Summary
유액 응집 시험은 폐렴 구균 혈청 형을위한 간단하고 신속하고 저렴한 방법, 또한 진단 미생물학 널리 적용되어왔다. 이 원고는 라텍스 응집 시약, 품질 관리 절차의 내재화 및 폐렴 혈청 형이 기술의 애플리케이션을 설명한다.
Introduction
폐렴 구균 (폐렴 구균)는 5 세 미만의 아동의 이환율과 사망률의 주요 원인입니다 오래 전 세계적으로, 특히 자원이 부족한 설정 1,2. 폐렴, 패혈증과 같은 생명을 위협하는 조건에 국소 감염에서 폐렴 구균 질환의 범위 및 1,2 수막염.
폐렴 구균의 90 개 이상의 혈청 형이 확인 된 자신의 피막 다당류 세의 차이에 기초하고있다. 현재 백신은 캡슐 다당류를 대상으로 침습성 질환 사를 일으키는 주요 혈청 형에서 보호 기능을 제공합니다. 폐렴 구균 혈청 형 균주를하는 캐리지와 질병에 대한 백신의 효과를 평가뿐만 아니라, 광범위한 역학 5,6 정보를 제공하는 것이 중요하다. 폐렴 구균 혈청 형에 대한 현재의 '금 표준'방법은 Quellung 시험이지만, 시간 소모적이며 PERFO 일부 기술이 필요RM 7. 라텍스 응집은 세계 보건기구 (WHO) 7 권장하는 다른 혈청 형 방법입니다. 라텍스 응집을 수행 할 수 신속하고 간단하며, 전 세계적으로 8-11 많은 실험실에서 사용된다. 중요한 것은, 라텍스 응집는 폐렴 구균 혈청 형 10,12-14에 대한 Quellung 시험에 필적하는 정확도를 보여 주었다. 전반적으로,이 방법은 자원이 부족한 설정뿐만 아니라 높은 처리량 실험실에 이상적입니다.
라텍스 응집 시약 ( '라텍스 시약') 라텍스 입자 (15)에 대한 항체의 부착에 의해 만들어집니다. 양성 반응에서, 이러한 표지 된 입자는 특정 항원의 존재 하에서 응집. 상업 라텍스 시약은 혈청 형의 제한된 범위에 사용할 수 있습니다. 라텍스 시약도 시판 10 항혈청을 사용하여 자체 제조 할 수있다. 항혈청의 혼합물 ( '풀')뿐만 아니라 고유의 폐렴 구균 항혈청erogroups (예를 들어, 그룹 19), 각각의 혈청 형 (예를 들면, 혈청 형 5), 특정 항원 ( '요인', 예를 들면., 혈청 형 19A를 인식 요인 19C) 또한 그룹 내에서 혈청 형을 정의는 16 사용할 수 있습니다.
이 원고는 라텍스 입자에 시판 항혈청의 수동적 인 첨부 파일을 사용하여 라텍스 시약의 생산의 주요 단계를 설명합니다. 이 방법의 품질 관리 (QC) 양태를 설명하며, 폐렴 구균 혈청 형에 대한 라텍스 시약의 사용을위한 프로토콜을 포함한다.
Protocol
사내 라텍스 시약의 1 준비
- 글리신 완충 용액의 제조 (GBS)
- 1.5 g 글리신 11.7 g 나트륨 클로라이드 및 200 ㎖의 유리 비이커에 증류수 100 ㎖를 추가한다.
- 마그네틱 교반기를 사용하여 용해 혼합한다.
- 측정 실린더에 500 ㎖의 혼합물을 전송하고 200 ㎖의 총 증류수를 추가한다.
- , 200 ㎖의 비이커로 다시 이동시켜 용액 pH를 확인하고 5 M 수산화 나트륨으로 8.2로 조정한다. 참고 : 수산화 나트륨은 부식성은, 개인 보호 장비를 착용 할 것.
- 필터는 250 ml의 preautoclaved 스크류 캡 유리 병에 0.22 μM 필터 및 몇몇 60ml를 주사기를 사용하여 용액을 소독.
- 실온에서 보관하십시오.
- 0.2 % 소 혈청 알부민으로 제조 GBS
- 200 ㎖의 유리 비커에 소 혈청 알부민 (BSA) 분말 0.2 g과 GBS 100 ㎖를 넣고 자기 교반기를 사용하여 용해 혼합한다.
- 필터250 ml의 preautoclaved 스크류 캡 유리 병에 60 ㎖의 여러 주사기를 이용하여 0.22 μM 필터를 통해 살균 용액.
- 4 ℃에서 보관하십시오.
- 라텍스 시약 준비
- 하단의 microfuge 튜브 라운드 2 ㎖의 레이블.
참고 : 둥근 바닥 튜브는 항체 첨부 파일에 영향을 미칠 수있는 입자의 침전을 최소화하는 데 사용됩니다. - 멸균 팁 미세 원심 분리 튜브에 GBS의 975 μl를 추가로 P1000 피펫을 사용하여 한 라텍스 시약 (즉, 풀, 그룹, 유형 또는 요소) 준비되고 적절한 폐렴 구균 항혈청의 25 μl를 추가합니다. 혼합 다섯 번 반전.
- 멸균 생리 식염수를 1080 μL하여 라텍스 입자의 120 μl를 첨가하여 폴리스티렌 라텍스 입자 1:10 희석.
주 :이 큰 볼륨으로 만들 수 있지만, 라텍스 시약을 생산하는 신선한마다 이루어져야한다. - 1 (단계 1.3.3에서 준비) 1:10 라텍스 현탁액의 1000 μl를 추가,000 ㎕의 1시 40분 항혈청 서스펜션 (단계 1.3.2에서 준비). 혼합 다섯 번 반전.
- 천천히 회전하는 바퀴에 37 ° C에서 품어 (예를 들어, 38.5 cm 직경의 바퀴 4 회전) 2 시간 동안.
- 1,100 X g에서 15 분 동안 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 부드럽게 멸균 생리 식염수 2 ml의 펠렛을 재현 탁.
- 1,100 X g에서 15 분 동안 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 GBS 1 ㎖를 추가하고 부드럽게 펠렛을 재현 탁.
- 레이블이 5 ㎖ 중에 라텍스 현탁액을 피펫 튜브 출장 나사. GBS의 또 다른 한 ML을 추가합니다.
- GBS는 (산도 8.2) (단계 1.2에서 준비) (/ V w) 0.2 % BSA를 포함하는 2 ㎖를 추가합니다. 10 % 방부제로 아 지드 화 나트륨의 (w / v)의 용액 40 μl를 추가합니다.
참고 : 아 지드 화 나트륨은 흡입하면 위험하고, 피부와 눈에 자극을 일으킬 수 있습니다. 이 흡입 노출의 위험을 최소화 따라 그것은 분말 형태가 아닌 제조 10 % 용액을 구입하는 것이 바람직하다. 장갑을 포함하여 개인 보호 장비 (이 시약을 취급 할 때, D의 고글)을 착용해야합니다. 자세한 내용은 물질 안전 데이터 시트를 참조한다. - 4 ° C에서 보관 라텍스 시약.
- 하단의 microfuge 튜브 라운드 2 ㎖의 레이블.
- 음성 대조군 라텍스 시약의 제조
- 하단의 microfuge 튜브 라운드 2 ㎖의 레이블.
참고 : 둥근 바닥 튜브는 항체 첨부 파일에 영향을 미칠 수있는 입자의 침전을 최소화하는 데 사용됩니다. - 멸균 팁 미세 원심 분리 튜브에 GBS의 975 μl를 추가로 P1000 피펫을 사용하여 한 25 ㎕의 정상 토끼 항혈청을 추가합니다. 혼합 다섯 번 반전.
- 설명한 것처럼 위의 1.3.10에 1.3.3
- 하단의 microfuge 튜브 라운드 2 ㎖의 레이블.
2 품질 관리 라텍스 시약 (QC)
- RT에 라텍스 시약을 준비한다. 즉시 사용하기 전에 부드럽게 튜브를 여러 번 반전 라텍스 시약을 혼합한다.
- 유리 현미경 슬라이드에 15 μl를 피펫 팅에 의해 autoagglutination을위한 시약을 확인하고 단계 4.7 이하 4.8과 같이 진행합니다. 어떤이 없어야합니다라텍스 입자의 gglutination. 시약은 흰색과 부드러운 나타납니다.
- 낮은 통로 폐구균 패널에 대한 시약을 테스트합니다. 균주의 패널은 '대상'혈청 형의 분리 (시약에 대한 특정 혈청 형이 테스트중인)와 '비 대상'혈청 형 (일반적으로 교차하지 않아야 다른 혈청 형의 균주를 포함해야 3 단계에서와 같이 제조 갓 문화를 사용하여 ) 시약과 반응. QC를 받고 각 라텍스 시약 각 표적 및 비 표적 혈청 형 중 적어도 하나의 분리를 포함한다. 특정 혈청 형의 하나의 대상 또는 비 표적 혈청, 시험이 상이한 균주가있는 경우.
참고 : 테스트 패널은 침략 질환 및 / 또는 형 문화 컬렉션 드문 일부는 각 혈청 형의 여러 가지 균주를 포함해야한다. 그들은 종종 (데이터는 도시하지 않음)의 혈청 형에 대한 추가 요구하는 것처럼시켜 상기 용량 O 테스트, 어떤 캐리지 분리 포함하는 것이 바람직하다시약 F와 시약이 침략과 마차 분리 모두 혈청 형의 가능성이 할 수있는 것을 보장한다. - 대상 및 비 대상 폐렴 구균 라텍스 시약 테스트를 진행, 3 단계와 4 단계에 설명 된 방법에 따라 분리합니다.
- 적어도 이후 매년 다음 생산 시간과의 품질 관리 시약.
NOTE : 시약 QC를 통과하지 않는 경우, 배치가 폐기하고 새로운 준비가 이루어져야한다. 반복 QC 오류가 발생하는 경우 우리는 시약 Ortika 외., 2013 팔과 아래의 설명에 설명 된 다른 방법을 사용하여 생성 할 것을 권장합니다.
혈청 형에 대한 폐렴 구균 문화의 3 준비
- 멸균 된 루프를 사용하여 폐렴 구균의 단일 콜로니를 선택 기본 접종 플레이트 표면의 약 삼분을 덮도록 고체 비 선택적 혈액 한천이 상을 분리하고 연속. 하나의 식민지 킬.
참고 : defibrinated 말이나 양의 혈액으로부터 제조 된 플레이트에 적합하다; 하지만 인간의 혈액이나 citrated 동물의 혈액 준비 혈액 판은 없습니다. - 5 % CO 2의 분위기에서 37 ° C에서 판 O / N을 품어.
- 순도 접시에 성장을 관찰하고 혈청 형에 대한 충분한 성장이 있는지 평가합니다.
참고 : 폐렴 구균 분리의 순수 문화는 혈청 형이 필요합니다. 플레이트 표면의 약 삼분을 다루는 우리의 경험, 합류, 또는 합류 근처 성장에서 일반적으로 혈청 형을 완료하기에 충분하다. 폐렴 구균 문화가 자기 분해하는 경향이있을 수 있습니다으로, 혈청 형을 위해 준비 문화는 하위 문화의 24 시간 내에서 테스트해야합니다. 혈청 형이 개시되기 전에 15 개 이상의 20 분에 인큐베이터에서 배양 플레이트를하지 마십시오.
(4) 실시 라텍스 응집의 혈청 형
- 약을 실온으로 가온을 냉장고에서 모든 라텍스 시약을 제거하고 수30 분을 펼쳐줍니다. 즉시 사용하기 전에 부드럽게 시약을 혼합 튜브를 반전.
- 현미경 슬라이드 레이블.
- 현미경 슬라이드에 음성 대조군 라텍스 시약의 15 μl를 놓습니다.
- 루프가 약 절반이되도록합니다 멸균 일회용 1 μL 루프를 사용하면 폐렴 구균 문화의 스윕을.
- 부드럽게 대조군 라텍스 시약의 방울 주변 슬라이드의 표면에 접종 얼룩. 접종은 유리 슬라이드에 표시해야한다.
- 신속하고 철저 루프를 사용하여 음성 대조군 라텍스 시약으로 균액을 혼합한다. 드롭은 초기 크기보다 더 확산되지 않도록하십시오.
- 양쪽 끝을 잡고 슬라이드를 선택합니다. 앞뒤로 1 분 동안 슬라이드 락. 천천히 움직이는 액체를 유지하고 드롭의 크기가 증가하지 않도록주의하십시오.
참고 : 또는 접시 로커를 사용합니다. - 거시적 응집 (즉,에 의해 관찰육안)와 검은 배경에 대해 정학을 취소합니다.
- 음성 대조군 라텍스 시약은 응집을 표시하거나 삭제는 위의 단계를 4.1-4.8에서 음성 대조군 라텍스 시약 테스트 라텍스 시약을 교체, 문화 테스트를 계속합니다. 신선한 루프마다 사용되어야합니다. 풀로 시작하는 라텍스 시약 테스트를 진행합니다.
- 양성 얻을 때까지 연속으로 '풀'라텍스 시약 각을 테스트합니다.
NOTE :. 예, 제 슬라이드 세 대부분 풀에 대한 테스트에 의해 특정 혈청 형 (의 로컬 빈도를 반영하는 '라운드'에서 수행 될 수있다 풀 테스팅 순서 양성 반응이 얻어지지 않은 경우, 테스트 ) 등 긍정적 인 반응을 얻을 때까지, 다음 세 번째 슬라이드에 남아있는 풀 가능성이 높습니다. 이것은 가장 흔한 혈청 필요한 시간 및 시약을 최소화 먼저 테스트되도록. - 항혈청 제조업체의 키를 사용하면 긍정적 인 풀에 표시되는 개별있는 항혈청을 결정합니다.
- 위의 단계를 4.1-4.8과 '그룹'또는 '종류'를 결정하기 위해 개별적으로 긍정적 풀에 포함 된 그룹 또는 각 유형을 테스트합니다.
- 항혈청 제조업체의 키를 참조하여 결과를 확인합니다. '타입'결정되는 경우 (예를 들면, 혈청 형 5)는, 더 이상의 테스트가 필요하지 않으므로이 결과가 기록된다.
- '그룹'판정 된 경우 (예를 들어, 그룹 (19)) 다음, 테스트 될 요인을 결정하기 위해 제조업 키 참조. 개인의 요인 '라텍스 시약 테스트를 계속하고 최종 혈청 형 (예를 들면, 혈청 형 19B)를 결정합니다.
Representative Results
라텍스 입자에 부착 형 특정 항체는 폐렴 구균의 캡슐에 결합하고, 항체 표지 입자의 응집 15 계속된다 때 긍정적 인 라텍스 반응이 발생합니다. 그림 1A는 배경의 볼 응집 및 청산을 특징으로 긍정적 인 반응을 나타낸다 서스펜션. 부정적 반응은 부드럽고 흰색 (그림 1B)에 남아있는 라텍스 응집 시약 서스펜션이 특징입니다. 양성 반응 한 최소 시간 간격 (약 20 초에서 통상 검출)이 종료되기 전에 관찰 할 수 있도록한다 시약은 최적화된다. 우리는 1 분의 시간 간격 후에 반응을 읽는하지 않는 것이 좋습니다. 아주 가끔, 반응이 배경 서스펜션의 제거와 함께, 또는 전혀 배경 지우기와 '힘줄'표시되지 드롭의 가장자리 주위에 약한 응집을 표시 (데이터가 표시되지 않음). 이들은 대부분 아르 등 LY 부정적인 반응. 이러한 경우, 우리는 재검사 및 / 또는 다른 혈청 형 방식 (예 Quellung 반응 17)를 사용하여 더 조사를 권장합니다.
그림 1 양극과 음극 라텍스 응집 반응. 폐렴 구균의 준비는 긍정적 인 반응 (A) 또는 부정적인 반응 (B)를 표시 라텍스 응집 시약과 혼합 분리합니다. 배경 비운 함께 융합은 .There은 음성 대조군 라텍스 시약 또는 부정적인 테스트 반응 (B)에서 가시적 응집없는 양성 반응 (A)에서 볼 수있다. 사진 팔의 사용은 권한이."대상 ="_ 빈은 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
라텍스 응집는 폐렴 구균 혈청 형에 대한 간단하고 신속하고 저렴한 방법입니다. 상업 폐렴 구균 라텍스 응집 시약을 사용할 수 있습니다,하지만 그들은 현재 알려진 모든 폐렴 구균은 10, 12 혈청 형 구분하지 않습니다. 그러나, 라텍스 응집 시약을 쉽게 특정 폐렴 구균 캡슐 항원에 대해 발생 살 항혈청을 사용하여 자체적으로 생성 될 수있다. 여기에 설명 된 방법에서, 항체는 수동적 라텍스 응집 시약의 세트를 만들기 위해 라텍스 입자에 부착된다.
폐렴 구균의 다당류 캡슐 (18, 19)를 분리에 라텍스 입자에 결합 된 특이 항체가 항원에 연결할 때 긍정적 인 라텍스 반응이 발생합니다. 항체에 부착 된 라텍스 입자는 특정 항체 - 항원 반응을 확대없이 가시화 될 수있다.
라텍스 응집은 높은 처리량 실험실에 적합한 방법입니다자원이 부족한 설정에 대한 교리. 라텍스 응집 방법의 주요 장점이 더 전문적인 장비는 테스트를 수행하는 데 필요한되지 않도록하고, 시약은 4 ° C 팔에 저장 될 때 최소 2 년의 수명을 가지고 있고, 그것이 저렴하고 간단하고 빠른 것을 수행 할 수 있습니다. 라텍스 응집에 의해 폐렴 구균 혈청 형을 분리하면 약 10 분 소요되며, 최대 네 개의 라텍스 시약은 하나의 슬라이드에 병렬로 테스트 할 수 있습니다. 혈청 형의 유병률이 중요한 역학 설정 알려져 있다면 또한, 테스트는 테스트 Quellung 17와 마찬가지로 가장 일반적인 혈청 형을 포함하는 풀 라운드에서 시작하여 수행 될 수있다. 이 접근법은 혈청 형을 결정하는 데 필요한 시험 횟수를 최소화한다. 방법은 또한 서로 다른 사업자 간의 재현성이다 (데이터는 미도시). 라텍스 응집 혈청 형의 단점은 시약을 제조하는 것은 약 4 시간을 가지고, 시간 소모적이라는 것이다; 여러 reage하지만NTS 쉽게 병렬로 제조 할 수있다. 또한, 일부 항원 일부 항혈청과 교차 반응의 결과로, 다른 혈청 형에 걸쳐 공통 (예를 들어, 혈청 형 29, 42, 35 그룹). (일반적으로 더 문제가 교차 반응하는 항체를 제거하기 위해 미리 흡수된다) 항혈청과 반응 추가적인 테이블을 사용하는 것은 존재하는 혈청 형을 구별하기 위해 제조자에 의해 제공되는 경우에는, 이러한 교차 반응은 잘 특징 지어진다. 항체는 라텍스 입자에 제대로 정렬되지 않은 경우도 교차 할 수 라텍스 시약은 반응; 이들은 품질 관리 실패로 감지된다. 우리의 경험에 의하면, 엄격한 QC는 시중에서 판매하는 항혈청을 생산에 사용되는 경우에도이 방법의 성공의 핵심입니다. QC 시약 당 약 15 분 소요되며 상기 균주로 적절한 QC의 집합에 의존하고있다.
여기서 설명한 방법은 양성 반응 웰 WI를 제공 시약 초래시험 기간 얇은. 우리의 경험에 의하면, 오탐 (false positive) (데이터는 제시하지 않음) 실제로는 드물다. 가끔 위음성 반응이 관찰된다; 일반적으로 이러한 특정 항혈청 알려진 문제 (예, 혈청군 6 균주는 풀 B 항혈청과 반응하지 않을 수 있음), 또는 분리에 의해 캡슐 식의 다운 조절에 관한 것이다. 거짓 양성 반응 또는 음 '블라인드'말단 결과로 이어질 것이다 대부분의 경우에서와 같이 제조업체에서 제공 algrorithm 혈청 형을 사용하고, 또한 중요하다. 반응은 해석하기 어려운 경우 이러한 경우, 그리고, 우리는 Quellung 반응 같은 대체 방법으로 반복 테스트 및 / 또는 테스트를 권장합니다.
일부 문제는 때때로 만족 라텍스 시약을 만들기 위해 필요합니다. 여기에 설명 된 방법에서, 항체는 수동 흡착 15,19 통해 라텍스 입자에 부착되기 때문에 중요한 변수는 얼마나 잘 이용 결정 항체의 농도이고,라텍스 입자의 표면을 피복하고, 항체의 활성 부위 15,20 후속 정렬된다. 과잉 또는 불충분 한 항체를 라텍스 입자에 부착되는 경우에 결과적으로, 항체 - 항원 반응은 최적이 아닐 것이며, 불만족 15,20,21 시약을 제조 할 수있다. 항체가가 항혈청의 다른 많은 다릅니다으로, 희석 일련의 표준 잘 팔을 수행 시약을 생산하지 않을 수 있습니다. 유용한 출발점 항혈청의 1시 40분 희석을 사용하는 것이며, 이것이 성공적이지 않을 경우, 상기 항혈청을 희석한다. 우리의 경험에서 이것은 보통 문제 8 건을 해결합니다. 소수의 경우에서 시약은 대상이 분리 테스트 할 때 서스펜션의 삭제를 수반하지 않는 약한 응집을 표시 할 수 있습니다. 시약의 품질이 개선되지 않지만, 양호한 시약은 일반적으로 원심 분리를 생략하여 제조 할 수 있으며, 세척 8,22 단계 항혈청 희석 이러한 경우
항체 코팅 된 라텍스 입자는 다양한 미생물 15,20의 탐지, 식별 또는 혈청 형에 대한 진단 미생물학에서 일반적으로 사용된다. 이와 같이, 여기에 기재된 방법은 다른 목적을 위해 라텍스 시약의 제조에 적합 할 수있는, 적절한 항혈청 제공이 가능하고 적절한 QC 절차가 채택된다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
| Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to RT before use |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to RT before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to rRT before use |
| Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
| Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
| Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
| 5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
| Glycine | Merck | 10119.05 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to RT before use http://www.thermofisher.com.au |
| Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | ||
| Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
| 60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
| Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| *alternative sources are available for most materials |
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