Abstract
Neurónios dopaminérgicos representam menos de 1% do número total de neurónios no cérebro. Esta baixa quantidade de neurônios regula funções importantes do cérebro, como controle motor, motivação e memória de trabalho. Neurônios dopaminérgicos nigrostriatal degenerar seletivamente na doença de Parkinson (DP). Esta perda neuronal progressiva é inequivocamente associado aos motores sintomas da patologia (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez muscular e). O principal agente responsável dos neurônios dopaminérgicos degeneração ainda é desconhecida. No entanto, esses neurônios parecem ser extremamente vulneráveis em diversas condições. As culturas primárias constitui um dos modelos mais relevantes para investigar as propriedades e características de neurónios dopaminérgicos. Estas culturas podem ser submetidos a vários agentes estressores que imitam PD patologia e compostos neuroprotetores, a fim de parar ou abrandar a degeneração neuronal. Os inúmeros modelos de camundongos transgênicos do PD que foram generciados durante a última década aumentou ainda mais o interesse dos pesquisadores para as culturas de neurónios dopaminérgicos. Aqui, o protocolo de vídeo concentra-se na dissecação delicada de cérebros embrionárias de rato. Excisão precisa do mesencéfalo ventral é crucial para obter culturas neuronais suficientemente ricos em células dopaminérgicas para permitir estudos posteriores. Este protocolo pode ser realizado com camundongos transgênicos embrionárias e é adequado para imunofluorescência, PCR quantitativo, segundo quantificação mensageiro, ou avaliação morte / sobrevivência neuronal.
Introduction
A dopamina, um dos neurotransmissores cerebrais essenciais 1,2, é libertada principalmente por dopaminérgicos do mesencéfalo (AD) neurónios. A maioria dos neurónios DA residir na parte ventral do mesencéfalo 2-6. Esquematicamente, neurônios DA mesencéfalo podem ser divididos em três sistemas distintos de projeção anatômica e funcionalmente: mesostriatal, mesolímbico, e caminhos mesocorticais 2,5. A via nigroestriatal está envolvida no comportamento do motor, as vias mesolímbica desempenhar um papel importante no reforço, a motivação, aprendizagem e, ao passo que as vias dopaminérgicas que se projectam para o córtex pré-frontal estão implicados na cognição 2.
Neurônios DA estão envolvidos em diversas doenças neurológicas humanas, como a esquizofrenia, déficit de atenção, transtorno de hiperatividade, e doença de Parkinson (DP) de 2,4. A DP é caracterizada por uma degeneração progressiva e selectiva dos neurónios DA ligar substantia nigrapars compacta (SNC) para o estriado. A perda de Nigro-estriatal da neurônios resulta na depleção de dopamina no corpo estriado grave que é responsável de os sintomas motores da DP (bradicinesia, tremor de repouso, rigidez e) 7. A causa inicial da DP idiopática não foi estabelecida e os tratamentos atuais são apenas sintomático, com o objetivo de restaurar o nível de dopamina no corpo estriado. A droga mais prescrita é L-Dopa (Levodopa), o precursor natural da dopamina. Embora a administração de Levodopa compensa a perda de dopamina por um certo tempo, complicações motoras ocorrer após tratamentos de longa duração (discinesia e liga / desliga estados) 8,9.
Pesquisa sobre neurônios dopaminérgicos e PD está em progressão constante e estão sendo feitos intensos esforços para desenvolver tratamentos baseados em transplante de células, a terapia gênica, ou agentes neuroprotetores 10,11. No entanto, um grande problema permanece não elucidado: o que é a causa da extrema vulnerability de neurônios DA? Parte da resposta pode ser encontrada na actividade dos neurónios DA. A redução da atividade elétrica e da excitabilidade dos neurônios de DA parece aumentar sua propensão a se degenerar 12. No entanto, a complexidade do PD patogênese requer mais estudos para identificar os mecanismos envolvidos na degeneração de neurônios DA 13-15.
As culturas primárias são especialmente relevantes para estudar propriedades DA neurônio 16-19 e desafiar esses neurônios para várias tensões para avaliação de agentes neuroprotetores 20-24. Modelos de rato de cultura são os mais frequentemente utilizados, como a dissecação do mesencéfalo de embriões de rato é mais fácil, em comparação com o rato, e maiores quantidades de neurónios podem ser obtidos na ratazana. No entanto, a geração de modelos transgênicos da doença 25 aumentou consideravelmente o interesse da comunidade neurocientista para culturas primárias do rato 26-29. Embora a cultura da prepared de animais recém-nascidos podem ser utilizados, é preferível prepará-los a partir de embriões na fase de pós-mitótico (E13.5 mesencéfalo de neurónios), quando os neurónios mantiveram a sua capacidade de se diferenciar. O protocolo a seguir apresenta os neurónios do mesencéfalo isoladas em cultura primária a partir de embriões de rato (E13.5), as quais são as mais difíceis de preparar. Nomeadamente, é proporcionado um protocolo utilizando meio de cultura isento de soro para uma melhor reprodutibilidade. As duas etapas mais críticas na preparação cultura (dissecção e dissociação mecânica) será cuidadosamente detalhado no vídeo associado.
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Protocol
Os ratos utilizados neste trabalho foram atendidas e tratadas de acordo com as diretrizes do Conselho da União Europeia (86/609 / UE) para o uso de animais de laboratório.
1 Preparação de soluções necessárias
- Soluções de Stock
- 10x de poli-L-ornitina (PLO) Solução: pesam-se 10 mg de bromidrato de PLO (peso molecular = 30,000-70,000) e dissolver em 70 ml de água estéril. Filtra-se a solução com uma seringa de filtro de 0,2 um, alíquota, e armazenar a -20 ° C.
- 30% Solução de Glucose: pesam-se 30 g de D (+) - glicose e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
- Meio de Eagle Modificado de 5x Dulbecco (DMEM) / Mistura nutriente F-12 de Ham: pesam-se 6 g de DMEM / Ham F-12 em pó e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
- 7,5% de Bicarbonato de Sódio (NaHCO3) Solutiem: pesam-se 7,5 g de NaHCO 3 e dissolve-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
- Solução 1 M de HEPES: Pesar 23,8 g de HEPES e dissolvem-se em água estéril para um volume total de 100 ml. Filter, alíquota, e armazenar a 4 ° C.
- 70% (v / v) de etanol: Diluir 70 ml de etanol absoluto, com 30 ml de água estéril.
- Salina tamponada com fosfato com glicose e antibióticos (PBS-GAB): adicionar 10 ml de solução de glucose a 30% e 5 ml de solução de penicilina-estreptomicina a 500 ml de fosfato de Dulbecco tamponado salino. Armazenar a 4 ° C.
- De soro fetal bovino inactivado (ifbs): Descongelar soro bovino durante a noite a 4 ° C e inactiva a 56 ° C durante 30 min. Alíquota em 50 ml e armazenar a -20 ° C.
- Meio de Cultura: Em água estéril, misturar sucessivamente 40 mL de 5x DMEM / Ham F12-, 1 ml de HEPES 1 M, 2 ml de 200 mM de L-glutamina, 2 ml de penicilina-estreptomicina, 4 ml de 30% de glicose umaº 3 ml de 7,5% de NaHCO 3 para um volume final de 180 ml. Filtra-se e usar o mesmo dia.
- Hormônio Mix
- Preparar 180 ml de meio de cultura. Dissolve-se 200 mg de apo-transferrina neste meio.
- Pesar 50 mg de insulina e dissolver em 2 ml de 0,1 M de HCl. Adicionar lentamente 8 ml de água estéril, enquanto se mistura com cuidado. Dilui-se esta solução no meio de cultura.
- Pesar 19,3 mg de dicloridrato de putrescina e dissolver em 10 ml de água estéril. Adicionar a solução de 10 ml à mistura de hormona.
- Prepara-se uma solução de selenito de sódio 3 mM em água estéril e uma solução 2 mM de progesterona em etanol absoluto. Adicionar 20 mL de cada solução para o mix de hormônios.
- Filtrar a mistura hormonal, alíquota em 10 ml e armazenar a -20 ° C.
2 Preparação de Pratos e Instrumentos Cultura
- FBS revestimento das placas de cultura: O dia antes da dissecção, preparar 180 ml de meio de cultura. Adicionar 10 ml deifbs para 90 ml de meio de cultura. Adicionar 300 ul / poço de meio de cultura / 10% ifbs em pré-revestidas placas de 24 poços com poli-D-lisina. Incubar durante a noite a 37 ° C. Armazene a mídia restante (com e sem OIF) a 4 ° C.
- Esterilizar os instrumentos e pipetas Pasteur. Reúna os equipamentos listados na tabela de materiais, bem como uma capa de Classe II de fluxo laminar e uma incubadora de CO 2.
3. Dissection of Mouse Mesencéfalo
- Sacrifique um rato grávida E13.5 (de acordo com as diretrizes institucionais). Limpe o abdômen do mouse com etanol 70% e abrir a parede abdominal. Recolha os cornos uterinos, abri-los usando uma tesoura delicada, dissecar cada embrião dos cornos uterinos, e remover as membranas amnióticas. Coloque os embriões em uma placa de Petri 100 milímetros contendo PBS estéril-GAB e lavá-los por transferência em 3 sucessivos banhos idênticos usando uma pinça. Para dissecção, coloque os embriões por 3 em um 60 milímetros placa de Petri estéril.
- MovÊ O prato final Petri sob o microscópio estereoscópico. Não decapitar os embriões. Com uma tesoura Vannas, extirpar os cérebros.
- Cuidadosamente retire e descarte as regiões das letras e do rombencéfalo. Para o lado rostral, cortada perto do tálamo, para o corte lateral caudal na região do istmo, remover o colículo superior.
- Uma vez que o mesencéfalo ventral é isolado, retire cuidadosamente meninges usando uma pinça ultrafinas. Recolher os segmentos dissecados, sem as meninges, em um tubo estéril 13 ml cheio de PBS-GAB.
- Limpe o tubo contendo o mesencephala exaustivamente com etanol 70% e trazê-lo sob o capô.
A dissociação 4. celular
- Lavar mesencephala 3x com PBS estéril-GAB. Permitir fragmentos do cérebro para resolver entre cada lavagem e evitar a ruptura do tecido. Após a última lavagem, retirar cuidadosamente, tanto quanto possível solução e incubar segmentos cerebrais em 3 ml de tripsina / EDTA durante 15 minutos a 37 ° C numaIncubadora de CO 2.
- -Polonês fogo as pipetas de Pasteur para maximizar a sobrevivência dos neurónios como a extremidade de uma pipeta de vidro não polido é afiado e pode danificar as células, durante os passos de dissociação. Reduzir ligeiramente o diâmetro da extremidade (+ 0,5 mm) da pipeta de Pasteur, enquanto fogo polimento-lo.
- Remova cuidadosamente tanta solução / EDTA tripsina possível e adicionar 10 ml de meio de cultura / 10% OIF. Segmentos cerebrais Lavar 3x com meio de cultura / 10% OIF.
- Utilizando a pipeta de Pasteur polida ao fogo, começam a dissociação de mesencephala em 6 ml de meio de cultura / 10% ifbs. Triturar 10x (evitar bolhas de ar), deixe os pedaços para resolver, em seguida, recolher o meio em um novo tubo estéril 13 ml.
- Adicionar 6 ml de meio de cultura, repetir o passo anterior, uma vez e recolher o meio contendo células dissociadas no mesmo tubo de 13 ml.
- Centrifugar células a 160 g por 5 min. Descartar o sobrenadante e ressuspender as células em meio de cultura suplementado com10% de mistura de hormônio.
5. celular chapeamento
- Contar as células em suspensão numa célula de Malassez e ajustar o volume do meio a uma concentração de 600.000 células / ml. Cerca de 1,7 milhões de células podem ser obtidas a partir de um mesencéfalo do rato.
- Remover FBS contendo meio de revestimento de placas de 24 cavidades e adicionar a cada cavidade 1 ml da suspensão de células (600.000 células / poço, 2-4% das células TH +).
- Incubar a placa a 37 ° C e 5% de CO 2/95% ar. Nenhuma mudança de meio é necessário. Neurônios dopaminérgicos estão maduros depois de cerca de 5-7 dias in vitro (expressão consistente do transportador de dopamina). Manter as células em cultura até 15 dias sem substituição médio.
6. Imunofluorescência Protocolo
- A limpeza das Lamelas
- O dia antes da dissecação, adicionar 10 ml de HCl 1 M em uma placa de Petri. Colocar a superfície dos líquidos 12-15 lamelas de vidro e esperar 15 minutos.
- Afundar a tampaescorregar para o líquido e esperar 15 min.
- Remover HCl e lavar 3x com água.
- Lavam-se as lamelas com etanol puro rapidamente uma vez, em seguida, adicionar etanol puro para o prato e para aguardar 30 minutos.
- Sob o capô, remova lamelas limpas a partir de etanol e adicionar uma lamela por poço de 12 poços da placa de cultura de células usando uma pinça esterilizada.
- Lavar lamelas duas vezes com água estéril (1 ml / poço). Em seguida, lavá-los uma vez com PBS estéril.
- Revestimento das Lamelas
- Remover PBS e adicionar 500 uL / poço de 2x PLO (diluído em PBS). Incuba-se durante 4 horas a 37 ° C na incubadora de CO 2.
- Remover a solução de PLO e lavar 3x com PBS estéril.
- Remover PBS e adicionar 500 uL / poço de 20% ifbs / 1 g / ml de laminina. Incubar durante a noite a 37 ° C na incubadora de CO 2.
- Plaqueamento das células de Imunofluorescência
- Remover o meio de revestimento a partir de placas de 12 poços.
- Adicionar 900,000 células / cavidade em 2 ml de volume e crescer as células a 37 ° C na incubadora. As células podem ser mantidas em cultura 15 dias sem substituição médio.
- Imunocoloração
- Remover o meio de placas de 12 poços e lava-se com 500 ul / poço de DMEM pré-aquecido a 37 ° C.
- Adicione 500 ^ l / poço de DMEM pré-aquecido a 37 ° C, em seguida, adicionar cuidadosamente 160 ul / poço de 8% de paraformaldeído (PFA, 2% de concentração final) e incubar durante 10 min a 37 ° C.
- Remover PFA e lavar 3x com PBS / 0,1 M de glicina durante 10 min.
- Remover PBS, adicionam-se 300 ul / poço de PBS / 0,05% de Triton X-100/20% de soro de cabra e incubar durante 30 min à temperatura ambiente.
- Remover o meio, adicionam-se 300 ul / poço de anticorpo primário diluído em PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de soro de cabra e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Os anticorpos primários que podem ser utilizados para a detecção de neurónios dopaminérgicos e caracterização da cultura estão indicados na tabela Materiais. Mantenha1 bem sem anticorpo primário para avaliar a base dos diferentes anticorpos secundários.
- Remover o meio e lava-se 3x com PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
- Remover o meio, adicionam-se 300 ul / poço de anticorpo secundário diluído em PBS / 0,05% de Triton X-100/1% de soro de cabra e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente, no escuro. Anticorpos secundários utilizados são indicados na tabela de Materiais.
- Remover o meio e lava-se 3x com PBS / 0,2% de gelatina durante 10 minutos.
- Remover o meio e lava-se 3x com PBS.
- Montar as lamelas do lado vidro desliza célula para baixo em uma gota de Vectashield. Mantenha as lâminas à temperatura ambiente durante a noite para deixar a montagem meio seco, em seguida, armazená-los, a 4 ° C.
- Adquirir imagens usando um microscópio confocal ou um microscópio de contraste de fase equipado para epifluorescência. Imagens representativas foram adquiridos com um microscópio confocal Leica SP2 UV.
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Representative Results
Um fluxograma que ilustra os passos de cultura de mesencéfalo é mostrado na Figura 1. Resumidamente, após a recolha de embriões a partir de um rato E13.5 Swiss grávida, mesencéfalo ventral é dissecado a partir de todo o embrião. Os fragmentos isolados do cérebro são submetidos sucessivamente a digestão enzimática e dissociação mecânica. As células dissociadas foram sedimentadas por centrifugação, ressuspensas em meio de cultura e semeados em placas de 12 ou de 24 poços pré-revestidos. As células são mantidas até 15 dias sem substituição médio.
Um diagrama de fluxo detalhado da dissecação do mesencéfalo ventral, correspondente ao passo 3.2, é mostrada na Figura 2. Linhas vermelhas tracejadas indicam os três principais linhas de corte sobre uma representação esquemática de E13.5 cérebro do rato (adaptado de Prestoz et al. 30) e etapas de corte encontram-se ilustrados.
Imagens de contraste de fase da cultura após 1, 4 e 7 dias em vitro (DIV) são mostrados na Figura 3. Neurons desenvolver rapidamente extensões e germinados (Figura 3A). Desvios e ramificações são mais prolongado em DIV4 e DIV7 (Figuras 3B-3C).
Neurónios dopaminérgicos são detectados por imunocitoquímica utilizando um anticorpo anti-TH (Figura 4A). O número de células TH + é expressa por 2,5 centímetros lamela 2 (Figura 4B). Nós não expressam o número de células TH + por poço, como a densidade de células é muito maior sobre as bordas do plástico revestido bem que a lamela de vidro revestido, que fica no centro do poço. Neurónios DA (células TH +) representam 2-4% da população de células inteiras na lamela. TH-positivos células (TH +) aparecer logo div1 e seu número aumenta rapidamente até atingir um máximo em DIV6.
A proporção relativa de células é avaliada por imunofluorescência de células DA sagacidadeh um anticorpo anti-DAT (Figura 5A) ou um anticorpo anti-TH (Figura 5B) e coloração concomitante de células neuronais, com o anticorpo anti-MAP2. Imunocoloração representativas de várias populações neuronais presentes na cultura é também mostrada na Figura 5. Neurónios GABAérgicos são coradas, utilizando um anticorpo anti-GAD67 (Figura 5C) e representam cerca de 50% das células. Neurónios serotoninérgicos são detectados com um anticorpo anti-serotonina (Figura 5D) e representam menos de 1% das células na cultura. A cultura de células de mesencéfalo também contém neurónios glutamatérgicos (40%) da cultura, os neurónios colinérgicos, e células gliais rara (cerca de 2-3%). Proporção de células de glia é determinada usando proteína glial fibrilar ácida (GFAP) coloração (Figura 5E). Uma identificação inequívoca dos neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo, também pode ser conseguida utilizando marcadores específicos tais como Pitx3 ou Foxa2 31,32.
Superior imunocoloração ampliação de várias populações neuronais presentes na cultura, estão indicadas na Figura 6. Neurónios dopaminérgicos são detectados utilizando um anticorpo anti-DAT (Figura 6A). Coloração DAT reflete DA estado de maturação dos neurônios. DAT expressão começa às DIV3-4. Neurónios GABAérgicos e neurónios serotoninérgicos são coradas, utilizando um anticorpo anti-GAD67 (Figura 6B) ou um anticorpo anti-serotonina (Figura 6C), respectivamente.
Figura 1 Ilustrado fluxograma da cultura mesencéfalo. Principais etapas de cultura são indicados. (A) Sacrifique um rato Swiss grávida, coletar embriões E13.5 em placas de Petri e lavá-los por sucessivos banhos de PBS. (BC) Sob o microscópio de dissecação, dissect mesencéfalo ventral de embriões inteiros e coloque-os num tubo (D). Adicionar tripsina-EDTA para os fragmentos cerebrais dissecados e digestão a 37 ° C durante 15 minutos (E). remover a tripsina, adicionar soro contendo meio de cultura e executar dissociação celular mecânica (10 movimentos trituração, repetido duas vezes). (F) Agregar a célula, ressuspender-los em meio livre de soro suplementado com hormônios e placa-los em pré-revestidas de 12 ou 24 poços placas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura gráfico 2 fluxo detalhado da dissecção mesencéfalo. Passos dissecção principais são indicados. (A) mouse embrião E13.5 após removal dos cornos uterinos. (B) Sem decapitando o embrião, extirpar o cérebro. (C) Representação esquemática do cérebro embrionário do mouse em E13.5. Red linhas tracejadas indicam onde o cérebro deve ser cortada para isolar mesencéfalo ventral (R, corte rostral; C, corte de caudal; D, corte dorsal). O vesículas cefálicas telencéfalo, diencéfalo, mesencéfalo e rombencéfalo são delimitados em azul, roxo, rosa e cinza, respectivamente. Aq, aqueduto; Hipótese, no hipotálamo; LGE, eminência ganglionar lateral; LV ventrículo lateral; MFB, pacote prosencéfalo medial; MGE, eminência ganglionar medial; sc, colículo superior; Thal, tálamo; VM, mesencéfalo ventral; 4V, quarto ventrículo (adaptado de 30). (D) as linhas de corte são indicados por linhas quebradas vermelhas em um cérebro E13.5 mouse. (E) Rato cérebro após a remoção das regiões das letras e do rombencéfalo (ou seja, após o corte R). (F) Rato cérebro após a remoção do superior colliculus (ou seja, após cortes de R e D). (G) Vista ventral de um mesencéfalo isolado (ou seja, depois corta R, C, D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. imagens de contraste de fase da cultura em diferentes fases de desenvolvimento. (A) div1, (B) DIV4, e imagens (C) DIV7 da mesma cultura são mostrados. As imagens foram adquiridas em células vivas com um microscópio invertido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. tirosina hidroxilase coloração de neurónios dopaminérgicos. (A) Em Div8, neurónios DA foram detectados usando o anticorpo anti-TH. Revelação foi realizada usando um kit de 3,3 '-diaminobenzidina (DAB). A imagem foi obtida com um microscópio invertido. (B) Número de neurónios TH + em culturas mesencéfalo em função da idade da cultura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 proporção Representante de neurónios e astrócitos em cultura. Ao DIV4, neurônios DA (em magenta) foram detectadas utilizando anti-DAT (A) ou anti-TAnticorpo H (B) e os neurónios GABAérgicos, neurónios serotonérgicos e astrócitos (em magenta) foram detectados utilizando anticorpos anti-GFAP (E) anti-GAD67 (C), anti-serotonina (D), e, respectivamente. Células neuronais (em ciano) foram coradas com um anticorpo anti-MAP2 (AE). As imagens foram adquiridas com um microscópio invertido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 coloração representativas de várias populações de células de cultura mesencéfalo. Neurônio (A) dopaminérgicos detectado por coloração DAT em DIV9 (em vermelho). (B) neurônios GABAérgicos visualizadas pelo GAD-67 coloração em DIV9 (em verde).
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Discussion
Este protocolo apresenta os procedimentos e reagentes necessários para a preparação de uma cultura primária de neurónios do mesencéfalo do rato embrionário e o procedimento para a detecção de imunofluorescência neurónios dopaminérgicos. As etapas críticas do processo são a dissecção dos embriões ea dissociação mecânica dos fragmentos cerebrais coletados. Instrumentos de dissecção de alta qualidade ajuda a dominar a técnica de dissecação. Neurónios DA constituem uma pequena percentagem do mesencéfalo. Assim, a recolha da parte direita do mesencéfalo ventral é essencial para obter uma cultura que contém 2-4% de neurónios DA. Dissociação mecânica deve ser realizada com cuidado e delicadeza. Se a cultura contém aglomerados de neurônios não-dissociada, adicionar mais um ou dois passos trituração.
Este protocolo utiliza meio isento de soro para a cultura de neurónios. No entanto, o revestimento com soro é necessário para melhorar a fixação das células. Mix de hormônios, que substitui o Serhum, é definido para permitir o crescimento de neurónios e células gliais para minimizar a sobrevivência e proliferação. Consequentemente, as células não-neuronais representar cerca de 2-3% da cultura (quantificação usando coloração GFAP). Em alternativa, as culturas podem ser cultivadas na presença de soro com adição, de dois dias depois da sementeira, de citosina-β-D-arabinofuranósido (ara-C, 5-8 mM) para suprimir a proliferação de células gliais 26. Outra alternativa para a combinação hormonal é o uso de meios definidos e suplementos 29.
Esta técnica é adequada para realizar imunofluorescência, PCR quantitativo, segundo quantificação mensageiro e vários tipos de telas de toxicologia / sobrevivência. Também deve ser possível a realização de estudos eletrofisiológicos sobre essas preparações 33,34. Essas culturas podem identificar moléculas neuroprotectores pré-candidatas e ajudam a caracterizar as propriedades DA neurónios, enquanto minimiza o número de animais utilizados. No entanto, ficonfirmação nal com modelos in vivo é solicitada, como neurônios cultivados não recebem contribuições de outras regiões do cérebro, o que pode influenciar fortemente a sua maturação.
Esta técnica não é amplamente utilizado, em comparação com modelos de cultura de rato, apesar de suas primeiras descrições, no início da década de oitenta 16,17. A falta de imagens que apresentam a dissecção delicada pode conter os pesquisadores a desenvolver este modelo de cultura mouse. No entanto, devido à geração de inúmeros modelos de camundongos transgênicos de doenças neurodegenerativas com 25 invalidação gene específico ou rotulagem de tipos de neurônios específicos, DA culturas de neurônios de rato são agora de grande interesse.
Dominar esta técnica permite o estudo de neurônios DA isolados de qualquer tipo de camundongo transgênico e explorar a perturbação induzida por modificação genética. Além disso, estas culturas podem ser utilizadas como modelos de referência para comparação com neurónios DA derivadas de rato haste35 células ou de células-tronco pluripotentes induzidas 36.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
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