Abstract
多巴胺能神经元代表了在大脑中的神经元的总数的不到1％。这样低的神经元的数量调节重要脑部功能，如马达控制，动机和工作记忆。黑质纹状体多巴胺能神经元的选择性退化在帕金森氏病（PD）。这种渐进的神经元损失明确的病理症状电机（运动迟缓，静止性震颤和肌强直）有关。负责任的多巴胺能神经元退变主要代理仍是未知数。然而，这些神经元似乎是在各种条件下非常脆弱。原代培养物构成的最相关的模型之一来调查性能和多巴胺能神经元的特征。这些培养物可以以阻止或减缓神经元变性提交模仿PD病理各种应激剂和神经保护性化合物。 PD的大量的转基因小鼠模型中对已根儿在过去十年中ATED进一步增加研究者对多巴胺能神经元培养物的兴趣。在这里，视频协议侧重于胚胎小鼠大脑的细腻解剖。腹侧的精确切除是至关重要的，获得神经元培养足够丰富的多巴胺能细胞，使随后的研究。此协议可实现与胚胎转基因小鼠，并适合免疫荧光染色，定量PCR，第二信使量化，或神经元死亡/存活评估。
Introduction
多巴胺，基本脑神经递质1,2中的一个，主要是释放由脑多巴胺能（DA）神经元。大多数DA能神经元位于中脑2-6的腹侧部分。概略地，中脑多巴胺神经元可在三个解剖和功能划分不同的投影系统：mesostriatal，中脑边缘和mesocortical通路2,5。黑质纹状体通路参与运动行为，中脑边缘通路在加强，动机和学习中发挥重要作用，而多巴胺能途径投射到额叶前部皮质有牵连的认知2。
多巴胺神经元参与了几个人的神经系统疾病如精神分裂症，注意力不足，过度活动症和帕金森氏病（PD）2,4。帕金森病的特点是DA能神经元的进行性和选择性变性连接黑质致密部（SNC）的纹状体。的黑质-纹状体多巴胺神经元的结果在纹状体严重多巴胺耗竭的损失，是负责对帕金森病的运动症状（运动迟缓，静止性震颤，和刚性）7。的特发性帕金森病的初始原因尚未确定与当前治疗是唯一的症状，目的是恢复的多巴胺水平在纹状体。最常用的处方药物是左旋多巴（左旋多巴），多巴胺的前体自然。尽管左旋多巴的给药补偿多巴胺在一定时间内的损耗，运动并发症后发生的长期治疗（运动障碍和开/关状态）8,9。
研究多巴胺能神经元和PD是在不断发展和正在作出巨大努力来开发基于细胞移植，基因治疗，或神经保护剂10,11治疗。然而，一个重要问题仍然是非阐明：什么是极端vulnerab的原因DA能神经元的能性？部分答案可以在DA能神经元的活性被发现。在DA能神经元的兴奋性电活动和减速似乎增加他们的倾向退化12。然而，帕金森病发病机制的复杂性，需要进一步研究，以确定神经元变性13-15参与多巴胺的机制。
小学文化，特别是有关研究多巴胺神经元的特性16-19和对神经保护剂20-24评估挑战这些神经元的各种压力。大鼠培养模型是最常用的，如大鼠胚胎中脑的解剖比较容易，比较用鼠标，以及较高量的神经元可以在大鼠中获得。然而，新一代的25病转基因小鼠模型大大提高了社区的神经学家小学文化，从鼠标26-29的兴趣。虽然文化公关从新生动物epared都可以使用，最好是它们的胚胎在有丝分裂后的阶段（E13.5的中脑的神经元）制备，当神经元都保留其分化能力。以下协议呈现在来自小鼠胚胎（E13.5），这是最困难的，制备原代培养物分离的脑的神经元。值得注意的是，我们提供了使用无血清培养基更好的重现性的协议。在培养制备物（夹层和机械解离）的两个最重要的步骤将被仔细地详述于相关联的视频。
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Protocol
在这项工作中所用的小鼠照料并符合欧盟理事会（86/609 / EU）的使用实验动物的指导方针进行处理。
1，准备所需的解决方案
- 库存解决方案
- 10X聚-L-鸟氨酸（巴解组织）溶液：称取10mg解放军氢溴酸盐（分子量= 30,000-70,000），溶于70毫升无菌水。筛选储存在-20℃下用0.2微米的针筒式过滤器，等分试样的溶液，和。
- 30％葡萄糖溶液：称取30克D（+） - 糖和无菌水溶解至100ml的总体积。过滤，分装，并储存在4℃。
- 5倍的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）/营养混合物F-12火腿：称取6克的DMEM / F-12火腿粉末和在无菌水中溶解至100ml的总体积。过滤，分装，并储存在4℃。
- 7.5％的碳酸氢钠（ 碳酸氢钠 ）Soluti于：称取7.5克的NaHCO 3和在无菌水中溶解至100ml的总体积。过滤，分装，并储存在4℃。
- 的1M HEPES溶液：称取23.8克的HEPES和在无菌水中溶解至100ml的总体积。过滤，分装，并储存在4℃。
- 70％（V / V）乙醇稀释：将70ml无水乙醇溶液用30ml无菌水。
- 磷酸盐缓冲盐水与葡萄糖和抗生素（PBS-GAB）：加入10毫升30％的葡萄糖溶液和5毫升的青霉素 - 链霉素溶液至500ml Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水中。保存在4℃。
- 灭活胎牛血清（IFBS）：解冻的牛血清一夜之间在4°C和灭活，在56℃下30分钟。等分入50ml并储存在-20℃。
- 培养基：在灭菌水中，混匀依次40毫升5×DMEM / F12-火腿，加入1ml的1M HEPES，将2ml的200mM的L-谷氨酰胺，2个ml的青霉素 - 链霉素的加入4ml的30％的葡萄糖次加入3ml 7.5％的NaHCO 3，以180 ml 的终体积。过滤并使用相同的天。
- 激素混合
- 制备180毫升培养基。溶解200mg的脱辅基转铁蛋白的这种媒介。
- 称取50毫克胰岛素的和溶解于2ml 0.1M的HCl中。加入慢慢加入8毫升无菌水混合的同时轻轻地。稀释此溶液在培养基中。
- 称取19.3毫克腐胺二盐酸盐和溶解在10ml的无菌水。加入10 ml溶液的激素组合。
- 制备在无菌水中的3mM的亚硒酸钠溶液并在无水乙醇中的2mM的孕酮溶液。加入20μl每个解决方案的激素组合。
- 过滤激素混合，分装到10ml，并储存在-20℃。
2，准备培养板和仪器
- 培养皿中的FBS涂层：先解剖当天，准备180毫升培养基。加入10毫升IFBS到90毫升培养介质中。加入300μl/孔的培养基/ 10％IFBS到聚-D-赖氨酸预涂布的24孔板。孵育过夜，在37℃。在4℃下储存剩余的介质（有或无IFBS）。
- 消毒器械和巴氏吸管。聚集在材料表中列出，以及一个II级层流罩和CO 2培养箱设备。
3，解剖小鼠中脑的
- （根据机构的指导方针）牺牲一个E13.5孕鼠。清洁鼠标，用70％乙醇的腹部和打开腹部壁。收集的子宫角，用细腻的剪刀打开它们，从子宫角解剖每个胚胎，取出羊膜。将胚胎在含有无菌PBS-GAB 100毫米的培养皿中，用血管钳在连续3个相同的浴用转移把它们洗干净。对于剥离，将胚胎由3 60mm的无菌培养皿中。
- MOVË在体视显微镜下最后的培养皿中。不要杀头的胚胎。使用Vannas剪刀，切除大脑。
- 小心地取出并丢弃fore-和后脑区域。以喙侧，切断靠近丘脑区域，以尾侧切口在峡部区域，除去上丘。
- 一旦中脑腹侧被隔离，小心地取出使用的超精细镊子脑膜。收集解剖段，无脑膜，在无菌13毫升套管内填充的PBS-GAB。
- 清洁管彻底含有mesencephala用70％乙醇，并把它罩下。
4，细胞分离
- 洗mesencephala 3倍用无菌PBS-GAB。让大脑碎片每次冲洗之间解决，避免破坏组织。最后一次洗涤后，在3毫升胰蛋白酶/ EDTA的15分钟的仔细去除尽可能多的解决方案，尽可能孵育脑段，在37℃CO 2的培养箱中培养。
- 火抛光的巴斯德吸液管以最大化神经元作为非抛光的玻璃移液管的端部的存活是锋利的，并且可以在解离步骤，损伤细胞。稍微减轻肢体的直径（最大0.5mm）的巴斯德吸管，而火抛光的。
- 小心除去尽可能多的胰蛋白酶/ EDTA溶液尽可能和加入10 ml培养基/ 10％IFBS。洗脑段与3倍的培养基/ 10％IFBS。
- 用火抛光的巴斯德吸液管，开始在6ml培养基/ 10％IFBS的mesencephala的离解。磨碎10X（避免产生气泡），使块定居，然后收集在一个新的无菌13毫升管中。
- 加入6毫升培养介质中，重复前面的步骤一次，并收集含有解离的细胞在相同13毫升管的平台。
- 离心细胞，在160 g下5分钟。弃上清，悬浮细胞培养液中添加了10％的激素组合。
5，细胞接种
- 计数细胞悬液中Malassez细胞和调节介质的体积的60万个细胞/ ml的浓度。周围1700000细胞可以从一个小鼠中脑获得。
- 除去含FBS的涂覆介质从24孔板中，并添加于各孔的1 ml的细胞悬浮液（600,000个细胞/孔，TH +细胞的2-4％）。
- 孵育板在37℃和5％CO 2/95％空气。无介质的改变是必要的。多巴胺能神经元后， 在体外各地5-7天（多巴胺转运体的表达相一致）的成熟。保持文化的长达15天不更换培养基细胞。
6，免疫荧光协议
- 盖玻片清洗
- 解剖前一天，加入10毫升1 M盐酸到培养皿中。放置在所述液体12-15盖玻片的表面上，等待15分钟。
- 沉封面潜入该液体，然后等待15分钟。
- 除去HCl和水洗涤3次。
- 一次，用纯乙醇快速洗涤盖玻片，然后加入纯乙醇的培养皿，并等待30分钟。
- 引擎盖下，从乙醇中取出清洁的盖玻片上，并加入用无菌镊子12孔细胞培养板中的1盖玻片每孔。
- 冲洗用无菌水（1ml /孔）盖玻片两次。然后，用无菌PBS洗涤一次它们。
- 盖玻片的涂布
- 除去PBS中，加入500μl/ 2倍巴解组织以及（PBS稀释）。孵育4小时，在37℃下在CO 2培养箱中培养。
- 删除巴解组织溶液和洗涤3次，用无菌的PBS。
- 除去PBS，加入500微升/孔的20％IFBS / 1克/毫升的层粘连蛋白。在CO 2培养箱中孵育过夜，在37℃。
- 电镀的细胞免疫
- 从12孔板中除去涂层介质。
- 添加900,000个细胞/孔的2ml体积，并在培养箱中生长的细胞中，在37℃。细胞可以保持在培养最多15天而不更换培养基。
- 免疫组化
- 从12孔板中除去培养基，并用500微升/孔的DMEM预热至37℃。
- 加入500μl/孔的DMEM中预热至37℃，再加入微升轻轻160 /孔8％多聚甲醛（PFA，2％的最终浓度），并孵育10分钟，在37℃。
- 除去PFA，洗3次，用PBS / 0.1M甘氨酸10分钟。
- 除去PBS，加入300微升/孔的PBS / 0.05％的Triton X-100/20％山羊血清和温育30分钟，在室温下进行。
- 除去培养基，加入300微升/孔的在PBS中稀释的第一抗体/ 0.05％的Triton X-100/1％山羊血清孵育2小时，在室温下进行。可用于多巴胺能神经元和培养特性的检测初级抗体被显示在材料表中。保持1以及无第一抗体，以评估不同的第二抗体的背景。
- 除去培养基洗3次，用PBS / 0.2％明胶的10分钟。
- 除去培养基，加入300微升/孔的在PBS中稀释的二级抗体/ 0.05％的Triton X-100/1％山羊血清孵育1小时，在室温下，在黑暗中。使用的二级抗体中注明的材料表中。
- 除去培养基洗3次，用PBS / 0.2％明胶的10分钟。
- 除去培养基，用PBS洗3次。
- 装在载玻片上的细胞一侧的盖玻片下来一滴的Vectashield的。保持载玻片在室温下过夜，以让该安装介质干燥，然后将它们存储在4℃。
- 掌握用共聚焦显微镜或装备表面荧光相差显微镜图像。被收购与徕卡SP2的紫外激光共聚焦显微镜的代表图像。
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Representative Results
的中脑培养步骤的图示流程图如图1所示。简言之，从怀孕的瑞士小鼠收集E13.5胚胎后，腹侧被从整个胚胎解剖。在分离脑片段依次提交酶促消化和机械解离。解离的细胞，通过离心沉淀，重新悬浮在培养基中，并接种在预先包被12或24孔板中。将细胞保持15天不更换培养基。
腹侧中脑解剖的详细流程图，对应于步骤3.2中，示于图2。虚线红色线条表示在E13.5小鼠大脑的示意性表示的3个主要的切割线（改编自Prestoz 等人 30），并切割步骤示。
培养后在维生素 1,4，和7天的相位对比图像RO（DIV）示于图3。神经元快速开发扩展和发芽（ 图3A）。分支与分支更扩展为DIV4和DIV7（ 图3B-3C）。
多巴胺能神经元是由免疫细胞化学染色用抗TH抗体（ 图4A）进行检测。 TH +细胞的数目每2.5cm 2的盖玻片（ 图4B）被表达。我们不表达TH +细胞的数目每以及细胞的密度是在涂覆塑料的边界以及比上涂覆的玻璃盖玻片高得多，即在中心的孔中。多巴胺神经元（TH +细胞）代表在盖玻片整个细胞群体的2-4％。 TH阳性（TH +）细胞早在DIV1出现，其数量迅速增加，在DIV6达到最大值。
细胞的相对比例是由DA细胞机智免疫荧光标记评估ħ抗-DAT抗体（ 图5A）或抗TH抗体（ 图5B）和神经元细胞的伴随染色用抗MAP2抗体。存在于培养几个神经元群体的代表性免疫染色也示于图5。GABA能神经元所使用的抗GAD67抗体（ 图5C）染色，并代表约50％的细胞。血清素能神经元中检测到与抗血清素的抗体（ 图5D）和表示所述细胞培养物中的小于1％。中脑细胞培养物中还含有谷氨酸能神经元（在培养的40％），胆碱神经元，和罕见的神经胶质细胞（约2-3％）。神经胶质细胞的比例是使用胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）染色（ 图5E）来确定。也可以使用特定的标记，如PITX3或Foxa2的部分31,32来实现的明确识别中脑多巴胺能神经元。
存在于培养几个神经元群体的更高放大倍数的免疫染色显示在图6。使用抗-DAT抗体（ 图6A）检测多巴胺能神经元。 DAT染色反映多巴胺神经元的成熟状态。 DAT表达始于DIV3-4。 GABA能神经元和血清素能神经元是使用抗GAD67抗体（ 图6B）或抗血清素的抗体（ 图6C）染色，分别。
图1所示流程中脑培养的图表。主培养步骤说明：（A）牺牲一个怀孕的瑞士小鼠，收集培养皿E13.5胚胎，通过连续的PBS浴室冲洗。（BC）在解剖显微镜，Dissect腹从整个胚胎中脑，并将其放置在管（D）添加胰蛋白酶-EDTA的大脑解剖片段和消化，在37°C下15分钟（E）删除胰蛋白酶，加 入含血清培养基和执行机械细胞分离（10研磨动作，重复两次）。（F）的沉淀的细胞，它们悬浮在补充激素无血清培养基和板块他们预涂12或24孔板。 请点击这里查看大图这个数字。
图2详细流程的脑解剖图。主要解剖步骤说明：（A）小鼠胚胎的再后E13.5MOVAL从子宫角（B）在不斩首的胚胎，切除大脑（C）小鼠胚胎的大脑在E13.5示意图。红色虚线表示，其中大脑应该削减隔离腹侧（R，喙剪，C，切尾，D，背切）。头侧端脑泡，间脑，中脑和菱脑被分隔为蓝色，紫色，粉红色和灰色，分别为。 AQ，渡槽; Hypoth，下丘脑; LG电子，侧神经节隆起; LV，侧脑室; MFB，内侧前脑束;梅兰日兰，内侧神经节隆起; SC，上丘;塔尔，丘脑;虚拟机，腹侧; 4V，第四脑室（改编自30），（D）切割线表示用红色虚线上的E13.5小鼠大脑。（五）小鼠大脑切除fore-和后脑区域后（ 即后切R）。去除SUP后（F）的小鼠大脑erior丘（ 即后削减的R＆D）（G）腹孤立脑的观点（ 即削减后的R，C，D）。 请点击这里查看该图的放大版本。
图中文化的不同发展阶段三相位对比图像。 （一）DIV1，（B）DIV4，和相同的文化（三）DIV7图像显示。活细胞倒置显微镜获得的图像。 请点击这里查看该图的放大版本。
多巴胺能神经元的图4中酪氨酸羟化酶染色。 （a）在DIV8，使用抗TH抗体检测DA能神经元。使用3,3'-二氨基联苯胺（DAB）试剂盒进行启示。该图像被收购与倒置显微镜。TH +神经元（B）号在脑文化作为文化的时代的功能。 请点击这里查看该图的放大版本。
使用抗DAT（A）或抗T检测神经元和星形胶质细胞的培养图5代表的比例。在DIV4，DA能神经元（洋红色）ħ抗体（B）和GABA能神经元，血清素能神经元和星形胶质细胞（在品红色）用抗GAD67（C），抗血清素（D）和抗-GFAP（E）的抗体，分别检测到。神经元细胞（青色）进行染色，用抗MAP2抗体（AE）。图像获取与倒置显微镜， 请点击这里查看这个数字的放大版本。
图中脑培养几个细胞群的代表性的染色。在DIV9由DAT染色检测（红色）（A）的多巴胺能神经元（B）在DIV9通过可视化的GAD-67染色GABA能神经元（绿色）。
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Discussion
这个协议提出必要从胚胎小鼠和免疫荧光法检测多巴胺能神经元的制备中脑的神经元的原代培养物的方法和试剂。关键步骤的程序是在胚胎的清扫和收集的脑碎片的机械解离。高品质的解剖工具，有助于掌握解剖技术。 DA能神经元构成脑的一小部分。因此，收集的腹侧中脑的右侧部分是必不可少的，以获得含有多巴胺神经元的2-4％的培养。机械解离应仔细并轻轻进行。如果文化包含集群的非游离神经元，加一两个研磨步骤。
该协议使用用于神经元培养的无血清培养基。然而，与血清涂覆有必要提高附着的细胞。激素组合，它取代了SER嗯，被定义为允许神经元生长，并减少神经胶质细胞的存活和增殖。因此，非神经元细胞约占2-3％的培养物（定量用GFAP染色）。备选地，培养物可以在血清中与另外的存在下生长，播种后2天，胞嘧啶-β-D-阿拉伯呋喃糖苷（阿糖胞苷，5-8μM）来抑制神经胶质细胞26的扩散。另一种替代激素的搭配是使用定义的媒体和补充29。
该技术是适合于进行免疫荧光染色，定量PCR，第二信使量化和各种类型的毒理学/存活的屏幕。它也应当能够进行电生理研究这些制剂33,34。这些培养物可以识别预先候补神经保护分子和帮助表征多巴胺神经元的属性，同时最小化所使用的动物数量。但是，网络连接利用活体模型最终确认要求，如培养的神经元没有收到来自其他脑区，这可能严重影响其成熟的投入。
这种技术没有得到广泛应用，与大鼠文化机型相比，虽然在八十年代初16,17它的第一个说明。图像呈现细腻解剖的缺乏可能限制研究人员开发这款鼠标的养殖模式。然而，由于神经变性疾病25与特定基因的无效或特定的神经元类型的标签的许多转基因小鼠模型的生成，从小鼠多巴胺神经元培养现在的极大兴趣。
掌握这种技术允许DA能神经元的任何类型的转基因小鼠中分离的研究和探讨诱导基因修饰的扰动。此外，这些培养物可被用作参考模型可以用来自小鼠干衍生的多巴胺神经元相比细胞35或从诱导的多能干细胞36。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
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