Introduction
Virus entéricos humanos son agentes causantes importantes de enfermedades de origen hídrico 1-3, pero generalmente están presentes en números bajos en aguas ambientales contaminadas, por lo que su detección difícil sin concentración. Los procedimientos utilizados para concentrar virus incluyen típicamente una etapa de filtración, seguido de elución de filtro, y la concentración secundaria del eluato filtro. Un procedimiento de filtración común se basa en la utilización de membranas cargadas tales como filtros electropositivos (recientemente revisado en 4,5). Estos filtros se basan en la captura de los virus en suspensión en el agua utilizando interacciones electrostáticas entre la superficie del filtro (con carga positiva) y partículas de virus específicos (con carga negativa). Dos filtros electropositivos que están disponibles comercialmente se basan en esta tecnología, los filtros de vidrio / celulosa y fibra nano-alúmina / vidrio. Los costes de filtro de vidrio / celulosa son hasta 10 veces mayor que la de la fibra nano-alúmina / vidrio, que limitan el uso del vidrio / cefiltros llulose para la vigilancia del virus de rutina. Estudios recientes han concluido diferencias son nominales entre estos dos filtros en la recuperación de los enterovirus desde 6,7 del agua ambiente, lo que justifica el uso de una alternativa de filtro más barato. Otras opciones de filtro, como los filtros electronegativos y de lana de vidrio se han estudiado, sin embargo, o bien requieren el tratamiento previo de las fuentes de agua (filtros electronegativos) o no están disponibles en el mercado (filtros de lana de vidrio). El desarrollo de procedimientos de concentración de virus se ha centrado principalmente en la optimización de las técnicas de concentración primaria (filtros) con el fin de mejorar la recuperación de virus de agua. Sin embargo, los procedimientos de concentración secundarios, que reducen el volumen de eluyente típicamente de 1 L a mililitro volúmenes, también pueden tener un impacto significativo en las recuperaciones de virus 8.
Concentración secundaria de virus entéricos típicamente se basa en un agente floculante, tales como algunos tipos de extracto de carne (floccu orgánicamento) o floculación de la leche desnatada 9-12 para eliminar las partículas de virus de las superficies del filtro. Recientemente, otro procedimiento de concentración secundaria utilizando extracto de carne junto con la adición de celita (partículas finas) ha mostrado ser prometedor para la recuperación de adenovirus, enterovirus y norovirus 8,13,14. Obras de concentración Celite bajo principios similares a la del método de floculación orgánica en que las partículas de virus se unen a y se liberan de partículas (floc o de celite) alterando el pH de la solución en suspensión. Las comparaciones entre estas dos técnicas de concentración secundarias han sido evaluadas en la recuperación de adenovirus (ADV) de pinchos tipos 40 y 41 8. Este estudio concluyó que las dos técnicas de concentración secundarias fueron estadísticamente similares en la recuperación de adenovirus. Sin embargo, el método de floculación orgánica requiere una 30 min. de incubación a pH 3,5, mientras que la técnica de celite requiere una incubación más corto (10 min) a pH 4,0. El flocculat orgánicaion también requiere el uso de equipo de laboratorio caro (centrifugadoras) para recoger las partículas de flóculos durante la concentración terciaria, la técnica de celite en contraste utiliza sólo el equipo de laboratorio básico (filtración a vacío) para separar partículas de Celite de la suspensión.
Ciertas combinaciones de filtros y técnicas de elución secundarias también pueden afectar a las recuperaciones de virus. Un estudio concluyó que ciertas combinaciones de (filtros electropositivos) primarias y secundarias técnicas de concentración (Celite o floculación orgánica) tuvieron un impacto significativo de la recuperación del adenovirus 13. Estos hallazgos sugieren que se requiere la optimización a fin de recuperar de manera óptima virus diana a partir de una matriz de agua dado al utilizar estas técnicas. La optimización es una pérdida de tiempo y arduo proceso de muchos investigadores evitan activamente desde numerosas variables serán evaluados (tipo de filtro / marca, solución de elución de pH, celita / floculación orgánica).
Para este study, se desarrolló un procedimiento para identificar las condiciones óptimas para la concentración de virus a partir de agua usando cepas de adenovirus humano de púas 40 y 41. Presumiblemente, ya que cada tipo virus muestra una morfología de la cápside único y carga específica de la cápside, pueden necesitar ser optimizado para cada virus protocolos de concentración apuntar a fin de alcanzar la recuperación viral óptima. Este estudio proporciona un enfoque para AdV 40 y 41 de concentración por: 1) la evaluación de la recuperación de virus en el agua del grifo, usando discos de filtro electropositivos seguido por 2) evaluación de un método de floculación orgánica establecido frente a la técnica de celite como una concentración secundaria, y 3) evaluación de tampones de elución para la concentración terciaria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparación de Cristalería y alojamientos de los filtros
- A menos que se indique lo contrario, esterilizar todos los artículos de vidrio, soportes y soluciones de filtrado a 121 ° C durante 15 minutos. Para asegurar la esterilidad, cubrir todas las aberturas o las superficies expuestas, ya sea con papel de aluminio o papel cinta asegurado antes de la esterilización.
- Montar aparato de filtración uniendo carcasa del filtro (47 mm de diámetro) a 1 L matraz Erlenmeyer de brazo lateral. Recoger filtros necesarios: filtros de disco electropositivos / electronegativo 47 mm de diámetro.
- Preparar 1 L de extracto de carne 1,5% (floculación, produce partículas de flóculo cuando el pH de la solución se redujo a 3,5, o no floculante, lo que no hace agregada a pH 3,5), con 0,05 M de glicina, disolviendo 15 g de extracto de carne de vacuno en 1 L de agua desionizada y la adición de 3,75 g de glicina.
NOTA: extractos de carne no floculantes requerirán la adición de celita antes de la concentración terciaria. - Añadir elución polyph sodio aditivoosphate al extracto de carne de vacuno en una concentración de 0,1%.
- Añadir una solución de ácido clorhídrico 1 M, gota a gota, a la mezcla de extracto de carne, solución de pH a pH deseado. Extracto de carne Autoclave durante 15-30 minutos a 121 ° C.
- Mide 0,1 g de fino, medio, o celita partícula grande (para usar con sólo el extracto de carne no floculantes).
- Preparar vacío / aspiración uniendo tubos compatible con erlenmeyer brazo lateral ya la toma de vacío.
2. Preparación de Soluciones y virus Stock
- Preparar 1 L de HCl 1 M.
- Preparar 1 l de 1 M NaOH.
- Prepare la solución de PBS 1x (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 1,47 mM K 2 PO 4 y 4,3 mM NaH 2 PO 4).
- Ajustar el pH de 1x PBS a 9,0 utilizando 1 M NaOH.
- Preparar y diluir de virus a 10 4 -10 5 número más probable (NMP) ml -1 mezclando 1 ml de virus de reserva con 9 ml de PBS (pH7), como se describió previamente 8,13. Conservar a -80 ° C en alícuotas de 1 ml.
- Esterilizar virus de stock de filtrado jeringa (0,22 m de tamaño de poro) para eliminar los contaminantes potenciales.
- Sin cloro del agua corriente
- Medida 1 L de agua del grifo estéril usando un cilindro graduado estéril y verter en un vaso de precipitados de 2 l que contenía una barra de agitación magnética.
- Añadir 0,7 g de tiosulfato de sodio y mezclar hasta que se disuelven los gránulos. Ajustar el pH del agua del grifo para 7-7,5 si es necesario el uso de HCl 1 M o solución de NaOH 1M.
- Pico virus Deshielo (1 ml) y se añade todo el volumen de pico a 1 l de agua del grifo estéril sin cloro. Mezclar durante 10 min.
- Preparar un blanco método (el agua del grifo sin cloro y sin adenovirus) con cada experimento y el proceso de la misma manera que la muestra de púas.
3. Preparación de Millipore Filtro Aparato
- Retirar la cobertura estéril sobre la carcasa del filtro. Asegurarajuste adecuado entre la carcasa del filtro tazón superior y pantalla de filtro inferior para evitar fugas de la muestra durante la filtración.
- Retirar la cobertura estéril de 1 frasco L Erlenmeyer. Asegúrese de que el corcho de la unidad de filtro se ajusta perfectamente en la abertura superior de erlenmeyer, creando un buen sello.
- Retire el tazón superior de la unidad de filtro de malla del filtro inferior y colocar 47 mm disco de filtro electropositivo de lleno sobre la pantalla con pinzas estériles. Adjuntar filtro tazón vivienda a la pantalla inferior y ajustar en su lugar girando en sentido antihorario.
4. Pulse de filtración de agua (Concentración Primaria)
- Medir 100 ml de virus se dispararon el agua del grifo usando estéril probeta.
- Vierta 100 ml de virus se dispararon el agua del grifo en la carcasa del filtro que contiene o bien un filtro de 47 mm de vidrio plisado / celulosa o un filtro de disco de fibra nano-alúmina / vidrio.
- Deje que el agua pase lentamente a través del filtro. Aplicar vacío suave para eliminar los residuos restantes oagua del grifo f de la superficie del filtro.
- Si se utiliza el tratamiento con tripsina, añadir 5 ml de tripsina al 0,25% para filtrar superficie e incubar durante 5 minutos.
- Lavar la tripsina de la superficie del filtro utilizando 50 ml de agua desionizada estéril.
5. La elución Virus del filtro
- Retire la carcasa del filtro de 2 L frasco Erlenmeyer, y el lugar en frasco de 250 ml brazo lateral.
- Medir 100 ml de extracto de carne utilizando cilindro graduado. Vierta lentamente 100 ml de extracto de carne en caja del filtro.
- Permitir extracto de carne para verter a través del filtro, capturando extracto de carne en una pequeña (250 ml) matraz Erlenmeyer. Aplicar vacío para tirar a través de extracto de carne residual del filtro.
6. Celite Concentración Secundaria
- Frascos de transferencia que contiene los virus eluidas a una placa de agitación. Añadir estéril barra de agitación magnética y colocar en placa de agitación, mezcla para crear ligero vórtice.
- Añadir 0,1 g de celitepolvo a 100 ml de extracto de carne y permitir de celite para dispersar. Coloque la sonda de pH estéril en extracto de carne.
- Añadir gota a gota HCl 1 M de extracto de carne para alcanzar un pH de 4,0. Permita mezclar lentamente durante 10 min.
- Coloque 47 mm pre-filtro en la carcasa del filtro (como se describió anteriormente) usando un matraz Erlenmeyer de 2 l.
- Verter 100 ml de extracto de carne de vacuno / de la mezcla de celite sobre pre-filtro. Permita que el extracto de carne vierta a través. Aplicar ligero vacío para salir adelante extracto de carne residual del filtro.
- Coloque el metal clip de tubo en el extremo del tubo de salida del filtro. Adjuntar estéril 15 ml tubo de recogida de polipropileno para clip de tubo de metal. Coloque la carcasa del filtro de nuevo en erlenmeyer.
- Añadir 5 ml de tampón 1x PBS, pH 9,0 sobre celite recogida en pre-filtro.
- Permita PBS gotee a través de pre-filtro. Aplicar ligero vacío para salir adelante PBS residual en 15 ml tubo de recogida.
7. Orgánica floculación Concentración Secundaria
- La transferencia de los vasos que contienen el virus se eluyó a una placa de agitación. Añadir una barra de agitación magnética estéril a 100 ml de extracto de carne y mezclar para crear ligero vórtice.
- Coloque la sonda de pH estéril en extracto de carne.
- Añadir 1 M de HCl gota a gota a extracto de carne y ajustar el pH a 3,5. Mezclar durante 30 min.
- Verter el eluato en 250 ml tubos cónicos de centrífuga y centrifugar a 2500 xg durante 15 min a 4 ºC.
- Verter el sobrenadante con cuidado de no de no perturbar el sedimento. Resuspender el precipitado en 5 ml de 1x PBS, pH 9.
- Centrifugar la suspensión a 4.000 xg durante 10 min a 4 ºC. Verter el sobrenadante y desechar el sedimento.
- Ajustar el pH a 7-7,5, esterilizar por filtración a través de filtro de jeringa de 0,22 micras y congelación a -80 ° C.
8. Viral Nucleic Acid Extracción
- Extraer ácidos nucleicos virales utilizando un kit comercial apropiado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Utilice cebadores y sondas, así como la mezcla de reacción y perfiles de ciclo térmico según lo publicado 8,13.
NOTA: límite estimado de detección del ensayo es de aproximadamente 5 unidades qPCR por reacción. - Añadir componentes de las mezclas de amplificación de PCR en concentraciones como sigue: Tris 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, 4,5 mM de MgCl 2, mM dNTPs 10, 10 mM cebadores y sonda 1 M y 0,5 l de polimerasa de manera que los volúmenes finales de 45 l se puede añadir al número apropiado de pozos dentro de una placa de 96 pocillos de reacción PCR.
- Cargar 45 l de mezcla de amplificación PCR a cada pocillo apropiado de una de 96 pocillos, la placa de PCR reacción rápida.
- Añadir 5 l de ADN extraído de la muestra a los pocillos apropiados de la placa de PCR.
- Cubra la placa con junta de la tapa resistente al calor, girar la placa para mover cualquier gota a fondo de pozos de la placa de PCR.
- Establecer ciclos de amplificación por PCR como follOWS: 95 ° C durante 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 min.
10. Análisis de datos
- Analizar mediciones por triplicado de las diluciones en serie de 5 veces de las muestras que abarcan 1: 5 a 1: 625 dilución gama con el fin de determinar el número más probable (MPN) de las partículas virales, como se describió previamente 8,13.
- Analizar diluciones en serie de 5 veces de los picos experimentales de adenovirus que abarcan 1: 5 a 1: 15.625 rango de dilución para determinar el número más probable (MPN) de las partículas virales.
- El uso de la calculadora EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), ajustar la calculadora para tener en cuenta el tipo de dilución (1: 5 ó 1:10), el número de diluciones realizado, y el número de replicar muestras en serie de dilución.
- Realizar log 10 transformación de los datos, seguido por la normalización a una unidad de volumen (por ejemplo, 1 ml, 100 ml, etc.
- Evaluar el efecto de las diferentes variables experimentales (por ejemplo, diferentes tipos de celite, se rangos de pH, diferentes tipos de filtros y diferentes técnicas de concentración secundarios) sobre recuperaciones AdV mediante la realización de pruebas estadísticas paramétricas o no paramétricas (por ejemplo, prueba t pareada, uno o dos -Way ANOVA) dependiendo de la distribución de los datos y el diseño experimental.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Selección de Celite
Tres tipos diferentes de celita fueron probados antes de la selección de la mejor variante de realización. Celites con bien a las partículas de tamaño mediano producen los más altos recuperaciones de adenovirus. El uso de celites más grandes resultó en menores recuperaciones tanto para AdV40 y 41 (rango de 32% -100%) (Figura 1). Promedio de recuperaciones de adenovirus 40 eran 144% ± 52% (muy bien), 115% ± 28% (medio) y 82% ± 53% celites (grande) de partículas y para AdV41, 132% ± 39% (muy bien), el 83% ± 25% (medio) y 50% ± 11% (grande). ANOVA de una vía indicada la técnica de celite optimizado recuperó niveles estadísticamente similares de AdV40 (P = 0,7920) y 41 (P = 0,1439) a la del método de floculación orgánica, que se recuperó 75% ± 19% y 109% ± 16%, respectivamente . La Figura 1 ilustra las diferencias entre las técnicas de concentración secundarios y entre los tipos Adv.
_content "> Evaluación Tipo de FiltroUn centenar de volúmenes mililitros de agua corriente virus-clavó se concentraron utilizando un vidrio / celulosa plisada o / vidrio filtro de discos de fibra nano-alúmina y se procesaron utilizando el método de celite o floculación orgánica. Los filtros se eluyeron con extractos de carne a pH 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 y 12 para determinar cuál sería el más eficaz en eluyendo partículas de AdV de los filtros. El filtro de vidrio / celulosa junto con extracto de carne a pH 10 y de celite, se produjo el mayor recuperaciones (por qPCR / MPN) para AdV40 (52% ± 22%) y AdV41 (64% ± 4%) que se muestran en las Figuras 2 y 3. Beef extracto de pH 10 recuperó AdV41 significativamente más altos que el resto de los valores de pH (rango de valor P: 0,0045 a 0,041), mientras que AdV40 siguió una similar, aunque algo más débil tendencia (rango de valores P: 0,025-0,042). Un filtro de vidrio / celulosa se evaluó también en conjunción con el flocculatio orgánicaMétodo n. Para AdV40, recuperaciones significativamente más altos se consiguieron utilizando extracto de carne pH 10 (40% ± 10%) (intervalo de valores P: 0,010-0,027), y para AdV41, tanto pH 9,5 y 10 superaron todas pH otro extracto de carne probado (rango de valores P : 0,023 a 0,027) (Figuras 2 y 3). En general, la técnica de celite con extracto de carne pH 10 se encontró que era superior al método de floculación orgánica en comparaciones directas para la recuperación de ambas cepas Adv.
Las optimizaciones de los aditivos extracto de carne
El método optimizado (filtro de vidrio / celulosa usando extracto de carne pH 10 junto con la concentración secundaria de celite) se comparó con otros dos tratamientos: 1) la adición de 0,25% de tripsina y 2) se completa el extracto de carne con 0,1% de polifosfato de sodio. La adición de tripsina no parece mejorar la recuperación de AdV ya que sólo 16% ± 6% y 24% ± 14% de AdV40 y 41 entradas, respectivamente, se recuperaron (< strong> Figura 4). Extracto de carne de vacuno suplementado con 0,1% de polifosfato sódico produjo las más altas recuperaciones de AdV40 y 41 en comparación con la del método optimizado anterior. Recuperación AdV40 pareció aumentar en un 13%, y la recuperación AdV41 aumentó un 7% sobre el anterior, pero tampoco fue estadísticamente significativa (valor de p: 0,146). El uso de porcentajes más altos de polifosfato de sodio 1%, 3% y 5% (datos no mostrados) se encontró que era ineficaz, lo que requiere grandes volúmenes de ácido para ajustar el pH de estas soluciones a 4,0 durante la concentración secundaria.
Figura 1: El porcentaje de recuperación de AdV-40 y AdV-41 basado en técnica de concentración secundaria (Celite frente Organic floc) y el tipo de Celite utilizado. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3) 8.
Figura 2: Porcentaje de recuperación de AdV-40 utilizando dos tipos de técnicas de concentración secundarias (Celite y flóculos orgánica) y dos tipos de filtros (vidrio / celulosa y Nano-alúmina / vidrio) a diferentes niveles de pH de extracto de carne. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3) 13.
Figura 3: Porcentaje de recuperación de AdV-41 utilizando dos tipos de técnicas de concentración secundarias (Celite y flóculos orgánica) y dos tipos de filtros (vidrio / celulosa y Nano-alúmina / vidrio) a diferentes niveles de pH de extracto de carne. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3) 13.
Figura 4: El efecto de los aditivos de elución en la recuperación de AdV 40 y 41 AdV concentró utilizando Celite como una técnica de concentración secundaria y de vidrio / celulosa. Las barras de error representan la desviación estándar (n = 3) 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Filtros electropositivos son útiles en la concentración de virus del agua; sin embargo, estos filtros pueden diferir en su estructura y composición, que a su vez podría alterar su eficacia. Para agravar este problema, las estructuras de la cápside y cargos varían entre las cepas de virus que requieren ser adaptados técnicas de concentración para asegurar una recuperación óptima 15. A través de simples modificaciones de las técnicas de concentración existentes (por ejemplo, los filtros electropositivos, carne extracto de elución), la concentración más efectiva de los virus diana se pueden alcanzar 16,17.
La investigación hasta la fecha se ha centrado normalmente en la recuperación de virus mediante la modificación de la concentración primaria (filtros) pasos, pero poca atención se le ha dado a los procedimientos de concentración posteriores que también podría influir en la recuperación de virus 18. Se ha demostrado que las diferentes técnicas de concentración secundarios pueden afectar a las recuperaciones de virus 6,13,19,20. Celiconcentración te ha sido mostrado para recuperar niveles similares de virus a la de otros métodos de concentración secundarias 8,14 de una variedad de matrices, mientras que usando los procedimientos de procesamiento de la muestra más simples y más rápido.
Debido a diferentes estructuras de cápside externa, ciertos virus pueden quedar atrapados físicamente dentro de la matriz del filtro 21, que requiere la evaluación de diferentes aditivos para filtrar protocolos de elución. Por ejemplo, la adición de tensioactivo, polifosfato de sodio mejoró tanto la recuperación bacteriana y viral durante la concentración primaria 6,13,22-24. Por otra parte, las recuperaciones bajas observadas después de la adición de la tripsina indican que las proteasas no ayudan a la escisión de las fibras de proteína en la cápside viral exterior. Además, aunque no es raro 7,25,26, es de destacar que algunos de nuestros recuperaciones eran en exceso de 100%. Como se indica anteriormente 7,25,26, esto es probablemente debido a la aglutinación de laboratorio preparado virus utiliza como espiga.
El pequeño volumen (100 ml virus pinchos agua) enfoque concentración presenta puede ser una manera práctica para desarrollar y optimizar métodos de concentración de virus, debido a su simplicidad y bajo consumo de recursos, junto con el tiempo de procesamiento de la muestra rápida. El uso de tales pequeños volúmenes de agua, la concentración de inhibidores de la PCR dentro de la muestra también se reduce al mínimo, sin embargo se recomienda que se evaluará cada fuente de agua para la presencia de inhibidores de la PCR antes de la experimentación. Ya que existen numerosas opciones de ambos filtros y técnicas de concentración secundarias, pequeñas técnicas de concentración de volumen de las evaluaciones rápidas de numerosas variables. Se espera que estas técnicas podrían ser desplegados antes de la experimentación de filtración a gran escala para ayudar a identificar qué condiciones son óptimas para la concentración de virus diana por las matrices de agua dadas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
