Summary
Test di agglutinazione al lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per sierotipizzazione Streptococcus pneumoniae, ed è anche stato ampiamente applicato in microbiologia diagnostica. Questo manoscritto descrive la produzione interna dei reagenti di agglutinazione al lattice, procedure di controllo della qualità e l'applicazione di questa tecnica per sierotipizzazione pneumococco.
Introduction
Streptococcus pneumoniae (pneumococco) è una delle principali cause di morbilità e mortalità nei bambini sotto l'età di cinque anni, in particolare in contesti poveri di risorse 1,2 in tutto il mondo. Gamme di malattia pneumococcica da infezioni localizzate a condizioni di pericolo di vita come la polmonite, la sepsi e la meningite 1,2.
Più di 90 sierotipi di pneumococco sono stati identificati sulla base di differenze nella loro polisaccaride capsulare 3. Vaccini attuali di mira il polisaccaride capsulare e forniscono protezione dalle principali sierotipi che causano malattia invasiva 4. Sierotipizzazione pneumococco isolati è importante per valutare l'impatto della vaccinazione sulla carrozza e le malattie, oltre a fornire informazioni più ampie epidemiologiche 5,6. L'attuale metodo di 'gold standard' per la sierotipizzazione pneumococco è la prova Quellung, ma richiede tempo e richiede una certa abilità a perform 7. Agglutinazione al lattice è un metodo alternativo sierotipizzazione raccomandata dall'Organizzazione mondiale della sanità 7. Agglutinazione del lattice è veloce e semplice da eseguire, ed è impiegato in molti laboratori in tutto il mondo 8-11. È importante sottolineare che, di agglutinazione al lattice ha mostrato un'accuratezza paragonabile alla prova Quellung per la sierotipizzazione pneumococco 10,12-14. Nel complesso, questo metodo è ideale per gli ambienti poveri di risorse, nonché i laboratori ad alto rendimento.
Reagenti di agglutinazione al lattice (latex 'reagenti') sono creati mediante l'applicazione di anticorpi a particelle di lattice 15. In una reazione positiva, queste particelle etichettate agglutinano in presenza di antigene specifico. Reagenti al lattice commerciali sono disponibili per una gamma limitata di sierotipi. Reagenti al lattice possono anche essere preparati in casa utilizzando antisieri disponibili in commercio 10. Miscele di antisieri ('pool'), così come antisieri specifici per s pneumococcoerogroups (ad esempio, gruppo 19), i singoli sierotipi (ad esempio, sierotipo 5), e di antigeni specifici («fattori», ad es., fattore 19c riconoscendo sierotipo 19A) per definire ulteriormente i sierotipi all'interno dei gruppi sono disponibili 16.
Questo manoscritto descrive le principali fasi della produzione di reagenti al lattice utilizzano attaccamento passivo commercialmente disponibile antisieri di particelle di lattice. Il controllo di qualità (QC) aspetti di questo metodo sono descritti, e un protocollo per l'utilizzo di reagenti al lattice per la sierotipizzazione pneumococco è incluso.
Protocol
1 Preparazione di in-house Reagenti lattice
- Preparazione di glicina soluzione salina tamponata (GBS)
- Aggiungere 1,5 g di glicina, 11,7 g di cloruro di sodio e 100 ml di acqua distillata ad un bicchiere di vetro da 200 ml.
- Mescolare per sciogliere con un agitatore magnetico.
- Trasferire la miscela di un 500 ml cilindro graduato e aggiungere acqua distillata per un totale di 200 ml.
- Trasferire la soluzione torna nel becher da 200 ml, controllare il pH e regolare a 8,2 con idrossido di sodio 5 M. NOTA: L'idrossido di sodio è corrosivo, indossare dispositivi di protezione individuale.
- Filtro sterilizzare la soluzione con 0,22 micron filtri e diversi 60 ml siringhe in una bottiglia di vetro da 250 ml con tappo a vite preautoclaved.
- Conservare a temperatura ambiente.
- Preparazione di GBS con il 0,2% di siero albumina bovina
- Aggiungere 0,2 g di albumina di siero bovino (BSA) in polvere e 100 ml di GBS per un bicchiere di vetro da 200 ml e frantumarla con un agitatore magnetico.
- Filtrosterilizzare la soluzione attraverso 0.22 micron filtri utilizzando diversi 60 ml siringhe in un ml preautoclaved vite bottiglia di vetro con tappo 250.
- Conservare a 4 ° C.
- Preparazione del reagente lattice
- Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo.
NOTA: rotondo tubi fondo sono utilizzati per ridurre al minimo sedimentazione delle particelle che possono influenzare l'attaccamento degli anticorpi. - Usando una pipetta P1000 con punte sterili aggiungono 975 ml di GBS nella provetta per microcentrifuga, poi aggiungere 25 ml di antisiero adeguato pneumococcica per il reagente al lattice in fase di preparazione (cioè, piscina, gruppo, tipo o fattore). Inverti cinque volte per mescolare.
- Diluire particelle di polistirene 01:10 con l'aggiunta di 120 ml di particelle di lattice a 1.080 ml di soluzione fisiologica sterile.
NOTA: Questo può essere fatto in grandi volumi, ma deve essere fatta fresca ogni volta i reagenti al lattice sono prodotti. - Aggiungere 1,000 ml di sospensione 01:10 lattice (preparato al punto 1.3.3) per l'1,000 microlitri di sospensione 01:40 antisiero (preparato al punto 1.3.2). Inverti cinque volte per mescolare.
- Incubare a 37 ° C su una ruota lenta rotazione (ad esempio, 4 rpm per una ruota di diametro 38,5 centimetri) per 2 ore.
- Centrifugare per 15 minuti a 1100 x g. Eliminare il supernatante e risospendere delicatamente il pellet in 2 ml di soluzione fisiologica sterile.
- Centrifugare per 15 minuti a 1100 x g. Eliminare il supernatante e aggiungere 1 ml di GBS e risospendere delicatamente il pellet.
- Pipettare la sospensione di lattice in un etichettati 5 ml vite ricoperto tubo. Aggiungi un altro 1 ml di GBS.
- Aggiungere 2 ml di GBS contenente 0,2% di BSA (w / v) (pH 8.2) (preparata al punto 1.2). Aggiungere 40 ml di 10% (w / v) di sodio azide come conservante.
NOTA: Sodio azide è pericoloso se inalato, ed è irritante per la pelle e gli occhi. È auspicabile per l'acquisto di una soluzione preparata al 10% piuttosto che la forma in polvere, in quanto questo riduce al minimo il rischio di esposizione per inalazione. Dispositivi di protezione individuale (compresi i guanti unocchiali di protezione antispruzzo d) devono essere indossati quando si maneggia questo reagente. Consultare la scheda di sicurezza per ulteriori dettagli. - Conservare i reagenti al lattice a 4 ° C.
- Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo.
- Preparazione del controllo negativo reagente al lattice
- Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo.
NOTA: rotondo tubi fondo sono utilizzati per ridurre al minimo sedimentazione delle particelle che possono influenzare l'attaccamento degli anticorpi. - Usando una pipetta P1000 con punte sterili aggiungono 975 ml di GBS nella provetta per microcentrifuga, quindi aggiungere 25 microlitri normale antisiero di coniglio. Inverti cinque volte per mescolare.
- Procedere come nei punti 1.3.3 a 1.3.10 sopra
- Etichettare un 2 ml rotondo provetta per microcentrifuga fondo.
2 Controllo Qualità (QC) di lattice Reagenti
- Portare reagente al lattice a RT. Immediatamente prima dell'uso, mescolare delicatamente il reagente al lattice capovolgendo la provetta diverse volte.
- Controllare reagente per autoagglutinazione pipettando 15 microlitri su un vetrino da microscopio in vetro e procedere come nei passi 4.7 e 4.8 qui di seguito. Non ci dovrebbe essere ungglutination delle particelle di lattice. Il reagente dovrebbe apparire bianca e liscia.
- Testare il reagente contro un gruppo di basso passaggio isolati di pneumococco. Utilizzare le culture fresche coltivate preparato come al punto 3 Il pannello di isolati dovrebbe includere isolati del sierotipo 'obiettivo' (il sierotipo specifico per il reagente in fase di test) e sierotipi "non bersaglio" (isolati di altri sierotipi che non dovrebbero normalmente attraversare reagire con il reagente). Includere almeno un isolato di ciascun bersaglio e non bersaglio sierotipo per ogni reagente al lattice in fase di controllo di qualità. Se vi è un solo bersaglio o non bersaglio sierotipo, prova due diversi isolati di particolare sierotipo.
NOTA: Il pannello di test dovrebbe includere diversi isolati di ciascun sierotipo, alcuni dei quali sono rari in malattia invasiva e / o tipo di collezioni di colture. È preferibile includere alcuni carrozza isolati, in quanto sono spesso più impegnativo sierotipo (dati non mostrati), così testare ulteriormente la capacità of i reagenti e garantire che i reagenti sono probabili in grado di sierotipizzazione sia invasivo e isolati carrozza. - Procedere con il test di reagenti al lattice con bersaglio e non bersaglio pneumococco isolati secondo il metodo descritto nei passaggi 3 e 4.
- Reagenti di controllo della qualità al momento della produzione e poi in seguito almeno annualmente.
NOTA: Se un reagente non passa QC, il lotto deve essere scartato e una nuova preparazione fatta. In caso di guasto si consiglia di ripetere il controllo di qualità dei reagenti essere prodotti usando i metodi alternativi descritti in Ortika et al., 2013 8 e nella discussione di seguito.
3 Preparazione delle Culture pneumococco per la sierotipizzazione
- Utilizzando un'ansa sterile selezionare una singola colonia del pneumococco isolare e realizzato questo su un solido non selettivo agar sangue in modo che l'inoculo primario si estende per circa un terzo della superficie della piastra. Streak per singole colonie.
NOTA: Piatti preparati con sangue defibrinato di cavallo o di pecora sono adatte; ma le piastre di sangue preparati con sangue umano o di sangue animale citrato non sono. - Incubare la piastra O / N a 37 ° C in atmosfera al 5% di CO 2.
- Osservare la crescita sulla piastra per la purezza e valutare che vi sia una crescita sufficiente per sierotipizzazione.
NOTA: Una cultura pura dell'isolato pneumococco è necessario per sierotipizzazione. Nella nostra esperienza, confluenti, o in prossimità confluenti crescita che copre circa un terzo della superficie della piastra è di solito sufficiente per completare sierotipizzazione. Come culture pneumococco possono essere soggette a autolisi, culture preparati per la sierotipizzazione devono essere testati entro 24 ore della sottocultura. Non prendere la piastra di coltura fuori dell'incubatore più di 15 a 20 minuti prima sierotipizzazione inizio.
4. L'esecuzione di agglutinazione al lattice Sierotipizzazione
- Rimuovere tutti i reagenti al lattice dal frigorifero e permettere loro di scaldare a temperatura ambiente per circacir- ca 30 min. Immediatamente prima dell'uso, capovolgere delicatamente i tubi per mescolare i reagenti.
- Etichettare un vetrino da microscopio.
- Mettere 15 ml di reagente di controllo negativo in lattice sul vetrino da microscopio.
- Utilizzando un usa e getta ciclo 1 ml sterile prendere una spazzata della cultura pneumococco in modo che il ciclo è di circa mezzo pieno.
- Spalmare delicatamente l'inoculo sulla superficie del vetrino vicino alla goccia di reagente di controllo negativo lattice. L'inoculo dovrebbe essere visibile sul vetrino.
- Mescolare velocemente e accuratamente l'inoculo nel reagente di controllo negativo in lattice utilizzando il loop. Assicurarsi che la goccia non si diffonde oltre la sua dimensione iniziale.
- Raccogliete la diapositiva, tenendolo ad entrambe le estremità. Rock the scorrere avanti e indietro per 1 min. Fare attenzione a mantenere il liquido si muove lentamente, e assicurare che la dimensione della goccia non aumenta.
NOTA: In alternativa, utilizzare un rocker piatto. - Osservare per agglutinazione macroscopica (cioè,occhio nudo) e compensazione della sospensione contro uno sfondo nero.
- Se il reagente di controllo negativo non mostra alcuna agglutinazione al lattice o di compensazione continuare testare la cultura, sostituendo i reagenti al lattice per la negativa reagente al lattice controllo nei passaggi 4,1-4,8 sopra. Un ciclo fresco deve essere utilizzato ogni volta. Procedere con il test dei reagenti al lattice che iniziano con le piscine.
- Prova ciascuno dei "pool" reagenti al lattice in successione fino ad ottenere un test positivo.
NOTA:. L'ordine delle prove delle piscine può essere fatto in "round" per riflettere l'incidenza locale di particolari sierotipi (ad esempio, testando per le tre piscine più probabili sulla prima diapositiva Se non si ottiene una reazione positiva, allora prova il prossimo tre più probabile delle restanti piscine sulla seconda slitta, e così via fino ad ottenere una reazione positiva). Questo assicura che i sierotipi più comuni sono testati prima, riducendo al minimo il tempo e reagenti necessari. - Usando la chiave del produttore antisieri determinare quali antisieri individuali sono rappresentati nella piscina positivo.
- Prova ciascuno dei gruppi o tipi contenuti nella piscina positivo individualmente per determinare il 'gruppo' o 'tipo' come nei passaggi 4,1-4,8 sopra.
- Determinare il risultato con riferimento alla chiave del produttore antisieri. Se un 'tipo' è determinato (ad esempio, sierotipo 5), quindi nessun ulteriore test è necessario e questo risultato viene registrato.
- Se un 'gruppo' è determinato (ad esempio, gruppo 19), quindi fare riferimento alla chiave produttori per determinare i fattori da testare. Continuare il test con i singoli reagenti al lattice 'Factor' e determinare il sierotipo finale (ad esempio, sierotipo 19B).
Representative Results
Una reazione positiva si verifica quando lattice anticorpo specifico tipo allegata alla particella di lattice si lega alla capsula del pneumococco, e agglutinazione delle particelle anticorpo marcato Segue 15. Figura 1A mostra una reazione positiva che si caratterizza per agglutinazione visibile e compensazione dello sfondo sospensione. Una reazione negativa è caratterizzata dalla sospensione reagente al lattice restante liscio e bianco (Figura 1B). I reagenti sono ottimizzati in modo che una reazione positiva deve osservare prima della fine dell'intervallo di tempo di un minuto (generalmente rilevabili in circa 20 sec). Noi non consigliamo di leggere le reazioni dopo l'intervallo di tempo 1 min. Molto raramente, reazioni mostrano agglutinazione debole intorno al bordo della goccia che non sia accompagnato dalla compensazione della sospensione sfondo, o apparire 'filante' senza sfondo clearing (dati non riportati). Questi sono più come reazioni negative ly. In questi casi, si consiglia di ripetere le prove e / o ulteriori indagini utilizzando un altro metodo sierotipizzazione (per esempio la reazione Quellung 17).
Figura 1 Le reazioni di agglutinazione al lattice positive e negative. Preparazioni dei pneumococcica isolare mescolati con il reagente di agglutinazione al lattice che mostra una reazione positiva (A) o una reazione negativa (B). Agglutinazione accompagnato dalla compensazione dello sfondo si vede nella reazione positiva (A) .C'è nessuna agglutinazione visibile con il reagente di controllo negativo lattice o in una reazione test negativo (B). Fotografie 8 utilizzati con il permesso."Target =" _blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Agglutinazione del lattice è un metodo semplice, rapido e poco costoso per la sierotipizzazione pneumococco. Reagenti di agglutinazione al lattice pneumococco commerciali sono disponibili, ma attualmente non permettono di distinguere tutti pneumococcica noto sierotipi 10,12. Tuttavia, i reagenti di agglutinazione al lattice possono essere facilmente prodotte in-house usando antisieri acquistato sollevata contro specifici antigeni capsulari pneumococco. Nel metodo descritto qui, gli anticorpi sono passivamente collegati a particelle di lattice per fare una serie di reagenti di agglutinazione al lattice.
Una reazione positiva lattice si verifica quando gli anticorpi specifici legati alle particelle di lattice si attaccano agli antigeni sulla capsula del polisaccaride pneumococcico isolare 18,19. Le particelle di lattice allegate agli anticorpi consentire la reazione specifica antigene-anticorpo per essere visualizzato senza ingrandimento.
Latex agglutinazione è un metodo adatto per i laboratori ad alto rendimento di und anche per i poveri di risorse. I principali vantaggi del metodo di agglutinazione al lattice sono che nessuna attrezzatura specializzata è necessario per eseguire il test, i reagenti hanno una durata di almeno 2 anni se conservato a 4 ° C 8, e che è poco costoso, semplice e veloce da eseguire. Sierotipizzazione un isolato da pneumococco agglutinazione al lattice impiega circa 10 minuti, e fino a quattro reagenti al lattice può essere testato in parallelo su una diapositiva. Inoltre, se la prevalenza dei sierotipi è noto per l'impostazione epidemiologico rilevante, il test può essere eseguito in turni che iniziano con le piscine che contengono i sierotipi più comuni in modo simile alla prova Quellung 17. Questo approccio riduce al minimo il numero di prove necessarie per determinare il sierotipo. Il metodo è anche altamente riproducibile tra diversi operatori (dati non mostrati). Uno svantaggio di agglutinazione al lattice sierotipizzazione è che la produzione di reagenti molto tempo, prendendo circa 4 ore; anche se Reage multiplanti può essere facilmente prodotta in parallelo. Inoltre, alcuni antigeni sono comuni tra i diversi sierotipi di pneumococco, causando reazioni crociate con alcuni antisieri (ad esempio, sierotipo 29, 42 e Gruppo 35). Tuttavia, queste reazioni trasversali sono ben caratterizzati quando si utilizzano antisieri commerciali (che di solito è preabsorbed per eliminare gli anticorpi cross-reagenti più problematici) e le tabelle di reazione aggiuntivi sono forniti dal produttore, al fine di distinguere quale sierotipo è presente. Reagenti al lattice può anche attraversare reagire se gli anticorpi non sono allineati correttamente sulle particelle di lattice; questi vengono rilevati come errori di QC. Nella nostra esperienza, rigoroso controllo di qualità è fondamentale per il successo di questo metodo, anche quando antisieri disponibili in commercio vengono utilizzati per la produzione. QC richiede circa 15 minuti per ogni reagente e si basa su una serie di appropriate QC isolati come descritto sopra.
Il metodo qui descritto si traduce in reagenti che danno una positiva reazione ben wisottile il periodo di prova. Nella nostra esperienza, i falsi positivi sono rari nella pratica (dati non riportati). Occasionali reazioni false negative si osservano; di solito si riferiscono a problemi noti con un particolare antisiero (ad esempio, sierogruppo 6 isolati non possono reagire con piscina B antisiero), o down regulation dell'espressione capsula da parte l'isolato. Utilizzando il algrorithm sierotipizzazione fornito dal produttore è anche importante, come nella maggior parte dei casi una falsa reazione positiva o negativa porterà a un risultato 'finale cieca'. In questi casi, e quando le reazioni sono di difficile interpretazione, si consiglia di ripetere il test e / o prove con un metodo alternativo, come la reazione Quellung.
Alcuni la risoluzione dei problemi è a volte necessario per rendere reagenti al lattice soddisfacenti. Nel metodo qui descritto, l'anticorpo è attaccato a particelle di lattice tramite adsorbimento passivo 15,19, quindi una variabile critica è la concentrazione di anticorpo utilizzato, che determina quanto benela superficie delle particelle di lattice è coperto e il conseguente allineamento delle anticorpali siti attivi 15,20. Di conseguenza, se l'anticorpo insufficiente o in eccesso è collegato alle particelle di lattice, le reazioni antigene-anticorpo non saranno ottimali, e reagenti insoddisfacenti possono essere prodotti 15,20,21. Come titoli anticorpali variano tra i diversi lotti di antisieri, un set standard di diluizioni non può produrre i reagenti che eseguono bene 8. Un utile punto di partenza è quello di utilizzare una diluizione 1:40 di antisiero, e se questo non è successo, diluire ulteriormente l'antisiero. Nella nostra esperienza questa di solito si risolve il problema 8. In un piccolo numero di casi reagenti possono mostrare agglutinazione debole che non è accompagnato dalla compensazione della sospensione durante il test con l'obiettivo di isolare. In questi casi la diluizione di antisiero non migliora la qualità del reagente, ma reagenti soddisfacenti possono solitamente essere prodotti omettendo la centrifugazione e lavaggio passi 8,22
Legate agli anticorpi particelle di lattice sono utilizzati comunemente in microbiologia diagnostica per la rilevazione, l'identificazione o la sierotipizzazione di molti microbi diversi 15,20. Come tale, il metodo qui descritto può essere adatto per la preparazione di reagenti al lattice per altri scopi, a condizione antisieri adatto è disponibile e di adeguate procedure di controllo di qualità sono adottati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
| Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to RT before use |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to RT before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to rRT before use |
| Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
| Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
| Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
| 5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
| Glycine | Merck | 10119.05 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to RT before use http://www.thermofisher.com.au |
| Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | ||
| Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
| 60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
| Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| *alternative sources are available for most materials |
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