Summary
القيطم المورق الضفادع الصغيرة يفضلون السباحة على الجانب الأبيض من الأسود / الأبيض دبابة. ويسترشد هذا السلوك حسب رؤيتهم. بناء على هذا السلوك، نقدم مقايسة بسيطة لاختبار وظيفة البصرية من الضفادع الصغيرة.
Abstract
قياس وظيفة البصرية في الضفادع الصغيرة من الضفادع، القيطم المورق، ويسمح الفحص للعمى في الحيوانات الحية. استجابة حركة العين هو القائم على الرؤية، والسلوك الانعكاسي التي لوحظت في جميع الفقاريات التي تم اختبارها. عيون الشرغوف هي صغيرة جدا كانت تستخدم الاستجابة الذيل الوجه كإجراء بديل، الأمر الذي يتطلب تدريب فني لتسجيل استجابة خفية. وضعنا مقايسة السلوك البديلة استنادا إلى حقيقة أن الضفادع الصغيرة يفضلون السباحة على الجانب الأبيض من دبابة عند وضعه في خزان مع الجانبين على حد سواء بالأبيض والأسود. مقايسة المقدمة هنا هي غير مكلفة، والبديل بسيط هو أن يخلق الاستجابة التي يتم قياسها بسهولة. يتكون الإعداد ترايبود، وكاميرا ويب والدبابات اختبار متداخلة، متوفرة في معظم المختبرات القيطم. يتضمن هذا المقال فيلم يظهر سلوك الضفادع الصغيرة، قبل وبعد قطع العصب البصري. من أجل اختبار وظيفة عين واحدة، ونحن تشمل أيضا تمثيلاالنتائج sentative من الشرغوف الذي خضع كل عين axotomy الشبكية في أيام متتالية. يمكن أن الدراسات المستقبلية تطوير نسخة من هذا الاختبار الآلي لاختبار رؤية العديد من الضفادع الصغيرة في آن واحد.
Introduction
وقد استخدمت المورق القيطم كما كائن نموذج لدراسة تشكيل العين. عيون تتطور بسرعة، وتزايد إلى النضج في أقل من أسبوع لاختبار الجينات أو الممرات التي يكون لها تأثير على تطوير البصرية وظيفة. لاختبار وظيفة البصرية، وقد استخدمت استجابة حركة العين وoptomotor في الزرد والشراغف القيطم، على التوالي 1،2. لأن عيون الضفادع الضفدع هي أصغر نسبيا من الزرد، ويتطلب هذا الاختبار استخدام المعدات المتخصصة والموظفين المدربين للكشف عن ذيل الوجه وحركة العين السلوك خفية في القيطم. A السلوك أكثر قوة في القيطم هو تفضيل السباحة في خزان مع خلفية بيضاء، الذي يوصف هنا 3. عند وضع الشرغوف في أسود / أبيض نصف خزان نصف، الشرغوف قبل المتحولة تسبح بسرعة إلى الجانب الأبيض من الخزان. كنا في السابق هذا الاختبار لتحديد ما إذا المستمدة الخلايا المحفزةكانت عيناه الوظيفية 4. هنا، ونحن التقرير نسخة مفصلة من هذا الاختبار، والتي يمكن استخدامها لاختبار وظيفة البصرية من الضفادع الصغيرة القيطم premetamorphic.
هذا الاختبار هو أبسط من فحص استجابة optomotor، نظرا لأنه لا يتطلب سوى كاميرا الفيديو الرقمية التي شنت، برنامج الكاميرا الرقمية والمعدات القياسية وجدت في معظم المختبرات القيطم. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب استجابة تسجل أي تدريب خاص لنتائج الفرز. نتائجنا تظهر الممثلة أن نفس المجموعة من الضفادع الصغيرة، بعد أن خضع axotomy الشبكية مزدوجة، والسباحة بشكل عشوائي في جميع أنحاء دبابات. أدرجنا أيضا نتائج فحص السلوك من الشرغوف ممثل، والتي تبين كيف يمكن اختبار عين واحدة للاستجابة بصرية. وقد أدرجت ورقة العمل بحيث أرقام المكتسبة خلال الفحص يمكن إدراجها وتحليلها. ويمكن استخدام ورقة العمل هذه إلى تحديد ما إذا كان اختبار الضفادع الصغيرة لديها استجابة بصرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
رعاية الحيوان
والقيطم المورق كانت تزرع الضفادع الصغيرة المستخدمة في هذه الدراسة، التي أثيرت ويعامل وفقا للإجراءات المعتمدة من قبل جامعة شمالي ولاية الطبية IACUC ودليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1 الإعداد ما قبل السلوك: الشراغف
- الحصول على الأجنة المخصبة القيطم من مصدر متاح تجاريا أو إخصاب البويضات في المختبر، كما هو موضح سابقا 6.
- وضع الأريمة إلى العصبية الأجنة لوحة خشبة المسرح في 18 ˚ C في 60 ملم أطباق بتري تحتوي 0.1X MMR [10 معدلة الأسهم (MMR) حل رينغر X مارك في (10 ملم MgCl 2 و 20 ملي بوكل، و 20 مم CaCl 2 و 50 ملي HEPES؛ 1 M كلوريد الصوديوم؛ تعديلها لدرجة الحموضة 7.5، تعقيمها وتخزينها في RT)] مع المضادات الحيوية الجنتاميسين 50 ميكروغرام / مل. تغيير 0.1X MMR كل يوم، وإزالة أي أجنة ميتة.
- مرة واحدة الأجنة تصل Nieuwkoop وفابر المرحلة ~ 27-30 يوليو، والتبديل عشرالأجنة الإلكترونية في 0.1X MMR دون المضادات الحيوية للسماح نمو الأمعاء البكتيرية.
- تنمو الشراغيف حتى يصلوا إلى مرحلة الرضاعة (مرحلة 45) ونقلها الى 100 ملم بيتري أطباق مليئة 0.1X MMR. إطعامهم نبات القراص مسحوق طاف كل يوم لمدة أسبوع، وتغيير 0.1X MMR يوم التدخل.
- بعد أسبوع واحد في طبق بتري 100 ملم، نقل الحيوانات إلى نصف غالون الدبابات مليئة الضفدع المياه [0.5 غرام / لتر المحيط الفورية و 2 ملي الصوديوم ثنائي القاعدة فوسفات (نا 2 هبو 4: ميغاواط 141.96) درجة الحموضة 6.8]. إطعامهم كما في الخطوة 2.4، ولكن تغيير الماء فقط 2-3 مرات في الأسبوع عندما الماء عكرا. الحفاظ على الحيوانات في 12 ساعة light/12 دورة ضوء الظلام مع أضواء على تحول في الساعة 6 صباحا.
- وضع خزان نصف غالون مع اختبار المواضيع على سطح أبيض مثل مقعد underpad المختبر، لا يقل عن 12 ساعة O / N، قبل الاختبار.
- الضفادع الصغيرة في مراحل الاختبار 45-50 كما هو موضح في الخطوة 3 أدناه.
2 إعداد ما قبل السلوك: إقويبمنر
- تخصيص مساحة المختبر لفحص السلوك. ينبغي أن يكون في منطقة هادئة ومنخفضة الزيارات مع الإضاءة الفلورسنت القياسية.
- إعداد الدبابات اختبار للحيوانات.
وتتألف والدبابات اختبار نصف غالون متداخلة من جزأين: دبابة الداخلية التي ستعقد الماء والضفادع الصغيرة؛ ودبابة الخارجي مع التحفيز البصري.- للخزان الداخلي، وجعل علامة صغيرة على زوايا خارج مع شربي، 5 سم من الأسفل؛ هذا هو خط المياه (الشكل 1A، خط منقط الأخضر).
- أيضا، لالخزان الداخلي، وملء divets في الخزان (في الزوايا والوسط) مع مركب خامل، مثل Sylgard المطاط الصناعي. ملاحظة: إن الضفادع الصغيرة ما زالت قائمة في هذه المناطق إذا لم يتم ردمها
- للخزان الخارجي، وتغطية واحد بالضبط نصف خارج خزان واحد مع شريط أسود الكهربائية، والنصف الآخر مع الأنسجة ورقة بيضاء الشكل 1B.
- وضع الدبابات علىبتلقيح القرص الدوار.
- إعداد الكاميرا / ترايبود بحيث يكون فوق الدبابات الاختبار. ضبط الكاميرا للسماح التصور من منطقة الاختبار، كما هو مبين في الشكل 1C.
- توصيل الكاميرا إلى جهاز كمبيوتر مع برنامج كويك تايم بلاير تثبيت 5. بدوره على الكاميرا. في لاعب كويك تايم، تحت ملف، حدد "تسجيل فيلم جديد". سوف الإعداد فحص السلوك تكون مرئية على جهاز الكمبيوتر على الفور.
- ثنى قطعة قماش قطنية خفيفة خلال الإعداد بأكمله للحد من الاشارات الخارجية التي يمكن أن تؤثر على سلوك الشرغوف، وكذلك، والحد من الضوء المنعكس على سطح الماء.
- تأكد من أن الإنارة في إطار التدابير القماش بين 35-50 شمعة / م 2.
3. سلوك الفحص
- ملء خزان الاختبار الداخلي إلى علامة 5 سم المياه في الخطوة 1.2.1 بالماء الضفدع.
- باستخدام شبكة صغيرة، تتحرك بلطف الحيوان في خزان الاختبار الداخلي.
- مفتوحة سuickTime البرنامج على جهاز الكمبيوتر و، وذلك باستخدام خزان الخارجي كدليل، تأكد من أن الكاميرا قادرة على تصور وتسجل منطقة الاختبار.
- كتابة اسم حيوان، التاريخ والوقت على قطعة من الورق، وسجل مع الكاميرا.
- وضع خزان اختبار في خزان الخارجي مع الجانب الأسود من الخزان إلى اليمين الشكل 2.
- بدء تسجيل الفيلم مباشرة بعد ترتيب خزان وتعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 2 دقيقة.
- عندما الصفافير الموقت، وإزالة خزان الاختبار الداخلي، وتناوب على خزان الخارجي 180 درجة ووضع خزان الاختبار الداخلي داخل الخزان الخارجي. بدء موقت. ملاحظة: يجب أن يكون الجانب الأسود الآن على الجانب الآخر.
- كرر الخطوة 3.7، ثماني مرات أكثر ليصبح المجموع عشر تجارب. استخدام الشكل 2 كدليل، والتحقق من كل محاكمة.
- تكرار فحص السلوك على يومين منفصلين.
4. الشبكية Axotomy
- وضع الحيوان في 0.02٪ تريكين حتى أنها لا تستجيبلقرصة الذيل مع # 3 ملقط.
- تذوب 1٪ الاغاروز في 0.1X MMR ومن ثم إضافتها إلى طبق بتري 60 مم. مرة واحدة تبرد، وجعل ديفت مستطيلة صغيرة في الاغاروز وإضافة الشرغوف إلى ديفت مع قليلا بنسبة 0.02٪ تريكين، بحيث يتم المغمورة جزئيا الحيوان في السائل.
- يخترق الجلد في زاوية 45 درجة وراء ظهري المنطقة من العين مع إبرة 25 G، في حين تستعد الحيوان ضد ملقط على الجانب المقابل.
- مع الحرص على عدم قص الوريد، والتي تقع بالقرب من العصب البصري، والوصول إلى بعناية في الحفرة مع # 5 ملقط، قص العصب البصري والوجه للخروج من الطريق. إذا كان هناك نزيف حاد بسبب القص بالصدفه الشريان، ثم ضع بسرعة الحيوان في 2٪ تريكين إلى الموت ببطء. تحذير: 2٪ محلول تريكين يمكن أن تسبب خدر في البشر. وينبغي التعامل مع هذا الحل مع قفازات.
- لاستعادة الحيوان بعد الجراحة، ووضع الحيوان في 100 مم طبق بتري مع 0.7X MMR و 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين لمدة 20 دقيقة. شمال شرقXT، ونقل الشرغوف إلى خزان المياه الانتعاش مع الضفدع. دعونا بقية الحيوانات O / N.
- في صباح اليوم التالي، اختبار وظيفة البصرية كما هو موضح أعلاه (الخطوات 3،1-3،9).
5. تحليل نتائج
- بعد الانتهاء من المحاكمات، وقياس مقدار الوقت يبقى الشرغوف على الجانب الأسود من الخزان.
- عرض الفيديو باستخدام برنامج الذي يعرض الوقت ويسمح التوقف المتكرر يدويا. ننظر في ذلك الوقت عرض الفيديو. كتابة بدء محاكمة اثنين من دقيقة، وهو عندما أعشاش الخزان الداخلي بنجاح داخل الخزان الخارجي والمربعة في ضوء الكاميرا.
- استخدام موقف عيون الشرغوف لتحديد أي جانب من خزان الحيوانات والسباحة على. تحديد عبور من جانب واحد من الدبابة إلى أخرى إلا عندما عبروا كلتا العينين و/ خط أبيض أسود.
- أكتب بداية ونهاية كل فترة (في ثانية) أن الحيوان تنفق على الجانب الأسود. وقفة وإعادةالرياح الفيديو لضمان الدقة. مجموع المجلس الأعلى للتعليم في كل محاكمة.
- إدخال هذه الأرقام في ورقة عمل السلوك المرفقة. سوف رقة عمل حساب نسبة الوقت الذي قضى الحيوان على الجانب الأبيض من خلال طرح الوقت الذي يقضيه على الجانب الأسود للدبابات من مجموع 120 ثانية المحاكمة والقسمة الوقت الإجمالي في ثانية [(120 - مجموع ثواني تنفق على الجانب الأسود) / 120 ثانية]. المتوسطات ورقة العمل هذه النسبة على جميع التجارب 10.
- استخدام اختبار T-طالب، وإرفاقها، توزيع ثنائي الطرف لتحديد ما إذا كانت التجارب بين الأيام هي معنوية (P ≤ 0.05).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وقد أظهرت تقارير سابقة أن الضفادع الصغيرة القيطم premetamorphic يفضلون السباحة على الجانب الأبيض من الأسود / الأبيض دبابة ودعا هذا الاختبار، ولون الخلفية ميول الفحص 3 لقد غيرنا هذا الاختبار من أجل اختبار وظيفة البصرية من العين إما من الضفادع الصغيرة في أقل من أسبوع. في هذه الطريقة، عيونهم يمكن جمعها للفحص النسيجي.
نعرض هنا كيف هو الرد بسبب الإشارات البصرية. في الفيلم 1، والضفادع الصغيرة في لوحات اليسار واليمين هي نفسها الحيوانات. على اليسار هي الحيوانات قبل الجراحة وعلى الحق، والحيوانات على حد سواء بعد قطع الأعصاب البصرية. نحن ملتف المياه لإظهار أن يتم إضافة أي شيء لصد الحيوانات من الجانب الأسود أو جذبهم إلى الجانب الأبيض. في الفيلم، ونحن نقدم التخطيطي من الضفادع الصغيرة في الزوايا السفلية، مما يدل على حالة من العصب البصري لكل مجموعة من الحيوانات. في الفيلم 1، والعادية، شالضفادع الصغيرة ن تديرها الرد على لون الخلفية في أقل من 30 ثانية في خزان اختبار في حين أن الضفادع الصغيرة أعمى تسبح على غير هدى حول الخزان. تم زيادة سرعة الأفلام والوقت الفعلي المسجل في الزاوية العليا اليمنى.
لاختبار الرؤية من عين واحدة، ولقد تضمنت النتائج من حيوان الذي بترت في عين واحدة واختبارها في فحص العصب البصري لدينا. وقد قطعت العصب البصري في العين الأخرى بعد يومين من الاختبار، واختبار سلوك موجهة الرؤية في الأيام التالية مرة أخرى. في الشكل 3، رسم بياني يوضح مقدار الوقت اختار الشرغوف السباحة على الجانب الأسود من الخزان. وقد تم قياس هذا على ستة أيام متتالية الشكل 3A. كما هو موضح أعلاه، وقد قطعت العصب البصري مباشرة بعد تم اختبار السلوك في يوم 2 واليسار، بعد اختبار السلوك في يوم 4. والشرغوف يفضل الجانب الأبيض للدبابات بشكل عشوائي على 50٪ من الشكل 3C الوقت. تلاحظ أن لامال تنفق المزيد من الوقت على الجانب الأبيض من الخزان خلال 6 تجارب الماضي في أيام 1 إلى 4. كان مقدار الوقت الذي يقضيه على الجانب الأسود أكثر حتى في أيام 5 و 6، وعندما كان الحيوان الأعمى في كلتا العينين. وبلغ متوسط النتائج من كل من اليومين معا ويعرض في الشكل 3C شكل رسم بياني.
الشكل 1. التجريبية مجموعة المتابعة موجهة من رؤية سلوك الفحص. (A) لا يزال خزان الاختبار الداخلي شفافة ويتم وضع علامة تشير إلى مستويات مياه (أخضر متقطع خطوط في الزاوية). (B) وتغطي خزان الاختبار الخارجي باللون الأسود الشريط الكهربائي على نصف والأنسجة ورقة بيضاء من جهة أخرى. (C) وتصور والضفادع الصغيرة باستخدام كاميرا ويب وضعها على ترايبود وصله بجهاز الكمبيوتر المحمولة. خزان الاختبار ق بقية على أسطوانات بتلقيح للسماح لسهولة تحول بين التجارب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. تخطيطي لكيفية تنفيذ الرؤية الموجهة السلوك الفحص. تمثل المستطيلات خزان الاختبار، والتي تبين كيف أن نصف أبيض / نصف التغييرات المنطقة السوداء مع كل محاكمة. وهذا يمكن أن تستخدم أثناء فحص السلوك للاحتفال عدد المحاكمة. خزان الاختبار على الحق هو مقرب من الشرغوف وسلوكها المتوقع خلال اثنين دقيقة الفحص. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
هين الصفحات = "دائما"> 
الرقم 3. تجربة ممثل فرز النسبة المئوية للوقت وسبح الشرغوف على الجانب الأبيض من خزان الاختبار. (A) هو مقدار ثانية قياس الشرغوف تنفق على الجانب الأسود من الخزان ووضعها في جدول (B ) يتم تحويل الجدول في A في نسبة الوقت الذي يقضيه من الجانب الأبيض من الخزان. يتم ذلك عن طريق طرح ثانية تنفق على الجانب الأسود من وقت المحاكمة مجموعه (120 ثانية) وقسمة 120 ثانية. الضفادع الصغيرة التي كانت غير المعالجة (U)، وكان axotomy واحد (SA) ومن ثم تم اختبار axotomy مزدوجة (DA). (C) والرسم البياني يمثل متوسط النسبة المئوية للوقت الذي يقضيه في الجانب الأبيض (شريط أبيض) والجانب الأسود ( شريط أسود). يظهر الجدول المستخدمة لجعل الرسم البياني أدناه.g3highres.jpg "الهدف =" _blank "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الفيلم 1. استجابة السلوكية للحيوانات النظر والمكفوفين في خلفية بيضاء تفضيل الفحص. الشراغف في لوحات اليسار واليمين هي نفسها، ولكن خضعوا هم على الحق axotomy الشبكية مزدوجة. والتخطيطي في زوايا أسفل إلى ما إذا كان العصب البصري سليمة أو مقطوعة (الشريط الأزرق). جهاز ضبط الوقت في الزاوية العليا اليمنى يشير الوقت. واسرعت الفيلم يصل لعرض أسهل. مرة واحدة في المنطقة البيضاء، لاحظ كيف تسبح الشراغيف على مقربة من الحدود بين اتجاه الأبيض والأسود والعكس. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.
| داذ 1 | يوم 2 | يوم 3 | اليوم 4 | يوم 5 | يوم 6 | |
| محاكمة 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| محاكمة 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| محاكمة 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| محاكمة 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| محاكمة 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 </ الدفتيريا> | 0 |
| محاكمة 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| محاكمة 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| محاكمة 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| محاكمة 9 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| محاكمة 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| نسبة الوقت المخصص للجانب الأبيض | ||||||
| نسبة 1 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| نسبة 2 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| نسبة 3 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| نسبة 4 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| نسبة 5 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| نسبة 6 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| نسبة 7 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| نسبة 8 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| نسبة 9 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| نسبة 10 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 |
| متوسط | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | 1.00 | <الدفتيريا> 1.00|
| يوم 1 | يوم 2 | يوم 3 | اليوم 4 | يوم 5 | يوم 6 | |
| محاكمة 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 69 | 69 |
| محاكمة 2 | 0 | 3 | 0 | 88 | 68 | 58 |
| محاكمة 3 | 7 | 0 | 28 | 0 | 58 | 47 |
| محاكمة 4 | 0 | 0 | 11 | 0 | 59 | 72 |
| محاكمة 5 | 0 | 0 | 7 | 22 | 57 | 57 |
| محاكمة 6 | 1 | 98 | 4 | 56 | 69 | 53 |
| محاكمة 7 | 0 | 13 | 33 | 24 | 44 | 57 |
| محاكمة 8 | 0 | 113 | 38 | 24 | 36 | 64 |
| محاكمة 9 | 0 | 0 | 4 | 43 | 60 | 57 |
| محاكمة 10 | 1 | 21 | 0 | 32 | 63 | 80 |
| نسبة الوقت المخصص للجانب الأبيض > | ||||||
| نسبة 1 | 100٪ | 100٪ | 100٪ | 100٪ | 43٪ | 43٪ |
| نسبة 2 | 100٪ | 98٪ | 100٪ | 27٪ | 43٪ | 52٪ |
| نسبة 3 | 94٪ | 100٪ | 77٪ | 100٪ | 52٪ | 61٪ |
| نسبة 4 | 100٪ | 100٪ | 91٪ | 100٪ | 51٪ | 40٪ |
| نسبة 5 | 100٪ | 100٪ | 94٪ | 82٪ | 53٪ | 53٪ |
| 99٪ | 18٪ | 97٪ | 53٪ | 43٪ | 56٪ | |
| نسبة 7 | 100٪ | 89٪ | 73٪ | 80٪ | 63٪ | 53٪ |
| نسبة 8 | 100٪ | 6٪ | 68٪ | 80٪ | 70٪ | 47٪ |
| نسبة 9 | 100٪ | 100٪ | 97٪ | 64٪ | 50٪ | 53٪ |
| نسبة 10 | 99٪ | 83٪ | 100٪ | 73٪ | 48٪ | 33٪ |
| متوسط | 99٪ | 79٪ | 90٪ | 76٪ | 51٪ | 49٪ |
ورقة العمل 1. الأبيض خلفية تفضيل رقة عمل الفحص. ورقة العمل هذه لديها حسابات بنيت في بحيث يمكن استخدامه لإدخال الأرقام والنتائج رصيده.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا التقرير مقايسة السلوكية الموجهة الرؤية البسيطة التي يمكن القيام بها بسهولة في أقل من أسبوع من قبل أفراد مدربين مختبر الحد الأدنى. بينما فحوصات أخرى تتطلب معدات متخصصة وخبرة في سلوك الحيوان، هذا الاختبار يسمح اختبار سريع لتحديد وظيفة البصرية. وقد تم تطوير فحص السلوكية آخر، وتجنب الفحص المرئي، لتحديد كيفية مساهمة السقف إلى الإدراك البصري في القيطم 10. وذكرت هذه التدابير فحص ضبط المكانية وحساسية التباين في استجابة لتتحرك مقابل خلفية مستقرة، وبالتالي، يمكن قياس السلوك القائم على رؤية أكثر تخصصا من مقايسة بسيطة هنا. وقد تم الإبلاغ عن سلوك نظام الآلي الذي يمكن قياس مقدار الوقت الذي يقضيه على جانب واحد من الدبابة 8. وهناك أيضا البرامج المتوفرة تجاريا (مثل برنامج ANY-المتاهة) التي استخدمت لقياس مقدار الوقت الزرد تنفق في بيئات مظلمة أو مشرقة 9. وعلىssay نفيدكم هنا لا يتطلب شراء هذه الأنواع من المعدات أو البرمجيات باهظة الثمن، ولكن بدلا من ذلك يعتمد على الكواشف والمعدات اليومية لقياس وظيفة البصرية.
يتم إجراء الفحص موجهة الرؤية على حيوان واحد لاختبار وظيفتها البصرية. عند مقارنة نتائج الفحص السلوكية لعدة الضفادع الصغيرة مع بعضها البعض، لاحظنا لا فرق إحصائية بين الحيوانات ضمن مجموعات العلاج. اختبرنا ثلاث الضفادع الصغيرة على ستة أيام متتالية واختبارها خمسة حيوانات أخرى على ثلاثة أيام متتالية، وتشغيل عشر تجارب يوميا أيضا. في كلتا الحالتين، لم نجد أي تغييرات ذات دلالة إحصائية بين المجموعات axotomy غير المعالجة أو واحد (P = 0.2067)، بعد الحصول على تغيير دلالة إحصائية عند مقارنة هذه الحيوانات إلى مجموعة مزدوجة axotomy (P = 0.002). وقد تم قياس هذا باستخدام برامج بريزم 6.0C تشغيل 2 في اتجاه وأنوفا اختبار الإحصائية مع عدة التجارب المقارنة لتوكي (ن = 8 الضفادع الصغيرة). لديك الأقصىكمية من نقاط البيانات قبل الجراحة، نقترح استخدام مقايسة سلوك ستة أيام. إذا كان بحاجة إلى النتائج التي سيتم الحصول عليها أسرع مع انحطاط أقل للأنسجة، نقترح استخدام النظام لمدة ثلاثة أيام.
هذا الاختبار باختبار حيوان واحد في وقت واحد. أجرينا دراسات تجريبية لمعرفة ما إذا كان يمكن قياس اثنين من الضفادع الصغيرة أو أكثر في وقت واحد. لتحديد ما إذا كان وجود اثنين من الضفادع الصغيرة في خزان واحد المتضررين تفضيلها للجانب الأبيض للدبابات، ونحن اختبار كل على حدة ثم الشرغوف معا. منذ أخذت الصور فوق دبابة، إذا سبح الشراغيف فوق أو تحت بعضها البعض لأية فترة من الوقت، وجدنا أنه من الصعب تمييزها عن بعضها البعض. إذا كنا الضفادع الصغيرة من مختلف الأحجام، لاحظنا أن أحد أكبر سيؤثر حيث سبح أصغر واحد. يمكن تطوير التقنيات المستقبلية لعلامة الضفادع الصغيرة وراثيا، والتي من شأنها أن تسمح تتبع أفضل من الحيوانات متعددة من نفس الحجم.
في أداء هذا الاختبار على عشرات TADPOليه، لاحظنا أن بعض الضفادع الصغيرة يفضل الجانب الأبيض أكثر اتساقا من غيرهم. الضفادع الصغيرة، التي تفاوتت من أكثر من 10٪ في يومين متتاليين السلوك، ونحن سيستغرق تم اختبار مرة أخرى في اليوم الثالث قبل الجراحة. قد يكون هذا بسبب ملاحظة أخرى: لاحظنا أن وضع الحيوانات على خلفية بيضاء مصنوعة أيضا اختلاف في تفضيلها للجانب الأبيض من دبابات. وجود ذلك اليوم اضافية قد ساعدت بعض الضفادع الصغيرة بشرط أن يفضل الجانب الأبيض من الخزان. وجود قيود من هذا الاختبار هو أنه اختبارات وظيفة البصرية فقط. التباين لاحظنا يمكن أن يكون بسبب عيوب التنموية الأخرى، إلى جانب انخفاض وظيفة البصرية أو العمى. لهذا السبب، لم يتم اختبار الحيوانات التي أظهرت تفضيل أقل من 60٪ قبل الجراحة أخرى.
نحن أيضا اختبار مجموعة من الضفادع الصغيرة سن ما قبل المتحولة. وجدنا أن الضفادع الصغيرة الذين تقل أعمارهم عن 45 مرحلة كانت صغيرة جدا، وكانت عيونهم الصعب تتبع باستخدام نحن لديناbcam. الضفادع الصغيرة السن (مراحل 51-55 +) كانت أكثر مشتتا؛ على الرغم من أنها تنفق المزيد من الوقت في نهاية المطاف على الجانب الأبيض للدبابات، يبدو أنها تستغرق وقتا أطول في السباحة هناك. وكانت هذه الحيوانات الأكبر سنا أكبر، وبالتالي، من الأسهل لتتبع، ولكن هناك حاجة اختبار قبل الجراحة كما هو مذكور أعلاه. في المقابل، تصرف غالبية الضفادع الصغيرة في مرحلة 45 إلى 50 كما هو متوقع، وسوف الحيوانات من هذه الأعمار من الأفضل لاستخدامها في الدراسات المستقبلية.
وقد تبين أن التغيرات الإيقاعية الخفيفة تؤثر على الاستجابات السلوكية الموجهة الرؤية في القيطم 2. بما يتفق مع هذه الملاحظة، لاحظنا أن نفس الحيوان الذي سبح بسرعة إلى الجانب الأبيض من خزان الاختبار في التجارب التي أجريت في صباح اليوم، استغرق وقتا أطول بكثير بعد الظهر خلال اختبارات السلوك. بعد إجراء عدد من "حيوان / زمنية مختلفة نفس 'المحاكمات، توصلنا إلى أفضل وقت لفحص السلوك كان 06:00 حتي 01:00.
وقد استخدمنا أيضا handh الرقميةELD كاميرا متصلة بواسطة فاير واير لاختبار الحيوانات تحت ظروف الإضاءة الخافتة 5. هذا الاختبار يسمح للرؤية ليلا أو ظلامية، الذي يستخدم الحيوان مبصرات قضيب لنرى. تم تغيير الشروط ببساطة عن طريق العثور على الأقل كمية الضوء المطلوبة للحيوان لأداء الفحص موجهة الرؤية. مقايسة المقدمة هنا اختبارات الرؤية ضوئي، والذي يستخدم في الغالب الحيوان مبصرات مخروط لنرى. من خلال الجمع بين هذه المناهج، وكلا النوعين من الرؤية، وظلامية وضوئي، ويمكن اختبارها.
استخدمنا هذا الاختبار لاختبار وظيفة البصرية من الحيوانات مع العين خارج الرحم نمت من الخلايا المحفزة overexpressing العوامل الحقل العين النسخ أعرب جوهرها وعامل خارجي، رأس. كانت عيناه المتولدة من هذه الأنسجة وظيفية 4،11. رأس أيضا يلعب دورا في تطوير النظام العصبي المركزي الأمامي 12 ولكن باستخدام هذا الاختبار موجهة الرؤية بالتعاون مع آر الغطاء الحيوانيفحص ansplant، وكشف دورها في التنمية العين. لم يتم حتى الآن أظهرت العوامل الخارجية الأخرى التي تؤثر على تكوين الجنين في وقت مبكر ولكن أن يكون لها دور في التنمية العين قد يسببها تشكيل السلف الشبكية في الخلايا المحفزة 4،11 الغطاء الحيواني. باستخدام هذا الاختبار السلوكية، يمكن أن الدراسات المستقبلية تحديد وظيفة البصرية من هذه العيون ولدت حديثا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة: EY015748، EY017964 (MEZ)، وEY019517 (ASV). وأيد هذا العمل أيضا من قبل البحوث للوقاية من العمى المطلق منحة لوزارة طب وجراحة العيون والأسود من وسط نيويورك. نود أيضا أن نشكر فني الحيوانية لدينا، ماثيو Mellini بطابع، لرعايته ممتازة من الحيوانات ويخطو في لنجمة في هذا الفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/2 Gallon Flex-Tank with Cover | eNasco | SB19271M | Size: 5-3/8" x 7" x 3-3/4" |
| Black electrical tape | |||
| White tissue paper | |||
| Large inoculating turntable | VWR | 50809-022 | Size: Dia 114.3 x H 76.2 mm (4 1/2 x 3") |
| Durasorb underpad | VWR | 82004-836 | Size: 43.2 x 60.1 cm (17 x 24") |
| Kimwipe | Krackeler Scientific, Inc. | 1945-34155-CS | |
| Standard tripod | Various | ||
| iSight camera or webcam | Apple | M8817LL/A | Good for larger tadpoles but small ones are difficult to see |
| Portable computer | Apple/PC | Various | We used a 13" MacBook, 2 GHz Intel Core 2 Duo running MacOSX Lion 10.7.5 |
| MiniDV handycam camcorder | SONY | DCR-HC42 | Connected by firewire to the computer with a 6-conductor and 4-conductor alpha FireWire 400 |
| Handycam station | SONY | DCRA-C121 | This can be used for connecting firewire to camera |
| QuickTime Player software | Quicktime | Version 10.1 | |
| 26 G Needle (5/8" length) | VWR | BD305115 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Disposables | |||
| Gentamicin sulfate [50 mg/ml] | Fisher Scientific | 17-528Z | Stored at RT |
| Sylgard 184 silicone elastomer | Fisher Scientific | NC9644388 | |
| Instant ocean | Doctors Foster and Smith | CD-116528 | Stock solution = 100 g/L stored at RT |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S0876 | Stock solution = 0.4 M stored at RT |
| In vitro fertilized embryos | eNasco | LM00490MX | 100 embryos/unit |
References
- Maurer, C. M., Huang, Y. Y., Neuhauss, S. C. Application of zebrafish oculomotor behavior to model human disorders. Rev Neurosci. 22 (1), 5-16 (2011).
- Solessio, E., Scheraga, D., Engbretson, G. A., Knox, B. E., Barlow, R. B. Circadian modulation of temporal properties of the rod pathway in larval Xenopus. J Neurophysiol. 92 (5), 2672-2684 (2004).
- Moriya, T., Kito, K., Miyashita, Y., Asami, K. Preference for background color of the Xenopus laevis tadpole. J Exp Zool. 276 (5), 335-344 (1996).
- Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. Generation of functional eyes from pluripotent cells. PLoS Biol. 7 (8), (2009).
- Choi, R. Y., et al. Cone degeneration following rod ablation in a reversible model of retinal degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (1), 364-373 (2011).
- Viczian, A. S., Zuber, M. E. Tissue determination using the animal cap transplant (ACT) assay in Xenopus laevis. J Vis Exp. 16 (39), (2010).
- Normal table of Xenopus laevis (Daudin) : a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. , Garland Pub. New York. (1994).
- Blackiston, D., Shomrat, T., Nicolas, C. L., Granata, C., Levin, M. A second-generation device for automated training and quantitative behavior analyses of molecularly-tractable model organisms. PLoS One. 5 (12), (2010).
- Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS One. 6 (5), (2011).
- Dong, W., et al. Visual Avoidance in Xenopus Tadpoles is Correlated With the Maturation of Visual Responses in the Optic Tectum. J Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Lan, L., et al. Noggin Elicits Retinal Fate In Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 27 (9), 2146-2152 (2009).
- De Robertis, E. M., Kuroda, H. Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos. Annu Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).
