Introduction
Человека кишечные вирусы являются важными возбудителями заболеваний, переносимых водой 1-3, но, как правило, присутствуют в небольших количествах в загрязненных вод окружающей среды, что делает их обнаружение трудно без концентрации. Процедуры, используемые, чтобы сконцентрироваться вирусы, как правило, включать в себя стадию фильтрации с последующим элюированием фильтра, и вторичную концентрацию фильтра элюата. Общая процедура фильтрации основан на использовании заряженных мембран, таких как электроположительных фильтров (недавно рассмотренных в 4,5). Эти фильтры полагаться на захвате вирусы, взвешенные в воде, используя электростатические взаимодействия между поверхностью фильтра (положительно заряженных) и целевых вирусных частиц (отрицательно заряженных). Два электроположительные фильтры, которые имеются в продаже полагаться на эту технологию, стекло / целлюлоза и нано-оксид алюминия / фильтры из стекловолокна. Стоимость фильтр стекло / целлюлозу до 10 раз больше, чем / стекловолокна нано-оксида алюминия, которые ограничивают использование стеклянной / CEllulose фильтры для рутинного мониторинга вируса. Недавние исследования пришли к выводу, различия являются номинальными между этими двумя фильтрами в восстановлении энтеровирусов из воды в окружающей среде 6,7, оправдывая использование более дешевой альтернативой фильтра. Другие опции фильтра, такие как электроотрицательных и стекло ваты фильтров были изучены, однако, они либо требуют предварительной обработки исходной воды (электроотрицательные фильтров) или нет в продаже (стекло вата фильтры). Разработка процедур концентрации вируса в основном сосредоточена на оптимизации методов первичных концентрации (фильтры), чтобы улучшить вирусов извлечения из воды. Тем не менее, процедуры вторичные концентрации, которые снижают объем элюента обычно от 1 л до миллилитр объемы, также могут оказать существенное влияние на вирус извлечения 8.
Вторичный концентрации кишечных вирусов, как правило, зависит от флокулянта, например, некоторых видов мясного экстракта (органической floccuтельства) или обезжиренное молоко флокуляции 9-12, чтобы удалить вирусные частицы с поверхности фильтра. Недавно одна процедура вторичного содержание мясного экстракта с использованием в сочетании с добавлением целит (мелких частиц) показал перспективы для восстановления аденовируса, энтеровирус, и Norovirus 8,13,14. Целит концентрации работает под тем же принципам, что входили в органический метод флокуляции в этом вирусных частиц прикрепляются и освобождаются от частиц (хлопьев или целит) путем изменения рН раствора суспензии. Сравнения между этими двумя вторичными методами концентрации были оценены в восстановлении шипами аденовируса (ADV) типов 40 и 41 8. Это исследование показало, что две вторичные методы концентрации были статистически похожи восстановления аденовирусов. Тем не менее, метод органического флокул требует 30 мин. инкубации при рН 3,5, в то время как технология целит требует более короткого инкубации (10 мин) при рН 4,0. Органический flocculatионов и требует использования дорогостоящего лабораторного оборудования (центрифуг), чтобы собрать частицы хлопьев при концентрации третичного, техника целит в отличие использует только основной лабораторное оборудование (вакуумной фильтрации), чтобы отделить целит частиц из суспензии.
Определенные комбинации фильтров и вторичных методов элюирования может также повлиять на вирусные восстановления. Один исследование показало, что определенные комбинации первичных (электроположительных фильтров) и вторичных методов концентрации (целит или органический флокуляции) оказали значительное влияние на восстановление аденовируса 13. Эти данные свидетельствуют о том, что оптимизация требуется для того, чтобы оптимально восстановить целевой вирус из данного водного матрицы при использовании этих методов. Оптимизация затрат времени, трудоемкий процесс многие исследователи активно избегают, так как многочисленные переменные будут оценены (тип фильтра / бренда, рН раствора элюции, целит / органического флокуляции).
Для этого ˘STudy, была разработана процедура, чтобы определить оптимальные условия для концентрации вируса из воды с помощью шипами аденовируса человека штаммов 40 и 41. По-видимому, так как каждый тип вируса отображает уникальный капсида морфологию и удельную капсида заряд, протоколы концентрации возможно, должны быть оптимизированы для каждого вируса цели в целях достижения оптимального вирусного выздоровления. Это исследование представляет собой подход к AdV 40 и 41 концентрирования: 1) оценка вирусных извлечения в водопроводной воде с использованием электроположительных диски фильтра с последующим 2) оценка установленном органического метода флокуляции по сравнению с техникой целит в качестве вторичного концентрации и 3) оценки элюции буфера для высшего концентрации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка посуды и корпусов фильтров
- Если не указано иное, стерилизовать все стекла, корпуса фильтров и решения при 121 ° С в течение 15 мин. Для обеспечения стерильности, охватывают все отверстия или открытые поверхности с обеих алюминиевой фольги или ленты обеспеченных бумаги перед стерилизацией.
- Соберите фильтрационного аппарата путем присоединения корпус фильтра (диаметр 47 мм) до 1 л плече колбу Эрленмейера. Соберите фильтры, необходимые: диаметр 47 мм электроположительных / электроотрицательным фильтры дисков.
- Подготовка 1 л 1,5% говяжьего экстракта (флокулянты, производит FLOC частицы, когда рН раствора снижается до 3,5, или не флокулировать; которая не совокупность при рН 3,5), 0,05 M глицин, путем растворения 15 г говяжьего экстракта в 1 л деионизированной воды и добавлением 3,75 г глицина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не Флоккулирующий говядины экстракты потребует добавления целит перед высшим концентрации. - Добавить элюирования polyph добавка натрияosphate для говяжьего экстракта при концентрации 0,1%.
- Добавить 1 М раствора соляной кислоты, по каплям, смешивания мясного экстракта, рН раствора до требуемого рН. Автоклав экстракт говядины в течение 15-30 мин при температуре 121 ° С.
- Измерьте 0,1 г мелкий, средний или большой целит частиц (для использования с не-Флоккулирующий извлечь только говядина).
- Подготовка вакуум / всасывание путем присоединения совместимый трубку к Эрленмейера бокового ответвления колбу и вакуумной розетки.
2. Приготовление растворов и вирус складе
- Подготовка 1 л 1 М HCl.
- Подготовка 1 л 1 М NaOH.
- Приготовьте 1х решение PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 1,47 мМ K 2 PO 4 и 4,3 мм NaH 2 PO 4).
- Отрегулируйте рН 1x PBS до 9,0 с помощью 1 М NaOH.
- Подготовка и разбавить акций вирус 10 4 -10 5 наиболее вероятного числа (MPN) мл -1 путем смешивания 1 мл исходного вируса с 9 мл PBS (рН7), как описано ранее 8,13. Хранить при -80 ° С в 1 мл аликвоты.
- Стерилизовать вирус Stock помощью шприца фильтрации (0,22 мкм пор по размерам), чтобы устранить возможные загрязнения.
- Дехлорированию водопроводной воды
- Мера 1 л стерильной водопроводной воды с помощью стерильной мерный цилиндр и вылить в 2 л химический стакан, содержащий магнитную мешалку.
- Добавить 0,7 г тиосульфата натрия и перемешать до гранулы не растворятся. Регулировка рН водопроводной водой до 7-7,5, если необходимо с помощью 1 М HCl или 1 М раствора NaOH.
- Вирус оттепели пик (1 мл) и добавляют весь объем шип 1 л дехлорированию стерильной водопроводной воды. Смешайте в течение 10 мин.
- Приготовьте метод заготовки (дехлорированная водопроводной воды без аденовируса) с каждого эксперимента и процесс таким же образом, как образец с.
3. Подготовка Millipore фильтрующее устройство
- Удалить стерильную покрытие над корпусом фильтра. Обеспечиватьнадлежащего нужным между корпусом фильтра верхних миску и нижней части экрана фильтров для избежания утечки образцов в процессе фильтрации.
- Удалить стерильную покрытие с 1 л колбу Эрленмейера. Убедитесь, что пробка блока фильтров плотно в верхнее отверстие колбы Эрленмейера, создавая хорошее уплотнение.
- Снимите верхнюю чашу блока фильтра из нижней части экрана фильтра и разместить 47 мм электроположительным фильтра диска прямо над экраном с стерильным пинцетом. Прикрепите корпус фильтра чашу нижней части экрана и замок на место, повернув против часовой стрелки.
4. Нажмите фильтрации воды (Primary концентрация)
- Измерьте 100 мл вируса шипами водопроводной воды с помощью стерильной мерный цилиндр.
- Налейте 100 мл вируса шипами водопроводной воды в корпус фильтра, содержащего либо 47 мм в складку стекло / фильтр целлюлозы или нано-оксида алюминия / стекловолокна диска фильтра.
- Позвольте воде медленно проходят через фильтр. Слегка вакуум, чтобы удалить оставшиеся остатки OF водопроводная вода с поверхности фильтра.
- При использовании обработки трипсином, добавить 5 мл 0,25% трипсина для фильтрации поверхность и инкубировать в течение 5 мин.
- Вымойте трипсин с поверхности фильтра, используя 50 мл стерильной деионизированной воды.
5. Вирус Элюцию с фильтром
- Снять корпус фильтра от 2 L колбы Эрленмейера, и поместите на 250 мл бокового ответвления колбу.
- Измерьте 100 мл говяжьего экстракта с использованием мерного цилиндра. Медленно влить 100 мл говяжьего экстракта в корпус фильтра.
- Разрешить экстракт говядины влить через фильтр, захватив экстракт говядины в маленьком (250 мл) колбу Эрленмейера. Применить вакуум, чтобы потянуть через экстракта остаточной говядины из фильтра.
6. целит Средняя концентрация
- Передача колбы, содержащие элюированный вирусов в мешалке. Добавить стерильной магнитной мешалкой и место на пластине для перемешивания, смешивания, чтобы создать небольшое вихрь.
- Добавить 0,1 г целитапорошка в 100 мл мясного экстракта и позволяют целит для разгона. Поместите стерильную рН зонд в говяжьего экстракта.
- Добавить по каплям 1 М HCl в экстракт говядины для достижения рН 4,0. Дайте медленно перемешивают в течение 10 мин.
- Поместите 47 мм предварительный фильтр на корпус фильтра (как описано выше) с использованием колбу Эрленмейера 2 л.
- Залить 100 мл говяжьего экстракта / целит смесь на фильтр предварительной очистки. Разрешить экстракт говядины влить через. Применить небольшой вакуум, чтобы потянуть через экстракта остаточной говядины из фильтра.
- Поместите трубки клип металла на конце корпуса фильтра носик. Прикрепите стерильный 15 мл сбора полипропиленовую трубу для того чтобы закрепить металлической трубки. Поместите корпус фильтра обратно в колбу Эрленмейера.
- Добавить 5 мл 1x PBS буфером, рН 9,0 через целит, собранной на предварительный фильтр.
- Разрешить PBS капать через фильтр предварительной очистки. Применить небольшой вакуум, чтобы потянуть через остаточного PBS в 15 мл пробирку.
7. Органические Флокуляция Средняя концентрация
- Передача стаканы, содержащие вирус элюируют магнитной мешалки. Добавить стерильной магнитной мешалкой в 100 мл мясного экстракта и смешать, чтобы создать небольшое вихрь.
- Поместите стерильную рН зонд в говяжьего экстракта.
- Добавить 1 М HCl по каплям к мясного экстракта и регулировать рН до 3,5. Смешайте в течение 30 мин.
- Налейте элюата в 250 мл конические пробирки центрифуги и центрифуги при 2500 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
- Вылейте надосадочную заботясь, чтобы не не нарушить гранул. Ресуспендируют осадок в 5 мл 1x PBS, рН 9.
- Центрифуга суспензии при 4000 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Слейте надосадочную и отбросить гранул.
- Доводят рН до 7-7,5, фильтр стерилизуют через шприцевой фильтр 0,22 мкм и замораживание при -80 ° С.
8. вирусной нуклеиновой кислоты экстракции
- Извлечение вирусные нуклеиновые кислоты с использованием соответствующей коммерческого набора в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Использование праймеров и зондов, а также реакционной смеси и профили термоциклировании, опубликованной 8,13.
Примечание: Ориентировочные предел обнаружения для анализа составляет около 5 КПЦР единиц в реакции. - Добавить компоненты ПЦР-амплификации смесей при концентрациях следующим образом: 10 мМ Трис (рН 8,3), 50 мМ KCl, 4,5 мМ MgCl 2, 10 мМ дНТФ, 10 мкМ праймеры и 1 мкМ зонда и 0,5 мкл полимеразы, так что окончательные объемы 45 мкл могут быть добавлены к соответствующим числом скважин в 96-луночный ПЦР реакции пластины.
- Нагрузка 45 мкл смеси ПЦР-амплификации с каждым соответствующим лунку 96-луночного, быстро реакции ПЦР пластины.
- Добавить 5 мкл ДНК, выделенной пробы соответствующие лунки пластины ПЦР.
- Крышка с термостойкое покрытие уплотнения, спина пластину, чтобы переместить все капли вниз ПЦР планшета.
- Установите циклов ПЦР амплификации, как Фолляпотоки: 95 ° С в течение 10 мин, а затем 40 циклов 95 & deg; С в течение 15 сек и 60 ° С в течение 1 мин.
10. Анализ данных
- Анализ по трехкратным измерениям последовательного 5-кратных разведений образцов, охватывающих 1: 5 до 1: 625 диапазон разбавления для того, чтобы определить наиболее вероятное число (MPN) вирусных частиц, как описано выше 8,13.
- Анализ последовательных 5-кратного разведения аденовируса экспериментальных шипами, охватывающих 1: 5 до 1: 15625 диапазон разбавления для того, чтобы определить наиболее вероятное число (MPN) вирусных частиц.
- Использование калькулятора EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), отрегулируйте калькулятор для учета типа разведения (1: 5 или 1:10), число разведений выполнена, и количество повторить образцов в серии разведений.
- Выполните войти 10 преобразование данных, за нормализацию в единице объема (например, 1 мл, 100 мл и т.д.
- Оценить влияние различных экспериментальных переменных (например, различные целит типов, диапазоны рН, различные типы фильтров и различных вторичных методов концентрации) на АДВ извлечения, выполнив параметрические или непараметрические статистические тесты (например, парного критерия Стьюдента, один или два -ходовым ANOVA) в зависимости от распределения данных и экспериментального проектирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выбор целит
Три различных типа целит были испытаны до выбора самых эффективных варианта. Celites с тонкой и средних частиц, образующихся самые высокие аденовирусные восстановления. Использование больших celites привело к снижению извлечения как для AdV40 и 41 (диапазон 32% -100%) (рисунок 1). Средние восстановление аденовируса 40 были на 144% ± 52% (штраф), 115% ± 28% (средняя) и 82% ± 53% celites (большой) частицы и AdV41, 132% ± 39% (Хорошо), 83% ± 25% (средний) и 50% ± 11% (большой). Односторонний ANOVA указано оптимизирован техника целит восстановить статистически аналогичные уровни AdV40 (P = 0,7920) и 41 (P = 0,1439), что и органического метода флокуляции, который извлекают 75% ± 19% и 109% ± 16%, соответственно . Рисунок 1 иллюстрирует различия между вторичных методов концентрации и между типами Adv.
_content "> оценка тип фильтраСто томов миллилитр вирусов шипами, водопроводной воды были сосредоточены либо с помощью плиссированной стекло / целлюлоза и / или из стекловолокна дискового фильтра нано-оксида алюминия и обрабатывались с помощью либо целит или органический метод флокуляции. Фильтры элюировали мясного экстракта при рН 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 и 12, чтобы определить, какие были бы наиболее эффективны в качестве элюента ADV частиц из фильтров. Фильтр стекло / целлюлоза в сочетании с мясного экстракта при рН 10 и целит, получают самые высокие извлечения (КПЦР / MPN) для AdV40 (52% ± 22%) и AdV41 (64% ± 4%), которые показаны на фиг.2 и 3. Говядина экстракт pH 10 оправился значительно более высокие AdV41, чем всех других значений рН (диапазон P значение: 0.0045-0.041), в то время как AdV40 последовали аналогичные, хотя и несколько слабее тренд (диапазон P значение: 0.025-0.042). Фильтр стекло / целлюлоза также оценивали в сочетании с органическим flocculatioп метод. Для AdV40 значительно более высокие извлечения были получены с использованием экстракта говядины рН 10 (40% ± 10%) (диапазон P значение: 0.010-0.027), а для AdV41, как рН 9,5 и 10 превзошел всех других экстракт говядины рН тестирование (диапазон значений P : 0.023-0.027) (рис 2 и 3). В целом, способ целит с мясного экстракта рН 10 было установлено, что превосходит органического метода флокуляции в прямого сравнения для восстановления обоих штаммов Adv.
Оптимизация экстракта говядины добавок
Оптимизированный метод (стекло / фильтр целлюлозы с использованием мясного экстракта рН 10, соединенный с вторичной концентрации целит) сравнивали с двумя другими обработками: 1) добавлением 0,25% трипсина и 2) дополняющего мясного экстракта с 0,1% полифосфата натрия. Добавление трипсина, казалось, не улучшают восстановление АДВ как только 16% ± 6% и 24% ± 14% от AdV40 и 41 входов, соответственно были восстановлены (< STRONG> Рисунок 4). Экстракт говядины с добавлением 0,1% полифосфата натрия получали самые высокие извлечения из AdV40 и 41 по сравнению с предыдущим способом, оптимизированным. Восстановление AdV40 появились увеличится на 13% и восстановление AdV41 увеличился на 7% по сравнению с предыдущим методом, но ни один не был статистически значимым (P значение: 0,146). Использование более высокий процент полифосфата натрия 1%, 3% и 5% (данные не показаны) был признан неэффективным и требует больших объемов кислоты, чтобы отрегулировать рН этих растворов в течение 4,0 вторичной концентрации.
Рисунок 1: Процент восстановления ADV-40 и АДВ-41 основан на технике средней концентрации (Целит по сравнению с органической хлопьев) и типа используемого целит. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (n = 3) 8.
Рисунок 2: Процентное восстановление ADV-40 с помощью двух типов вторичных методов концентрации (целит и органический FLOC) и два типа фильтров (стекло / целлюлоза и Nano-оксид алюминия / стекло) на различных уровнях рН экстракта говядины. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (n = 3) 13.
Рисунок 3: Процентное восстановление ADV-41 с помощью двух типов вторичных методов концентрации (целит и органический FLOC) и два типа фильтров (стекло / целлюлоза и Nano-оксид алюминия / стекло) на различных уровнях рН экстракта говядины. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (n = 3) 13.
Рисунок 4: Эффект вымывания добавок на восстановление ADV 40 и АДВ 41 концентрируют с использованием целит в качестве вторичного метода концентрирования и Стекло / Целлюлоза. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (n = 3) 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Электроположительные фильтры могут быть использованы в концентрации вирусов из воды; Однако эти фильтры могут отличаться по своей структуре и композиции, которая, в свою очередь изменяют их эффективность. Усугубляет эту проблему, капсида структуры и сборы варьироваться в зависимости от штаммов вируса, требующих техники концентрации быть адаптированы для обеспечения оптимального восстановления 15. Через простых модификаций существующих методов концентрации (например, электроположительные фильтры, говядина экстракт элюирования), более эффективная концентрация целевых вирусов могут быть достигнуты 16,17.
Исследования на сегодняшний день, как правило, сосредоточены на восстановлении вируса путем изменения начального концентрации (фильтры) шаги, но мало внимания было уделено последующих процедур концентрации, которая также может влиять на восстановление вируса 18. Было показано, что различные методы вторичные концентрации вируса может влиять извлечения 6,13,19,20. CeliКонцентрация те было показано, что восстановление аналогичные уровни вируса, что и других вторичных методов концентрации 8,14 с различными матрицами, при использовании быстрее и проще процедуры обработки образцов.
В связи с изменением структуры наружной оболочки вируса, некоторые вирусы могут стать физически ловушке внутри матрицы 21 фильтрующего, что требует оценки различных добавок для фильтрации протоколы элюирования. Например, добавление поверхностно-активного вещества, полифосфат натрия улучшена как бактериальные и вирусные восстановление при первичной концентрации 6,13,22-24. С другой стороны, низкий восстановление наблюдалось после того трипсина показывают, что протеазы не помочь в расщеплении белковых волокон на наружной вирусный капсид. Кроме того, в то время как не редкость 7,25,26, следует отметить, что некоторые из наших извлечения были более чем на 100%. Как было показано ранее 7,25,26, это, вероятно, из-за слипания лаборатории подготовлены VIрус используется в качестве пика.
Небольшой объем (вирус 100 мл шипами воды) подход концентрации представлены может быть практичным способом разработки и оптимизации методов концентрации вируса, из-за своей простоты и низкое потребление ресурсов наряду с быстрым временем обработки образца. Использование таких небольших объемов воды, концентрация ингибиторов ПЦР в образце также свести к минимуму, однако рекомендуется, чтобы каждый источник воды быть оценены на наличие ингибиторов ПЦР до экспериментов. Так существуют множество вариантов обоих фильтров и вторичных методов концентрации, небольшие методы объемной концентрации позволяют быстро оценок многочисленных переменных. Он выразил надежду, что эти методы могут быть развернуты до крупномасштабного фильтрации экспериментов, чтобы помочь в определении, какие условия являются оптимальными для целевой концентрации вируса в данном водном матриц.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
