קופסית Serotyping של Published: September 25, 2014 doi: 10.3791/51747

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Barbara D. Porter¹, Belinda D. Ortika¹, Catherine Satzke^1,2

¹Pneumococcal Research, Murdoch Childrens Research Institute, ²Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne

Summary

בדיקות התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping Streptococcus pneumoniae, וגם כבר מיושמות באופן נרחב במיקרוביולוגיה אבחון. כתב יד זה מתאר את הייצור של חומרים כימיים התלכדות לטקס, נהלי בקרת איכות ובבית היישום של טכניקה זו לserotyping דלקת ריאות.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) הוא אחד גורמים עיקריים לתחלואה ותמותה בילדים מתחת לגיל חמש שנים ברחבי העולם, במיוחד בהגדרות משאבים לעניים ^1,2. טווחי מחלה דלקת ריאות מפני זיהומים מקומיים לסכנת חיים בתנאים כגון דלקת ריאות, אלח דם ודלקת קרום מוח ^1,2.

יותר מ 90 קפסיד של pneumococci זוהו על בסיס הבדלים בפוליסכריד קופסית ^3. חיסונים הנוכחיים למקד את פוליסכריד קופסית ולספק הגנה מפני הזנים אל העיקריים בגרימת מחלה פולשנית ^4. Serotyping דלקת ריאות מבודדות הוא חשוב להערכת ההשפעה של חיסון על כרכרה ומחלה, כמו גם מתן מידע אפידמיולוגיים רחב יותר ^5,6. השיטה הנוכחית "תקן זהב" לserotyping דלקת ריאות היא מבחן Quellung, אבל זה זמן רב ודורשת מיומנות מסוימת לperform ^7. התלכדות לטקס היא שיטת serotyping חלופה המומלצת על ידי ארגון הבריאות העולמית ^7. התלכדות לטקס היא מהירה וקלה לביצוע, והוא מועסק במעבדות רבות בעולם ^8-11. חשוב לציין, התלכדות הלטקס הוכיחה דיוק דומה למבחן Quellung לserotyping דלקת הריאות ^10,12-14. בסך הכל, שיטה זו היא אידיאלית עבור הגדרות משאבים לעניים, כמו גם מעבדות תפוקה גבוהה.

ריאגנטים התלכדות לטקס ('ריאגנטים לטקס') נוצרים על ידי ההתקשרות של נוגדנים לחלקיקי לטקס ^15. בתגובה חיובית, חלקיקים אלה שכותרת agglutinate בנוכחות של אנטיגן הספציפי. ריאגנטים לטקס מסחריים זמינים לטווח מוגבל של סרוטיפים. ניתן גם מגיבים מוכנים לטקס בבית באמצעות מסחרי antisera זמין ^10. תערובות של antisera ("בריכות"), כמו גם antisera הספציפי לים דלקת ריאותerogroups (למשל, קבוצה 19), זנים אל פרט (למשל, סרוטיפ 5), ולאנטיגנים ספציפיים ('גורמים', למשל., 19c גורם הכרת 19A סרוטיפ) להגדרה נוספת קפסיד בתוך קבוצות זמינות ^16.

כתב יד זה מתאר את השלבים העיקריים בייצור של חומרים כימיים לטקס באמצעות קובץ מצורף פסיבי של antisera זמין המסחרית לחלקיקי לטקס. היבטי בקרת איכות (QC) של שיטה זו מתוארים, ופרוטוקול לשימוש בחומרים כימי לטקס לserotyping דלקת ריאות כלול.

Protocol

.1 הכנת ריאגנטים לאטקס בבית

1. הכנת שנאגרו מלוח גליצין (GBS)
   1. הוסף 1.5 גליצין גרם, נתרן כלורי 11.7 גרם ושל מים מזוקקים 100 מ"ל לכוס זכוכית 200 מ"ל.
   2. מערבבים להמסה באמצעות stirrer מגנטי.
   3. העבר את התערובת ל500 מ"ל מדידת צילינדר ולהוסיף מים מזוקקים כדי להפוך כולל של 200 מ"ל.
   4. מעבירים את הפתרון בחזרה לכוס 200 מ"ל, לבדוק את רמת החומציות ולהתאים ל8.2 עם הידרוקסיד 5 M נתרן. הערה: הידרוקסיד הנתרן הוא מאכל, ללבוש ציוד מגן אישי.
   5. סנן לעקר את הפתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים וכמה 60 מ"ל מזרקים לתוך בקבוק זכוכית מ"ל preautoclaved בורג כתרים 250.
   6. לאחסן ב RT.
2. הכנה של GBS עם 0.2% אלבומין בסרום שור
   1. הוספת 0.2 גרם של אלבומין בסרום שור אבקה (BSA) ושל GBS 100 מ"ל לכוס זכוכית 200 מ"ל ולערבב לפזר באמצעות stirrer מגנטי.
   2. מסנןלעקר את הפתרון באמצעות 0.22 מיקרומטר מסננים באמצעות מספר מזרקים 60 מ"ל לבקבוק זכוכית כתרים מ"ל preautoclaved בורג 250.
   3. חנות ב 4 ° C..
3. הכנה מגיב לאטקס
   1. לייבל 2 מ"ל עגול צינור microfuge תחתון.
      הערה: סיבוב צינורות תחתון משמשות כדי למזער יישוב חלקיקים אשר עשוי להשפיע קובץ מצורף נוגדן.
   2. בעזרת פיפטה P1000 עם טיפים סטרילי להוסיף 975 μl של GBS לתוך צינור microfuge, ולאחר מכן להוסיף 25 μl של antiserum דלקת ריאות המתאים עבור מגיב הלטקס שמכין (כלומר, בריכה, קבוצה, סוג או גורם). הפוך חמש פעמים כדי לערבב.
   3. מדולל חלקיקי לטקס פוליסטירן 01:10 ידי הוספת 120 μl של חלקיקי לטקס ל1,080 μl של תמיסת מלח פיסיולוגי סטרילי.
      הערה: זה יכול להתבצע בכמויות גדולות יותר, אבל צריך להיעשות טרי בכל פעם ריאגנטים הלטקס מיוצרים.
   4. הוספת 1,000 μl של ההשעיה 01:10 לטקס (מוכנה בשלב 1.3.3) ל1,השעיה 000 μl 01:40 antiserum (מוכן בשלב 1.3.2). הפוך חמש פעמים כדי לערבב.
   5. לדגור על 37 ° C על גלגל מסתובב לאט (לדוגמא, 4 סל"ד גלגל בקוטר 38.5 סנטימטר) עבור שעה 2.
   6. צנטריפוגה ל15 דקות ב 1,100 x גרם. בטל supernatant ועדינות resuspend גלולה ב2 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית.
   7. צנטריפוגה ל15 דקות ב 1,100 x גרם. בטל supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של GBS ובעדינות resuspend גלולה.
   8. פיפטה ההשעיה הלטקס לתוך 5 מ"ל שכותרתו בורג כתרים צינור. הוסף 1 מ"ל נוסף של GBS.
   9. הוסף 2 מ"ל של GBS מכיל 0.2 BSA% (w / v) (pH 8.2) (מוכן בשלב 1.2). הוסף 40 μl של 10% (w / v) פתרון של אזיד הנתרן כחומר משמר.
      הערה: יזיד הנתרן הוא מסוכן אם בשאיפה, והוא גירוי עור ועיניים. רצוי לרכוש פתרון 10% מוכנים ולא צורת האבקה, כמו זה ממזער את הסיכון של חשיפת משאיפת. ציוד מגן אישי (כולל כפפותמשקפי סנסציה ד) צריכים להיות משוחק בעת הטיפול מגיב זה. עיין בגיליון נתוני בטיחות של חומרים לפרטים.
   10. ריאגנטים לטקס חנות ב 4 ° C.
4. הכנה של מגיב לטקס ביקורת שלילית
   1. לייבל 2 מ"ל עגול צינור microfuge תחתון.
      הערה: סיבוב צינורות תחתון משמשות כדי למזער יישוב חלקיקים אשר עשוי להשפיע קובץ מצורף נוגדן.
   2. בעזרת פיפטה P1000 עם טיפים סטרילי להוסיף 975 μl של GBS לתוך צינור microfuge, ולאחר מכן להוסיף 25 μl antiserum ארנב הרגיל. הפוך חמש פעמים כדי לערבב.
   3. המשך כמו בשלבי 1.3.3 ל1.3.10 לעיל

.2 בקרת איכות (QC) של ריאגנטים לאטקס

1. להביא מגיב לטקס לRT. מייד לפני השימוש, לערבב בעדינות מגיב לטקס על ידי היפוך הצינור מספר פעמים.
2. בדוק מגיב לautoagglutination ידי pipetting 15 μl לשקופית מיקרוסקופ זכוכית והמשך כבצעדים 4.7 ו4.8 להלן. לא צריך להיות שוםgglutination של חלקיקי הלטקס. מגיב אמורה להופיע לבן וחלק.
3. בדוק את המגיב נגד פנל של בידודי דלקת ריאות מעבר נמוך. השתמש בתרבויות טריות גדלו מוכנות כמו בשלב 3 הפנל של בידודים צריך לכלול נגזרות של סרוטיפ 'היעד' (סרוטיפ הספציפי למגיב נבדק) וזנים אל 'אינו יעד "(נגזרות של סרוטיפים אחרים שלא צריך בדרך כלל לעבור מגיב עם המגיב). כולל בודד לפחות אחד מכל סוג סרוטיפ יעד ולא יעד עבור כל מגיב לטקס עובר QC. אם יש רק אחד יעד או serotype אינו היעד, בדיקת שני בידודים שונים של סרוטיפ המסוים.
   הערה: פנל הבדיקה צריך לכלול מספר בידודים של כל serotype, שחלקם נדירים במחלה פולשנית ו / או אוספי תרבות סוג. עדיף לכלול כמה מרכבה מבודדת, כפי שהם לעתים קרובות יותר תובעניים לסרוטיפ (מידע לא מוצג), ובכך בודקים את o הקיבולת נוספתf ריאגנטים ולהבטיח כי חומרים כימיים עשויים מסוגלים serotyping שני פולשנית וכרכרה מבודדת.
4. להמשיך בבדיקות של חומרים כימיים לטקס עם יעד ודלקת ריאות שאינם יעד מבודד לפי השיטה המתוארת בשלבי 3 ו -4 להלן.
5. ריאגנטים בקרת איכות בזמן ייצור ולאחר מכן לפחות אחת לשנה לאחר מכן.
   הערה: אם מגיב לא עובר QC, אצווה חייב להיות מושלך והכנה חדשה שנעשתה. במקרה של כישלון QC חוזר אנו ממליצים על חומרים כימיים שמיוצרים תוך שימוש בשיטות החלופיות שמתוארות בOrtika et al. 2013 ⁸ ובדיון שלהלן.

.3 הכנת תרבויות דלקת ריאות לSerotyping

1. באמצעות לולאת סטרילי לבחור מושבה אחת של דלקת הריאות לבודד ופס זה החוצה אל אגר דם לא סלקטיבי מוצק, כך שהבידוד העיקרי מכסה כשליש ממשטח הצלחת. Streak למושבות אחת.
   הערה: לוחות שהוכנו מסוס defibrinated או דם כבשים מתאימים; אבל צלחות דם מוכנות עם דם אדם או דם של בעלי החיים citrated אינן.
2. דגירה O הצלחת / N על 37 מעלות צלזיוס באווירה של 5% CO _2.
3. שים לב לצמיחה על הצלחת לטוהר ולהעריך שיש צמיחה מספיק לserotyping.
   הערה: תרבות טהורה של בודד דלקת הריאות נדרשת לserotyping. מהניסיון, ומחוברות, או בסמוך מחוברות הצמיחה שלנו מכסה כשליש ממשטח הצלחת הוא בדרך כלל מספיק על מנת להשלים serotyping. כתרבויות דלקת ריאות עלולות להיות מועדות לautolysis, תרבויות מוכנות לserotyping צריכה להיבדק בתוך 24 שעות של תת תרבות. אל תיקח את צלחת התרבות מחוץ לחממה יותר מ 15 עד 20 דקות לפני serotyping מתחיל.

.4 Serotyping אטקס התלכדות ניצוח

1. הסר את כל חומרים כימיים הלטקס ממקרר ולאפשר להם לחמם לRT למשך כimately 30 דקות. מייד לפני השימוש, בעדינות להפוך את הצינורות כדי לערבב את חומרים כימיים.
2. תווית שקופיות מיקרוסקופ.
3. הנח 15 μl של מגיב לטקס שליטה שלילי לשקופית מיקרוסקופ.
4. באמצעות μl 1 לולאה חד פעמית סטרילי לקחת תנופה של תרבות דלקת הריאות, כך שהלולאה היא כמחצית מלאה.
5. בעדינות למרוח הבידוד על פני השטח של השקופיות קרובות לירידה של מגיב לטקס ביקורת שלילי. הבידוד צריך להיות גלוי בשקופית הזכוכית.
6. במהירות וביסודיות לערבב הבידוד למגיב לטקס שליטה השלילי באמצעות הלולאה. ודא כי הירידה אינה מתפשטת עוד יותר מאשר הגודל ההתחלתי שלה.
7. להרים את השקופית, מחזיקים אותו בשני הקצוות. רוק השקופיות קדימה ואחורה דקות 1. תשמור על עצמך כדי לשמור על הנוזל נע באיטיות, ולהבטיח שהגודל של הירידה לא להגדיל.
   הערה: לחלופין להשתמש בכיסא נדנדה צלחת.
8. שים לב להתלכדות מקרוסקופית (כלומר, על ידיבעין בלתי מזוינת) וסליקה של ההשעיה על רקע שחור.
9. אם מגיב לטקס ביקורת השלילי לא מראה התלכדות או סליקה להמשיך בדיקות התרבות, החלפת חומרים כימיים לטקס מבחן למגיב לטקס שליטה השלילי בצעדי 4.1-4.8 לעיל. לולאה טרי יש להשתמש בכל פעם. להמשיך בבדיקות של חומרים כימיים לטקס מתחילים עם הבריכות.
10. בדוק כל אחד מהחומרים הכימיים 'הבריכה' לטקס ברציפות עד בדיקה חיובית מתקבלת.
    הערה:. סדר הבדיקה של הבריכות ניתן לעשות זאת ב'סיבובים 'כדי לשקף את השכיחות המקומית של זנים אל מסוימים (למשל, על ידי בדיקת שלוש בריכות ככל הנראה בשקופית הראשונה אם תגובה חיובית ולא התקבל, לאחר מכן מבחן הבא שלוש הסיכוי הטוב ביותר של הבריכות שנותרו בשקופית השנייה, וכן הלאה עד שתגובה חיובית מתקבלת). הדבר מבטיח כי קפסיד הנפוצים ביותר נבדקים ראשון, צמצום הזמן וריאגנטים צורך.
11. באמצעות המקש של יצרן antisera לקבוע איזה פרט antisera מיוצג בבריכה החיובית.
12. בחן כל אחת מהקבוצות או הסוגים הכלולים בבריכה החיובית בנפרד כדי לקבוע את "הקבוצה" או "סוג" כמו בשלבים 4.1-4.8 לעיל.
13. לקבוע את התוצאה על ידי התייחסות למפתח של יצרן antisera. אם 'סוג' נקבע (לדוגמא, סרוטיפ 5), אז אין בדיקות נוספות נחוצה ותוצאה זה נרשמה.
14. אם "קבוצה" נקבעה (לדוגמא, קבוצה 19), ולאחר מכן עיין במפתח היצרנים כדי לקבוע את הגורמים להיבדק. המשך בדיקות עם חומרים כימיים "גורם" לטקס האישיים ולקבוע את סרוטיפ הסופי (למשל, 19B סרוטיפ).

Representative Results

תגובת לטקס חיובית מתרחשת כאשר נוגדנים מסוג ספציפי שצורפו לחלקיקי הלטקס נקשר לכמוסה של pneumococcus, והתלכדות של חלקיקי הנוגדן שכותרתו מתפתחת ^15. איור 1 א מציג תגובה חיובית המתאפיינת בהתלכדות וסליקה גלויות של הרקע השעיה. תגובה שלילית מאופיינת בהשעיה מגיב התלכדות לטקס שנותרה חלק ולבן (איור 1). ריאגנטים מותאמים כך שתגובה חיובית יש לשים לב לפני סוף המרווח דק 'פעם אחת (בדרך כלל להבחין בכ 20 שניות). אנחנו לא ממליצים לקרוא את תגובות אחרי פרק זמן 1 דקות. לעתים רחוקות, תגובות להציג התלכדות חלשה מסביב לקצה של הירידה שאינו מלווה על ידי ניקוי של ההשעיה הרקע, או להופיע "סיבי" ללא סליקת רקע (מידע לא מוצג). אלה הם רוב כמו תגובות שליליות ly. במקרים כאלה, אנו ממליצים retesting ו / או חקירה נוספת בשיטה אחרת serotyping (לדוגמא תגובת Quellung ^17).

1 תגובות איור חיוביות ושליליות התלכדות לטקס. תכשירים מדלקת ריאות לבודד מעורבים עם מגיב התלכדות הלטקס מראה תגובה חיובית () או תגובה שלילית (B). התלכדות מלווה בסליקה של הרקע נראית בתגובה החיובית () .There אין התלכדות גלויה עם מגיב לטקס ביקורת השלילי או בתגובה שלילית בדיקה (B). תמונות ⁸ בשימוש באישור."Target =" _blank "> לוחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

התלכדות לטקס היא שיטה פשוטה, מהירה וזולה לserotyping דלקת ריאות. ריאגנטים התלכדות לטקס דלקת ריאות מסחריים זמינים, אבל הם כרגע לא מבדילים כל דלקת הריאות הידועות קפסיד ^10,12. עם זאת, ניתן לייצר חומרים כימיים התלכדות לטקס בקלות בתוך הבית באמצעות antisera נרכש הועלה נגד אנטיגנים קופסית דלקת ריאות ספציפיות. בשיטה המתוארת כאן, נוגדנים באופן פסיבי קשורים לחלקיקי לטקס כדי להפוך את קבוצה של חומרים כימיים התלכדות לטקס.

תגובת לטקס חיובית מתרחשת כאשר נוגדנים ספציפיים קשורים לחלקיקי הלטקס לצרף לאנטיגנים בכמוסת פוליסכריד של דלקת הריאות לבודד ^18,19. חלקיקי הלטקס צמודים לנוגדנים לאפשר תגובת הנוגדן אנטיגן הספציפית להיות דמיינו ללא הגדלה.

התלכדות לטקס היא שיטה מתאימה למעבדות תפוקה גבוההגם ד להגדרות משאבים לעניים. יתרונות עיקריים של שיטת התלכדות הלטקס הם שאין צורך בציוד מיוחד כדי לבצע את הבדיקה, יש לי ריאגנטים חיי מדף של לפחות 2 שנים, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס ^8, ושזה לא יקר, פשוט ומהיר לביצוע. Serotyping בודד דלקת ריאות על ידי התלכדות לטקס לוקח כ 10 דקות, וניתן לבדוק עד ארבעה חומרים כימיים לטקס במקביל בשקופית אחת. יתר על כן, אם השכיחות של זנים אל ידועה בהגדרה אפידמיולוגיים הרלוונטית, בדיקה יכולה להתבצע בסבבים החלו בבריכות המכילות את הזנים אל הנפוצים ביותר בדומה למבחן Quellung ^17. גישה זו מצמצמת את מספר הבדיקות הדרושות כדי לקבוע את סרוטיפ. השיטה היא גם מאוד לשחזור בין מפעילים שונים (מידע לא מוצג). חסרון של serotyping התלכדות לטקס הוא שייצור חומרים כימיים הוא לצרוך זמן, לוקח כ 4 שעות; למרות ריאד מרובהבקלות יכול להיות מיוצר NTS במקביל. יתר על כן, כמה אנטיגנים משותפים לזנים אל דלקת ריאות שונים, וכתוצאה מכך לתגובות צולבות עם כמה antisera (למשל, סרוטיפ 29, 42 וקבוצת 35). עם זאת, תגובות הצולבות אלה גם מתאפיינים בעת שימוש antisera המסחרי (שהוא בדרך כלל preabsorbed להסיר את הנוגדנים מגיבים צולבים בעייתיים יותר) ושולחנות תגובה נוספים מסופקות על ידי היצרן כדי להבדיל בי סרוטיפ הוא הווה. ריאגנטים לאטקס יכול גם לחצות יגיבו אם הנוגדנים אינם מיושרים כהלכה על חלקיקי הלטקס; אלה מתגלים ככישלונות QC. מניסיוננו, QC הקפדני הוא מרכזי להצלחתה של שיטה זו, גם כאשר antisera זמין מסחרי המשמשים לייצור. QC לוקח כ 15 דקות לכל מגיב והוא מסתמך על סט של QC המתאים המבודד כפי שתואר לעיל.

השיטה המתוארת כאן תוצאות בריאגנטים שנותנים wi גם תגובה חיוביתדק תקופת המבחן. מניסיוננו, תוצאות חיוביות שגויות הן נדירות בפועל (מידע לא מוצג). תגובות שליליות כוזבות מדי פעם הם נצפו; בדרך כלל אלה מתייחסים לבעיות ידועות עם antiserum מסוים (לדוגמא, serogroup 6 מבודדים עשויים שלא להגיב בB antiserum בריכה), או למטה רגולציה של ביטוי כמוסה ידי הבודד. השימוש בalgrorithm serotyping מסופק על ידי היצרן הוא גם חשוב, כמו ברוב המקרים תגובה חיובית או שלילית כוזבת תוביל לתוצאה "סוף עיוור". במקרים אלה, וכאשר התגובות הן קשות לפרש, אנו ממליצים לחזור על בדיקה ו / או בדיקה על ידי שיטה חלופית כגון תגובת Quellung.

פתרון בעיות מסוימים נדרשת מעת לעת כדי להפוך את חומרים כימיים לטקס משביע רצון. בשיטה המתוארת כאן, הנוגדן מחובר לחלקיקי לטקס באמצעות ספיחה פסיבית ^15,19, כך משתנה קריטי הוא הריכוז של נוגדנים המשמש, שקובע עד כמהפני השטח של חלקיקי הלטקס מכוסה והיישור הבא של האתרים הפעילים נוגדן ^15,20. כתוצאה מכך, אם נוגדן מספיק או עודף מחובר לחלקיקי הלטקס, תגובות נוגדן אנטיגן לא תהיינה אופטימליות, וריאגנטים בלתי מספקים עלולים להיווצר ^15,20,21. כטיטר נוגדנים להשתנות בין המון השונים של antisera, קבוצה סטנדרטית של דילולים לא יכולה לייצר חומרים כימיים כי ביצועים טובים ^8. נקודת התחלה שימושית היא להשתמש בדילול 01:40 של antiserum, ואם זה לא מוצלח, לדלל את antiserum נוסף. מניסיוננו זה בדרך כלל פותר את הבעיה ^8. במספר קטן של מקרי ריאגנטים עשויים להראות התלכדות חלשה שאינו מלווה בסליקה של ההשעיה כאשר נבדקו עם היעד מבודד. במקרים אלה דילול antiserum אינו משפר את האיכות של המגיב, אבל בדרך כלל ניתן לייצר חומרים כימיים משביעות רצון על ידי השמטת צנטריפוגה ולשטוף צעדים ^8,22

חלקיקי לטקס נוגדן מצופה נמצאים בשימוש נפוץ במיקרוביולוגיה אבחונים לגילוי, זיהוי או serotyping של חיידקים רבים ושונים ^15,20. ככזה, השיטה המתוארת כאן עשויה להיות מתאימה להכנת ריאגנטים לטקס למטרות אחרות, antisera המתאים ובלבד זמין ונהלי QC נאותים יאומצו.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microparticles based on polystyrene, 800 nm	Sigma	65984-10 ml-F	Or other volumes as required
Normal rabbit serum	Antibodies Australia	NRS-1ml	Or other volumes as required, bring to RT before use
Pneumococcus (Neufeld) antisera	SSI Diagnostica	Various	Bring to RT before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Sterile Bovine Albumin	Sigma	A-4503	Bring to rRT before use
Sodium azide 10% (v/v) solution	VWR International	ROAC3902/100ml	Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml	Eppendorf	0030 120.094	Round bottom
Sodium chloride	Merck	10241.AP
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl	Copan	CD175SO1
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm	Thermo Fisher Scientific	LBS 2950RC
5 M NaOH	BDH	10252	Caution: highly corrosive
Glycine	Merck	10119.05
Horse Blood Agar (HBA) plates	Thermo Fisher Scientific	PP2001	Bring to RT before use http://www.thermofisher.com.au
Rotating wheel	Wyble Engineering Development Corporation
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml	Technoplas	S5016SU
60 ml syringes without needles	Terumo	SS-60L
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm	Merck Millipore	SLGP033RS
Brochure on Neufeld antisera	Statens Serum Institut		Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Key to pneumococcal factor serum	Statens Serum Institut	18058	For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
*alternative sources are available for most materials