी एक गिलास केशिका में तरल पदार्थ के विस्थापन से मापा जाता है.
दूसरों पर इस तकनीक का मुख्य लाभ लागत है. पिछले अध्ययनों गैस analyzers और तकनीकी रूप से उन्नत respirometry सिस्टम 1,9 का उपयोग ड्रोसोफिला से सीओ 2 उत्पादन मापा है. अधिक जटिल उपकरणों के बावजूद, यहां वर्णित विधि की संवेदनशीलता की सूचना मूल्यों (तालिका 1) के समान है. साथ ही, कई अन्य समूहों ड्रोसोफिला 4-6 में रिश्तेदार चयापचय दर निर्धारित करने के लिए इस तकनीक के रूपांतरों का इस्तेमाल किया है. इसलिए, इस परख reliab उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैLe, किसी भी प्रयोगशाला में सेटअप किया जा सकता है और शैक्षिक उद्देश्यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो विशेष उपकरणों की खरीद के बिना ड्रोसोफिला चयापचय के लिए प्रासंगिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा.
सामान्य में, एक जीव की चयापचय निर्धारित करने के लिए स्वीकार कर लिया तकनीक सीओ 2 का उत्पादन मापने के लिए है, भस्म ओ 2, या दोनों 3,4,9. हालांकि, यह ओ 2 में से एक समकक्ष सीओ 2 के एक बराबर उत्पन्न करता है कि माना जा सकता है, सीओ 2 का सटीक अनुपात उत्पन्न 10 उपयोग चयापचय सब्सट्रेट पर निर्भर है. इस प्रकार, सही ऊर्जा इकाइयों में चयापचय दर निर्धारित करने के लिए यह हे 2 भस्म और सीओ 2 का उत्पादन दोनों को मापने के लिए आवश्यक है. इस के कारण, यहां वर्णित विधि जानवरों और नहीं निरपेक्ष मूल्य के बीच सीओ 2 उत्पादन में मतभेदों की तुलना करने के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है. हमारी तकनीक टिम की अवधि में कई पशु सीओ 2 उत्पादन को एकीकृतइसलिए ई (1-2 घंटे) और जानवरों की गतिविधि की एक औसत देता है. प्रायोगिक पशुओं माप अलग गतिविधि का स्तर और जरूरी नहीं कि चयापचय को प्रतिबिंबित सकता है नियंत्रण जानवरों से भी कम सक्रिय हैं कि विश्वास करने का कारण है तो.
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Protocol
Respirometers की 1. तैयारी
- 50 μl केशिका micropipette की प्रविष्टि की अनुमति के लिए एक धार के साथ 1,000 μl विंदुक टिप कट, यथासंभव सीधे पिपेट टिप पाने के लिए प्रयास करें.
- पिपेट में फोम का एक टुकड़ा प्लेस और पिपेट टिप में यह नीचे धक्का.
- सीओ शोषक 2 की एक छोटी राशि जोड़ें और फोम का एक दूसरा टुकड़ा द्वारा यह होते हैं.
- Micropipette पिपेट टिप में डाला जाता है जहां जगह पर गोंद लागू करें.
- गोंद सुखाने के लिए अनुमति देने के लिए रात भर respirometer छोड़ दें.
एक respirometer का एक योजनाबद्ध चित्रा 1 ए में दिखाया गया है.
मापन चैंबर के 2. तैयारी
- दिखाई colorization में परिणाम होगा कि एक अनुपात में eosin के साथ पानी के मिश्रण से चैम्बर समाधान तैयार करें.
- चेंबर में eosin / पानी के घोल डालो.
- एक सेंटीमीटर पैमाने के साथ कक्ष के पक्ष का एक लेबल.
- एक मार्कर के साथ व्यक्तिगत respirometers लेबल.
- 2 सीओ और प्रत्येक respirometer अंदर वांछित जीनोटाइप के 3-5 मक्खियों जगह के लिए एक वैकल्पिक पद्धति का उपयोग करके मक्खियों anesthetize.
- प्लास्टिसिन पोटीन का उपयोग कसकर शीर्ष पर respirometers सील.
- मक्खियों लगभग 15 मिनट के लिए anesthetization से उबरने के लिए अनुमति देते हैं.
- वायुमंडलीय नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा, जो मक्खियों के बिना एक respirometer तैयार करें.
4. प्रयोग का प्रदर्शन
- चैम्बर के शीर्ष पर ऊपर और नीचे खुला है कि एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब धारक संलग्न द्वारा चैम्बर में respirometers रुको.
- नीचे टिप रंग समाधान में डूब करने के लिए अनुमति चेंबर में micropipette टिप के साथ respirometers डालें.
- तापमान और दबाव fluct से मजबूत अलगाव प्रदान करने के ढक्कन कवर और कक्ष के बीच वैसलीन जोड़ेंuations.
- ढक्कन बंद करें और प्रणाली 15 मिनट के लिए संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं.
- प्रत्येक micropipette भीतर तरल का स्तर दिख रहा है कि सुनिश्चित करते हुए चैंबर के एक तस्वीर ले लो और इतने बड़े पैमाने पर (चित्रा 1 बी में दिखाए गए उदाहरण देखें) है.
- 1-2 घंटे के बाद, एक और तस्वीर ले लो.
- प्रयोग समाप्त हो गया है, respirometers से मक्खियों को हटा दें और अगर वांछित तौलना या आगे अगर जरूरत शीशी करने के लिए उन्हें वापस हस्तांतरण.
परिणाम के 5. विश्लेषण
- ओपन ImageJ सॉफ्टवेयर 11 का उपयोग कर छवियों का अधिग्रहण किया.
- प्रत्येक चित्र में पैमाने का उपयोग, सॉफ्टवेयर में पिक्सेल स्केलिंग सेट.
- तरल शुरुआत (डी 1) पर लिए गए चित्रों में एक निर्धारित संदर्भ मौके से कूच कि दूरी (Δd) और प्रयोग के अंत (डी 2) उपाय. एक योजनाबद्ध उदाहरण चित्रा 1C में दिखाया गया है.
- सूत्र के साथ उत्पादन सीओ 2 (μl / घंटा / मक्खी) की राशि की गणना:
सेंटीमीटर में micropipette ट्यूब के आर = त्रिज्या
Δd = दूरी तरल सेंटीमीटर में मापा नमूने परीक्षण के micropipette में ले जाया गया है
Δc = दूरी तरल (मक्खियों के बिना) नकारात्मक नियंत्रण नमूना के micropipette में ले जाया गया है
इस्तेमाल किया मक्खियों के एन = संख्या
ज = घंटे
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Representative Results
विधि हम जंगली प्रकार (ओरेगन आर) से सीओ 2 उत्पादन पुरुष 18, 25 पर मक्खियों, और 29 डिग्री सेल्सियस और डीजी के लिए उत्परिवर्ती मक्खियों मापा संवेदनशील है कि दिखाने के लिए. मक्खियों 25 डिग्री सेल्सियस पर उठाया और फिर पूर्व माप के लिए 5 दिनों के लिए प्रयोगात्मक तापमान में स्थानांतरित कर दिया गया. इस ectothermic प्रजातियों के लिए उम्मीद थी, सीओ 2 की मात्रा तापमान (चित्रा 2) के साथ वृद्धि हुई उत्पादित. हम अतीत में एक चीनी मुक्त आहार दोनों जंगली प्रकार की चयापचय दर कम कर देता है और महानिदेशक उत्परिवर्ती 7 मक्खियों दिखाया है. डीजी के नुकसान वृद्धि हुई चयापचय स्तर (चित्रा 2) की ओर जाता है.
मक्खियों में सीओ 2 के उत्पादन को मापने के लिए चित्रा 1. सेटअप. ए योजनाबद्ध टी दिखासीओ 2 माप के दौरान चैंबर के वह व्यक्ति respirometer का निर्माण. बी तस्वीर. पत्र respirometers की स्थिति निशान. कार्यक्षेत्र संख्या सेंटीमीटर में बड़े पैमाने संकेत मिलता है. प्रयोग के दौरान परिवर्तन दिखा सी. योजनाबद्ध. ग्रीन लाइन संदर्भ हाजिर (डी 1) इंगित करता है, नीला 2 घंटे (डी 2) के बाद तरल की अंतिम स्थिति को इंगित करता है. Δd तरल micropipette में कूच किया है दूरी है.
चित्रा 2. अलग तापमान और डीजी म्यूटेंट में कम से मक्खियों में सीओ 2 उत्पादन. हाउसिंग तापमान सकारात्मक ड्रोसोफिला में सीओ 2 के उत्पादन के साथ संबद्ध है और काफी महानिदेशक म्यूटेंट में वृद्धि हुई है. त्रुटि सलाखों *** पी ≤ 0, चार व्यक्ति प्रयोगों से SEM का संकेत.01.
| (Μl / मक्खी एक्स घंटे) | प्रयुक्त उपकरण | संदर्भ |
| 2-3 सीओ 2 | सीओ 2 गैस विश्लेषक | (वान Voorhies, Khazaeli एट अल. 2004) |
| 4.68 ± 1.04 सीओ 2 | सीओ 2 respirometry प्रणाली | (Khazaeli, वान Voorhies एट अल. 2005) |
| 2.9-6.2 ओ 2 | इसी प्रकार से डिजाइन respirometers | (Hulbert, क्लेंसी एट. 2004 अल) |
| 2.20 ± 0.15 ओ 2 | वर्णित यहाँ हस्तनिर्मित respirometers | (Kucherenko, एट अल. 2011 Marrone) |
| * तालिका मान 25 डिग्री सेल्सियस मापा मक्खियों के संख्यात्मक मान है कि रिपोर्ट के अध्ययन से कर रहे हैं |
तालिका 1. तुलना करेंड्रोसोफिला से सीओ 2 उत्पादन मापने के लिए इस्तेमाल की विभिन्न तकनीकों.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम मक्खियों में सीओ 2 के उत्पादन को मापने के लिए एक सस्ती और विश्वसनीय विधि का वर्णन. हम इस प्रयोग का संचालन करने के लिए त्वरित, आसान है और अन्य अध्ययनों से 1, 6, 9 के साथ समझौते में है कि प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा उत्पन्न करता है पाया. यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल आसानी से किसी भी प्रयोगशाला के बजट और उपलब्ध सामग्री फिट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. प्रत्येक व्यक्ति respirometer के निर्माण के रूप में लंबे समय के चैम्बर वायुरोधी रहता है के रूप में रूपांतरित किया जा सकता है. हालांकि, लंबे समय तक, पतली micropipettes छोटे लोगों पर अधिक सटीक प्रदान करते हैं. बाहरी कक्ष के उपयोग के रूप में लंबे समय तक प्रयोग समझौता करने के लिए कोई महत्वपूर्ण परिवेश के तापमान और दबाव में परिवर्तन के रूप में वहाँ वैकल्पिक जा सकता है. इस नकारात्मक नियंत्रण और जैविक नमूने माप के भीतर एक बड़ी परिवर्तनशीलता के विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया जा सकता है. इसके अतिरिक्त, सीओ 2 शोषक के रूप में लंबे समय तक यह च के लिए विषाक्त नहीं है के रूप में किसी भी किस्म के हो सकते हैंझूठ (जैसे, पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड). यह तकनीक ठीक से काम कर रहा है यह सुनिश्चित करने के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है. respirometer पूरी तरह से सील किया जा नहीं करने के लिए सबसे आम समस्या है. यदि यह मामला है, तो माप नकारात्मक नियंत्रण के बराबर हो जाएगा. अतिरिक्त समस्याओं के कारण anesthetization से उबरने के लिए समय नहीं था या नाश किया है कि मक्खियों को पैदा हो सकता.
इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम respirometer का निर्माण है. ऊपर बताया गया है, respirometer airtight किया जाना चाहिए. बड़ा पिपेट चैम्बर के लिए micropipette की कुर्की सही गोंद के साथ किया जाना चाहिए. एक और रबर की तरह चिपकने वाला सबसे अच्छा काम किया है. यह पूरा होने के बाद चिपके संरचना में किसी भी समझौते का पालन करने के लिए एक खुर्दबीन के नीचे respirometers का निरीक्षण करने के लिए सिफारिश की है. इसके अतिरिक्त, मक्खियों के अंदर रखा गया है के बाद respirometer की सीलिंग बहुत महत्वपूर्ण है. पोटीन घंटे का उपयोगसबसे अच्छा काम करने के लिए मिल गया है और बार बार विफल रहता है किया गया है. आयल बहुत खराब काम करने के लिए पाया गया है और बचा जाना चाहिए. गैस की मात्रा को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है कि तरल भी बहुत महत्वपूर्ण है और मेनोमीटर का होना चाहिए. जल इसलिए सबसे अच्छा विकल्प है. यह respirometer बेकार बना केशिका में कठोर कर सकते हैं क्योंकि स्याही का उपयोग अनुशंसित नहीं है. हम उनके सीओ 2 उत्पादन अत्यधिक चर हो सकता है कि देखा, क्योंकि यह भी महिलाओं के पुनरुत्पादन का उपयोग नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है. इसके अलावा मक्खियों की उम्र महत्वपूर्ण है, इसलिए तुलना की जाती है कि मक्खियों एक ही उम्र का होना चाहिए. हमारे परीक्षण में हम 5 दिन पुराने पुरुषों इस्तेमाल किया. मक्खियों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि भी महत्वपूर्ण है. म्यूटेंट की तुलना में जब नियंत्रण मक्खियों ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि का होना चाहिए. आंकड़े यह भी मक्खियों के आकार में महत्वपूर्ण मतभेद हैं अगर परख प्रदर्शन के बाद मक्खियों के द्रव्यमान को मापने के द्वारा (μl / घंटा / मिलीग्राम) के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है. हमारे हाथ में, एक जंगली प्रकार मक्खी एन = 1 (0.80 ± 0.11 मिलीग्राम वजन80). यह भी प्रयोग के समय के दौरान, औसत चयापचय दर के मूल्यों को प्राप्त कर रहे हैं कि बताया जाना चाहिए. हम भी यह एक व्यक्ति मक्खी को मापने के लिए संभव है कि मिल गया है, लेकिन हम 3-5 मक्खियों का उपयोग सबसे ज्यादा सटीक हासिल की. मक्खियों के लिए respirometer में उपलब्ध अंतरिक्ष वे भीड़ नहीं लग रहा है कि पर्याप्त है, लेकिन एक ही समय में वे अधिकता चलने के लिए जगह नहीं है: इसलिए दोषपूर्ण geotaxis सीओ 2 उत्पादन के स्तर पर कोई असर नहीं होना चाहिए.
मक्खियों लंबे विकासात्मक जीव विज्ञान, कोशिका जीव विज्ञान, और तंत्रिका जीव विज्ञान से जुड़े हुए हैं कि मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए प्रमुख मॉडल जीवों में से एक के रूप में स्थापित किया गया है. हाल के अध्ययन का एक नंबर मक्खियों आसानी से (12, 13 में समीक्षा) के रूप में अच्छी तरह से ऊर्जा homeostasis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है दिखाया है. यहाँ प्रस्तुत विधि आसानी संभवतः मुझे नियंत्रित करने में शामिल नए आणविक घटकों की पहचान करने के लिए आनुवंशिक स्क्रीन में इस्तेमाल किया जा सकता हैपिछले अधिक सटीक और महंगे उपकरण खरीदने के लिए tabolic राज्य. इस प्रकार अब तक इस तरह के स्क्रीन के बहुमत अधिक उन्नत पढ़ाई warranted रहे हैं यह दर्शाता है कि केवल सेल संस्कृति में किया गया.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम अपने अनुसंधान के वित्तपोषण के लिए मैक्स प्लैंक सोसायटी को धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BlauBrand IntraMark 50 µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Tweezers | Any |
References
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