Abstract
Dopaminerjik nöronlar, beyindeki sinir hücrelerinin toplam sayısının en az% 1 temsil etmektedir. Nöronların Bu düşük miktarı, motor kontrolü, motivasyon ve çalışma belleği gibi önemli beyin fonksiyonlarını düzenler. Nigrostriatal dopaminerjik nöronlar selektif Parkinson hastalığı (PH) dejenere. Bu ilerleyici nöron kaybı tümden patolojinin motorlar semptomları (bradikinezi, dinlenme tremor ve kas sertliği) ile ilişkili. Dopaminerjik nöron dejenerasyonu sorumlu ana ajan hala bilinmemektedir. Bununla birlikte, bu nöronlar çeşitli koşullarda çok hassas olduğu görülmektedir. Primer kültürler özellikleri ve dopaminerjik nöronların özelliklerini araştırmak için en uygun modellerden birini oluşturmaktadır. Bu kültürler durdurmak ya nöronal dejenerasyonu yavaşlatmak amacıyla PD patolojiyi taklit çeşitli stres ajanları ve nöroprotektif bileşiklere sunulabilir. Jeneratör olmuştur PH çok sayıda transgenik fare modellerison on yılda ated başka dopaminerjik nöron kültürler için araştırmacıların ilgisini artırmıştır. Burada, video protokol embriyonik fare beyinleri hassas diseksiyon üzerinde duruluyor. Ventral mezensefalon hassas eksizyonu Daha sonraki çalışmalar, izin vermek için yeteri kadar dopaminerjik hücrelerin nöronal zengin kültürler elde etmek için önemlidir. Bu protokol, embriyonik transgenik fareler ile gerçekleştirilir ve immünofloresan boyama, nicel PCR, ikinci haberci miktarının ya da nöronal ölüm / hayatta kalma değerlendirme için uygundur edilebilir.
Introduction
Dopamin, temel beyin nörotransmitter 1,2 biri, esas olarak orta beyin dopaminerjik (DA) nöronlar tarafından serbest bırakılır. DA nöronlarının çoğunluğu mezensefalon 2-6 ventral kısmında bulunur. Mesostriatal, mezolimbik ve mezokortikal yollar 2,5 şematik olarak, orta beyin DA nöronlar anatomik ve fonksiyonel üç ayrı projeksiyon sistemleri ayrılabilir. Prefrontal korteks projelendirme dopaminerjik yollar biliş 2 karıştığı oysa nigrostriyatal yolu, mezolimbik yollar takviyesi, motivasyon ve öğrenme önemli bir rol oynar, motor davranışları yer almaktadır.
DA nöronlar örneğin, şizofreni, dikkat eksikliği, hiper aktivite bozukluğu, ve Parkinson hastalığı (PD) 2,4 gibi bazı insan nörolojik hastalıklarda rol oynamaktadır. PD substantia nigra bağlantı DA nöronlarının bir ilerici ve seçici dejenerasyonu ile karakterizedirstriatum pars compacta (SNc). PD motor semptomların sorumlu striatum şiddetli dopamin tükenmesine nigro-striatal DA nöronlar sonuçlarının kaybı (bradikinezi, dinlenme tremor ve rijidite) 7. Idiyopatik PH başlangıç nedeni kanıtlanmamıştır ve güncel tedaviler striatum dopamin seviyesini yeniden amaçlayan, sadece semptomatik vardır. En reçete ilaç, L-dopa (levodopa), dopamin doğal öncüsüdür. Levodopa yönetimi belirli bir süre için dopamin kaybı telafi rağmen, motor komplikasyonlar sonra (üzerine diskinezi ve / kapalı devletler) uzun süreli tedaviler 8,9 oluşur.
Dopaminerjik nöronlar ve PH ilgili araştırma sürekli ilerlemesi ve yoğun çabalar hücre nakli, gen tedavisi veya nöroprotektif ajanların 10,11 dayalı tedaviler geliştirmek için yapılıyor. Ancak, büyük bir sorun olmayan aydınlatılamamıştır kalır: aşırı vulnerab nedeni nedirDA nöronların lü k? Cevap kısmı DA nöron aktivitesi bulunabilir. Elektriksel aktivitesinde ve DA, nöronların uyarılabilirliğinin bir azalma 12 dejenere için eğilimlerini artırmak gibi görünüyor. Bununla birlikte, PD patojenezin karmaşıklığı DA katılan mekanizmaları nöronlar 13-15 dejenerasyonu tespit için ileri çalışmalara gerek.
Primer kültürler DA nöron özelliklerini 16-19 incelemek ve nöroprotektif ajanların 20-24 değerlendirilmesi için çeşitli streslere bu nöronların meydan özellikle alakalı. Sıçan kültürü modeli, genellikle fare embriyo mezensefalon ayrılmasının daha kolay olduğu için, fare ile karşılaştırıldığında, nöronların ve daha yüksek miktarlar da Fare içinde elde edilebilir kullanılır. Ancak, hastalığın 25 transgenik fare modelleri nesil fare 26-29 primer kültürler için nörolog toplumun ilgi artmıştır ölçüde etti. Pr kültürlerin rağmenyeni doğmuş hayvanların epared bu nöronların ayırt etme kapasitelerini muhafaza zaman, mitotik sonrası aşaması (mezensefalon nöronlar için E 13.5) embriyo bunları hazırlamak için daha da kullanılabilir. Aşağıdaki protokol hazırlamak için en zor olan fare embriyoları (E 13.5), birincil kültürde izole mezensefalon nöronlar sunar. Özellikle, daha iyi bir yeniden üretilebilirlik için, serum içermeyen kültür ortamı kullanılarak bir protokol sağlar. Kültür hazırlama (diseksiyon ve mekanik ayrışma) olarak iki en kritik adımlar dikkatle ilişkili videoda detaylı olarak açıklanacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan farenin bakım ve Avrupa Birliği Konseyi kurallarına laboratuvar hayvanlarının kullanımı için (86/609 / AB) uyarınca ele alınmıştır.
Gerekli Çözümleri 1. Hazırlık
- Hazır Çözümler
- 10x Poli-L-Ornitin (PLO) Çözüm: PLO hidrobromid 10 mg tartılır (molekül ağırlığı = 30,000-70,000) doldurulmuş ve steril, 70 ml su içinde çözülür. -20 ° C de 0.2 um şırınga filtresi, kısım kullanılarak çözeltisi ve mağaza Filtre.
- % 30 glükoz solüsyonu: 30 D (+) g tartın - Glukoz ve 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
- 5x Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) / Nutrient Mixture Ham F-12: DMEM / Ham F-12, 6 g toz tartılarak 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
- % 7.5 Sodyum Bikarbonat (NaHCO3) Solutiile: NaHCO 3, 7.5 g tartılır ve 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
- 1 M HEPES Çözüm: HEPES 23.8 g tartılır ve 100 ml'lik toplam hacme kadar steril su içinde çözülür. 4 ° C'de filtre, kısım ve saklayın.
- % 70 (h / h) etanol: steril su, 30 ml mutlak etanol içinde 70 ml seyreltin.
- Glikoz ve Antibiotics (PBS-GAB) Fosfat Tamponlu Tuz Çözeltisi: 10% 30 glükoz solüsyonu ve Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin, 500 ml penisilin-streptomisin çözeltisi 5 ml ilave ediniz. 4 ° C'de saklayın.
- Pasif hale getirilmiş fetal sığır serumu (iFBS) gece boyunca 4 ° C'de bovin serum çözülme ve 30 dakika boyunca 56 ° C'de etkisiz hale getirirler. -20 ° C'de 50 ml kısım ve mağaza.
- Kültür vasatı: steril suda, 5x DMEM / Ham F12-ardışık olarak 40 mi, 1 M HEPES 1 mi, 2 mi 200 mM L-glutamin, Penisilin-Streptomisin, 2 mi, 4 ml% 30 glikoz, bir karıştırınnd 180 ml'lik bir nihai hacme kadar% 7.5 NaHCO3 3 mi. Filtre ve aynı gün kullanın.
- Hormon Mix
- Kültür ortamının 180 ml hazırlayın. Bu ortamda apo-transferin 200 mg çözülür.
- Insülin 50 mg tartılır ve 0.1 M HCI, 2 ml içinde çözülür. Yavaşça, karıştırma sırasında steril su içinde yavaş yavaş 8 ml ilave edilir. Kültür ortamında bu çözüm ile seyreltilir.
- Putresin dihidroklorür 19,3 mg tartılır ve steril 10 ml su içinde çözülür. Hormon karışımı 10 ml'lik bir solüsyon ilave edin.
- , Steril su içinde bir 3 mM sodyum selenit çözeltisi ve mutlak etanol içinde bir 2 mM progesteron çözelti hazırlayın. Hormon karışımı her çözeltiden 20 ul ekle.
- -20 ° C'de hormon karışımı, bir kısım halinde, 10 ml ve mağaza Filtre.
Kültür Plakalar ve Araçların 2. Hazırlık
- Kültür levhalarını FBS Kaplama: diseksiyon önceki gün, kültür ortamının 180 ml hazırlar. 10 ml eklemekültür ortamı 90 ml iFBS. Ekle 300 ul / oyuk kültür ortamı / poli-D-lizin önceden kaplanmış 24 oyuklu plakalar içinde% 10 iFBS. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir. 4 ° C 'de (ve iFBS olmadan) kalan ortamı saklayın.
- Aletleri ve Pasteur pipetler sterilize edin. Sınıf II laminar akış ve CO 2 inkübatör yanı sıra malzemeler tabloda listelenen ekipmanı toplayın.
Fare mezensefalonun 3. Diseksiyon
- (Kurumsal kurallarına göre) E13.5 hamile fare Kurban. % 70 etanol ile fare karın temizleyin ve karın duvarı açın. , Narin makas kullanarak bunları açmak, rahim boynuzları toplayın rahim boynuzları her embriyo incelemek ve amniyotik membranlar kaldırmak. Steril PBS-GAB içeren bir 100 mm Petri kabındaki embriyolar yerleştirin ve forseps kullanarak 3 ardışık aynı hamam transferi ile yıkayın. Diseksiyon için, 60 mm steril Petri kabı içinde 3 embriyolar yerleştirin.
- Movstereomicroscope altında son Petri e. Embriyoların kafasını etmeyin. Vannas makas kullanma, beyinleri kesip.
- Dikkatlice çıkarın ve ön ve arka beyin bölgeleri atın. Rostral tarafına, berzah bölgede kaudal yan kesim için, talamik bölgeye yakın kesim üstün kollikulusu çıkarın.
- Ön orta beyin izole edildikten sonra, dikkatli bir şekilde ultra ince forseps kullanılarak meninks çıkarın. PBS-GAB ile dolu bir steril 13 ml tüp içinde, meninkslerde olmadan kesilmiş parçalarını toplamak.
- % 70 etanol ile iyice mesencephala içeren tüp temizleyin ve kaputun altında getirmek.
4. Hücre Ayrılma
- Yıkama steril PBS ile 3 kez GAB mesencephala. Beyin fragmanları Her yıkama arasında yerleşmek ve doku bozmamak için izin ver. Son yıkamadan sonra, 37 ° C'de 15 dakika boyunca tripsin / EDTA, 3 ml beyin bölümleri mümkün olduğu kadar çok dikkatli bir şekilde çözeltinin ayrılması ve inkübe2 inkübatör CO.
- Yangın-lehçe Pastör pipetleri olmayan bir parlatılmış cam pipet sonu olarak nöronların canlılığını maksimize keskin ve ayrışma adımları sırasında hücrelere zarar verebilir. Bunu yangın parlatma esnasında hafifçe ekstremite çapını Pasteur pipet (0,5 mm) azaltır.
- Dikkatle mümkün olduğu kadar tripsin / EDTA çözeltisi çıkarın ve kültür ortamı 10 ml /% 10 iFBS ekleyin. Yıkama beyin bölümleri kültür ortamı /% 10 iFBS ile 3 kez.
- Yangın cilalanmış Pasteur pipeti kullanarak, kültür ortamı /% 10 iFBS 6 ml mesencephala ayrılmasını başlar. Öğütün 10x daha sonra yeni bir steril 13 ml tüp içinde orta toplamak parçalar oturmasına izin verin, (hava kabarcıklarını önlemek).
- , Kültür ortamı, 6 ml ilave kez önceki adımı tekrar ve aynı 13 ml'lik bir tüp içinde çözülmüş hücreleri içeren ortamın toplanması.
- 5 dakika boyunca 160 g'de santrifüje hücreleri. Süpernatant atılır ile takviyeli kültür ortamında tekrar süspansiyon hücreleri10% hormon karışımı.
5. Hücre Kaplama
- Bir Malassez hücre içinde süspansiyon halinde hücrelerin sayısı ve 600,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyon ortamın seviyesini ayarlar. Çevresi 1,700,000 hücreleri bir fare mesensefalonundan elde edilebilir.
- 24-delikli plakadan boyama maddesini FBS içeren çıkarın ve her bir kuyu hücre süspansiyonu 1 ml eklemek (600,000 hücre / göz, TH + hücrelerinin% 2-4).
- 37 ° C'de inkübe edin ve% 5 CO 2/95% hava. Hiçbir orta değişim gereklidir. Dopaminerjik nöronlar in vitro yaklaşık 5-7 gün (dopamin taşıyıcı tutarlı ifadesi) sonra olgun. Orta değiştirmeden 15 gün kültür up hücreleri tutun.
6. İmmünofloresan Protokol
- Lameller Temizleme
- Diseksiyon bir gün önce, bir Petri kutusu içine 1 M HCI 10 ml ekleyin. Sıvı 12-15 cam kapak yüzeyinde yerleştirin ve 15 dakika bekleyin.
- Kapağın Evyesıvı girebilir ve 15 dakika boyunca bekleyin.
- , HCI yi uzaklaştırmak ve su ile 3 kez yıkanır.
- Bir kez saf etanol ile hızlı bir şekilde lamelleri yıkayın, sonra tabak saf etanol ilave edin ve 30 dakika boyunca bekleyin.
- Kapağın altında, etanolden temizlenmiş lamelleri çıkarın ve steril pensler kullanılarak bir 12-yuvalı hücre kültürü plakasının oyuk başına 1 lamel ekleyin.
- Yıkama steril su (1 ml / oyuk) ile iki kere lamelleri. Daha sonra, steril bir kez PBS ile yıkayın.
- Lameller Kaplama
- PBS çıkarın ve 500 ul / 2x FKÖ'nün (PBS içinde seyreltilmiş) ilave edin. CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C de 4 saat süreyle inkübe edilir.
- FKÖ çözüm çıkarın ve steril PBS ile 3x yıkayın.
- PBS çıkarın ve 500 ul / gözenek% 20 iFBS / 1 ug / ml laminin ekleyin. CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- İmmünofloresan için Hücreleri Kaplama
- 12-delikli plakadan kaplama orta çıkarın.
- 900,0 ekleme00 hücre / göz 2 ml hacim içinde ve inkübatör içinde 37 ° C'de hücreler büyür. Hücreler ortam değiştirme olmadan 15 gün kültür kadar tutulabilir.
- İmmünoboyama
- 12-delikli plakadan Ortamı çıkarın ve DMEM, 37 ° C'de önceden ısıtılmış / 500 ul ile yıkayın.
- / Oyuk DMEM 500 ul, 37 ° C'de önceden ısıtılmış eklenmekte, daha sonra yavaşça 160 | il / göz, 8% paraformaldehid (PFA,% 2 nihai konsantrasyon) ilave ediniz ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edilir.
- PFA çıkarın ve PBS ile 3x yıkama / 0.1 M glisin, 10 dakika boyunca.
- , PBS çıkarın 300 ul / göz PBS /% 0.05 Triton X-100/20% Keçi serumu ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
- , Orta çıkarın 300 ul / göz PBS içinde seyreltilmiş birincil antikor /% 0.05 Triton X-100/1% Keçi serumu ilave edilir ve oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin. Dopaminerjik nöron ve kültürün karakterizasyonu tespiti için kullanılabilecek primer antikorlar Malzeme tabloda belirtilmiştir. Keep1 kuyusu primer antikor olmadan farklı ikincil antikorların arka değerlendirmek için.
- Ortamı çıkarın ve PBS ile 3x yıkama /% 0.2 jelatin 10 dakika karıştırıldı.
- , Orta çıkarın 300 ul / göz PBS içinde seyreltilmiş sekonder antikor /% 0.05 Triton X-100/1% Keçi serumu ekleyin ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir. Kullanılan ikincil antikorlar malzemeleri tabloda belirtilmiştir.
- Ortamı çıkarın ve PBS ile 3x yıkama /% 0.2 jelatin 10 dakika karıştırıldı.
- Orta çıkarın ve PBS ile 3x yıkayın.
- Aşağı Vectashield bir damla cam slaytlar hücre tarafında lamelleri monte edin. Daha sonra 4 ° C'de saklayın, montaj orta kuruması için oda sıcaklığında bir gece slaytlar tutun.
- Konfokal mikroskop ya epifluoresan için donatılmış bir faz-kontrast mikroskobu kullanılarak görüntü kazanır. Temsilcisi görüntüleri Leica SP2 UV odaklı mikroskop ile elde edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mezensefalon kültür adımların bir akış şeması gösterilmektedir, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Kısaca, bir gebe fare E 13.5 İsviçre embriyolar alındıktan sonra, ventral mezensefalon tüm embriyo parçalanmıştır. Izole beyin parçaları arka arkaya enzimatik sindirim ve mekanik ayrılma sunulur. Ayrılan hücreler, önceden kaplanmış 12 ya da 24 oyuklu plakalar üzerinde kültür ortamı içinde yeniden süspansiyona alınmış ve kaplama, santrifüj ile pelet haline getirildi. Hücreler orta değiştirmeden 15 gün kadar muhafaza edilir.
3.2 adımına karşılık ventral mezensefalon diseksiyon ayrıntılı bir akış şeması, Şekil 2 'de gösterilmiştir. Kesik çizgiler, kırmızı E 13.5 fare beyninin bir şematik gösterimi, 3 ana kesim çizgilerini göstermektedir (. Prestoz ark uyarlanmış 30) ve Kesme basamaklar gösterilmiştir.
Vit 1, 4 ve 7 gün sonra kültür Faz kontrast görüntüleriRO (DIV), Şekil 3'te gösterilmiştir. nöronlar hızlı uzatma geliştirmek ve filizlenme (Şekil 3A). Dallanma ve yansımaları daha Div4 ve DIV7 (Şekil 3B-3C) olarak genişletilmiştir.
Dopaminerjik nöronlar, bir anti-TH antikoru (Şekil 4A) kullanılarak, bağışıklık kimyası ile tespit edilir. TH + hücrelerinin sayısı 2.5 cm2 lamel (Şekil 4B) göre ifade edilir. Hücre yoğunluğu kaplanmış plastik sınırları üzerinde iyi göre kaplanmış cam lamel üzerinde çok daha yüksek olduğu gibi, bu nedenle de üzerinde ortasında olacak gecelik th + hücrelerinin sayısını ifade yoktur. DA nöronlar (TH + hücreleri) lamel üzerinde tüm hücre popülasyonunun% 2-4 temsil etmektedir. TH-pozitif (T H +) hücreleri, erken div1 olarak görünür ve bu sayı DIV6 bir maksimuma ulaşacak şekilde süratle yükseltir.
Hücrelerin nispi oranı DA hücreleri wit immünofloresan etiketlenmesi ile değerlendirilirs, bir anti-DAT antikoru (Şekil 5A) ya da anti-MAP2 antikoru ile bir anti-TH antikoru (Şekil 5B) ve nöronal hücreler eş zamanlı lekelenmesi. Kültüründe bulunan çeşitli sinirsel temsili imüno Şekil 5 'de gösterilmiştir. GABAerjik nöronlar, bir anti-GAD67 antikoru (Şekil 5C) kullanılarak boyandı ve hücrelerin yaklaşık% 50 temsil etmektedir. Serotonerjik nöronlar, bir anti-serotonin antikoru (Şekil 5D) ile belirlenmiş ve kültürdeki hücrelerin% 1'den daha az temsil edilmiştir. Mezensefalon hücre kültürü da glutamaterjik nöronlar (kültürün% 40), kolinerjik nöronların, glial hücreler ve nadir (yaklaşık% 2-3) içermektedir. Glial hücre oranı glial fibriler asidik protein (GFAP) boyama (Şekil 5E) kullanılarak tespit edilir. Mezensefalon dopaminerjik nöronların açık olarak teşhis edilmesi, aynı zamanda, ya da Pitx3 Foxa2 31,32 gibi spesifik markörleri kullanılarak elde edilebilir.
Kültüründe bulunan çeşitli sinirsel Daha yüksek büyütme immun Şekil 6'da gösterilmektedir. Dopaminerjik nöronlar, bir anti-DAT antikoru (Şekil 6) ile tespit edilir. DAT boyama DA nöron olgunlaşma durumunu yansıtır. DAT sentezleme DIV3-4 başlar. GABAerjik nöronlar ve serotonerjik nöronlar, sırasıyla, bir anti-GAD67 antikoru (Şekil 6B) veya bir anti-serotonin antikoru (Şekil 6C) kullanılarak lekelenmektedir.
Mesencephalon kültürünün Şekil 1. Illustrated akış şeması. Ana kültür adımlar belirtilmiştir. (A), hamile bir İsviçreli fare Kurban Petri kapları içinde E13.5 embriyolar toplamak ve ardışık PBS banyoları ile yıkayın. (BC) diseksiyon mikroskobu, d Altındaissect ventral mezensefalon bütün embriyolardan ve bir tüp içine yerleştirilir. (D) kesilmiştir beyin fragmanlara tripsin-EDTA ekleyin ve 15 dakika için 37 ° C 'de özet. (E) ihtiva eden kültür ortamı, serum eklemek, tripsin çıkarıp yerine mekanik hücre ayrışma (10 Tritürasyon hareketleri, iki kez tekrarlanır). (F), hücre Pelet hormonlar ile desteklenmiş serum serbest ortamda onları tekrar süspansiyon ve precoated 12 veya 24-çukurlu levhalarda bunları plaka. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın.
Mesencephalon diseksiyon Şekil 2. Ayrıntılı akış şeması. Esas diseksiyon adımlar belirtilmiştir. (A) re sonra E13.5, Fare embriyorahim boynuzları yonu. (B), embriyo da kafa olmaksızın, beyin kesip. (C) E13.5 embriyonik fare beyin şematik gösterimi. (C, kuyruk kesme; D, R, dorsal kesme, kesme, rostral) Kırmızı beyin ventral mezensefalon izole etmek için kesilmesi gerektiğini burada kesik çizgiler göstermektedir. Sefalik kesecikler telencephalon, diensefalon, mesencephalon ve rhombencephalon sırasıyla, mavi, mor, pembe ayrılmış ve gri edilir. Aq, su boruları; Tahmin olarak, hipotalamus; LGE, yanal ganglionik önemi; LV, lateral ventrikül; MFB, medial ön beyin demeti; MGE, medial ganglionik önemi; sc, üstün kollikulus; Talasemi, talamus; VM, ventral mesencephalon; Kırmızı E13.5 fare beyni üzerindeki kesik çizgiler ile 4V, (30 uyarlanmıştır) dördüncü ventrikül. (D) hatları Kesme gösterilir. (E) Fare beyin ön ve arka beyin bölgelerinin çıkarıldıktan sonra (yani kesim R sonra). sup çıkarılmasından sonra (F) Fare beynierior kollikuluslar (yani kesikler R ve D sonra) izole mezensefalonun. (G) alttan görünüşü (yani sonra R, C, D keser). , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil farklı gelişim aşamalarında kültürün 3. Faz kontrastlı görüntüler. (A) 'div1, (B) DIV4 ve aynı kültür (C) DIV7 görüntüleri gösterilir. Görüntüler ters bir mikroskop ile canlı hücreler üzerinde elde edildi. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Dopaminerjik nöronların Şekil 4. Tirozin hidroksilaz, boyama. (A) 'de DIV8 DA nöronlar, anti-TH antikoru kullanılarak tespit edildi. Revelation bir 3,3 '-diaminobenzidin (DAB), kiti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Görüntü. Ters bir mikroskop ile elde kültürünün yaşının bir fonksiyonu olarak mesencephalon kültürlerde TH + nöronların (B) Sayı edildi. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Kültür nöronların ve astrositlerin Şekil 5. Örnek oranı. Div4 'de, (Macenta) DA nöronlar, anti-DAT (A) veya anti-T kullanılarak tespit edildi'H antikoru (B) ve GABAerjik nöronlar, serotonerjik nöronların ve astrositlerin (Macenta), sırasıyla, bir anti-GAD67 (C) anti-serotonin (D), ve anti-GFAP (E) antikorlar kullanılarak tespit edildi. (Deniz mavisi) nöronal hücreleri, anti-MAP2 antikoru (AE) ile boyandı. Görüntüler ters bir mikroskop ile elde edildi. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Mesencephalon kültürünün çeşitli hücre popülasyonlarının 6. Temsilcisi boyanma Şekil. (Kırmızı) DIV9 de DAT boyamasıyla görüldüğü (A), dopaminerjik nöron. (B) (yeşil) DIV9 bir GAD-67 lekeleme ile görselleştirilmiştir, GABAerjik nöronlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, embriyonik fare ve dopaminerjik nöronlar tespit etmek için immünofloresan prosedürden mezensefalik nöronlar primer kültürü hazırlamak için gerekli prosedürler ve reaktif maddeler sunmaktadır. Prosedürün kritik aşamaları embriyoların diseksiyon ve toplanan beyin parçalarının mekanik ayrışma bulunmaktadır. Yüksek kaliteli diseksiyon aletleri diseksiyon tekniği master yardımcı olur. DA nöronlar mezensefalonun küçük bir kısmını oluşturmaktadır. Bu duruma göre, ventral mezensefalon sağ tarafına toplama DA nöronlarının% 2-4 ihtiva eden bir kültür elde etmek için gereklidir. Mekanik ayırma dikkatli ve yavaşça yapılması gerekmektedir. Kültür çözülmemiş nöronların kümeleri ihtiva etmesi durumunda, bir ya da iki veya daha fazla toz haline getirme adımlarını ekleyin.
Bu protokol, nöron kültürü için serumsuz ortam kullanır. Ancak, serum ile kaplandıktan hücrelerin bağlanmasını geliştirmek için gereklidir. Ser yerini Hormon karışımı,ee, nöron büyümesi belirlenebilir ve glial hücreler hayatta kalma ve çoğalmayı en aza indirmek için tanımlanır. Sonuç olarak, nöronal olmayan hücreler (GFAP-boyaması kullanılarak kantitatif) kültürden yaklaşık% 2-3 temsil etmektedir. Alternatif olarak kültürler eklenmesi ile serum mevcudiyetinde yetiştirilebilir, iki gün sonra tohumlama, sitosin-β-D-arabinofuranosid (Ara-C, 5-8 uM) glial hücreler 26 çoğalmasını engellemek için. Hormon karışıma başka bir alternatif olarak tanımlanmış ortamlarda ve ilave 29 kullanımıdır.
Bu teknik immünofloresan boyama, kantitatif PCR, ikinci haberci ölçümlerini ve toksikoloji / hayatta kalma ekranlar çeşitli gerçekleştirmek için uygundur. Ayrıca bu preparatların 33,34 elektrofizyolojik çalışmalar yapmak mümkün olmalıdır. Kullanılan hayvanların sayısını en aza indirerek bu kültürler önceden aday nöro-koruyucu moleküllerin belirlenmesi ve DA nöronlar özelliklerini karakterize etmek için yardımcı olabilir. Ancak fikültürlü nöronlar güçlü bir şekilde olgunlaşmasını etkileyebilecek diğer beyin bölgelerinin, girdileri almıyorsunuz gibi vivo modeller kullanılarak nal onay talep edilir.
Bu teknik yaygın seksenlerin başında 16,17 yılında ilk açıklamaları rağmen, sıçan kültür modelleri ile karşılaştırıldığında, kullanılmaz. Hassas diseksiyon sunan görüntülerin olmaması bu fare kültür modeli geliştirmek için araştırmacılar dizginlemek olabilir. Bununla birlikte, özel bir gen veya belirli geçersiz nöron türlerinden etiketi ile birlikte nörodejeneratif hastalıkların 25, çok sayıda transgenik fare modelleri nesil, fare DA nöron kültürleri hemen büyük bir ilgi vardır.
Transgenik farenin her türlü izole DA nöronların çalışma, bu teknik sağlar Hakim ve gen modifikasyonu ile uyarılan pertürbasyon keşfetmek için. Ayrıca, bu referans kültürleri fare modelleri kök türetilen DA nöronlarının karşılaştırılmalıdır olarak kullanılabilirHücreler, 35 ya da uyarılmış pluripotent kök hücreler 36.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal Bovine Serum | Lonza | 14-801F | |
| DMEM 4.5 g/L glucose with L-glutamine | Lonza | BE12-604F | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140122 | |
| L-Glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030123 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | D0547 | Powder |
| Laminin - 1 mg/ml in Tris buffered NaCl | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-Ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | I5523 | |
| apo-Transferrin human | Sigma-Aldrich | T1147 | |
| Putrescine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | |
| Sodium selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | Stock solution 1 M in water |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G9391 | Stock solution 2% (w/v) in water |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Paraformaldehyde 16% in water | Electron Microscopy Sciences | RT 15710-S | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck Millipore | 106329 | |
| D(+)-Glucose, Monohydrate | Merck Millipore | 4074-2 | |
| Hydrochloric acid - c(HCl) = 1 mol/L (1 N) Titripur | Merck Millipore | 109057 | |
| Sterile water - Aqua B. Braun | Braun | ||
| Ethanol absolute NORMAPUR analytical reagent | VWR | 20821.321 | |
| Sterile Petri dishes | VWR | 82050-566 | |
| Pasteur pipettes plain glass - Wilhem Ulbrich GdbR. | VWR | 612-2297 | |
| Counting chamber Malassez | VWR | 631-0975 | |
| Serum Acrodisc Syringe Filter with Supor Membrane, Sterile, GF/0.2 µm, 37 mm | PALL Life science | 4525 | |
| Surgical Scissors - Straight, sharp-sharp, 14.5 cm long | Fine Science Tools | 14002-14 | To open the abdominal wall |
| Scissors - Straight, pointed, delicate, 10 cm long | MORIA | 4877A | To open the uterine wall |
| Forceps - Curved, usual, serrated jaws 1 mm | MORIA | 2183 | To manipulate embryos |
| Vannas Scissors - Curved, pointed, 7 mm blades | MORIA | MC50 | To take out the mesencephalon |
| Ultra Fine Forceps - Curved, delicate, 13 cm long | MORIA | 9987 | To remove meninges |
| BD BioCoat Poly-D-Lysine 24-well Multiwell Plates | BD Bioscience | 356414 | |
| BD Falcon 12-well Cell Culture Plate, flat-bottom with lid | BD Bioscience | 353043 | |
| SuperFrost Microscope Slides, Ground edges 90º | MENZEL-GLÄSER | AG00008032E | |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H circular 18 mm Ø | MARIENFELD | 117580 | |
| Polyclonal Rabbit Anti-Microtubule-Associated Protein 2 (MAP2) Antibody | Chemicon Millipore | AB5622 | 1/200 |
| Monoclonal Mouse Anti-Glutamate Decarboxylase (GAD67) Antibody, clone 1G10.2 | Chemicon Millipore | MAB5406 | 1/400 |
| Monoclonal Rat Anti-Dopamine Transporter (DAT) Antibody, clone DAT-Nt | Chemicon Millipore | MAB369 | 1/500 |
| Monoclonal Mouse Anti-5-HT Antibody | 1/8,000 - Generous gift from Yves Charnay (Swizerland, Yves.Charnay@hcuge.ch) | ||
| Goat Serum, New Zealand Origin | Life Technologies | 16210-064 | |
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-31556 | 1/200 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | 1/1,000 |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rat IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11007 | 1/1,000 |
| VECTASHIELD HardSet Mounting Medium | Vector Laboratories | H-1400 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss microscopy | Stemi-2000C | |
| Bunsen Burner FIREBOY | VWR | 451-0136 |
References
- Glowinski, J., Cheramy, A., Romo, R., Barbeito, L. Presynaptic regulation of dopaminergic transmission in the striatum. Cell Mol Neurobiol. 8, 7-17 (1988).
- Iversen, S. D., Iversen, L. L.
- Dahlstroem, A., Fuxe, K. Evidence for the Existence of Monoamine-Containing Neurons in the Central Nervous System I. Demonstration of Monoamines in the Cell Bodies of Brain Stem Neurons. Acta Physiol Scand Suppl. SUPPL. , 231-255 (1964).
- Chinta, S. J., Andersen, J. K.
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Hegarty, S. V., Sullivan, A. M., O'Keeffe, G. W. Midbrain dopaminergic neurons: a review of the molecular circuitry that regulates their development. Dev Biol. 379, 123-138 (2013).
- Samii, A., Nutt, J. G., Ransom, B. R.
- Santini, E., Heiman, M., Greengard, P., Valjent, E., Fisone, G. Inhibition of mTOR signaling in Parkinson's disease prevents L-DOPA-induced dyskinesia. Sci Signal. 2, (2009).
- Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain. 134, 2339-2357 (2011).
- Obeso, J. A., et al. Missing pieces in the Parkinson's disease puzzle. Nat Med. 16, 653-661 (2010).
- Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4, (2012).
- Michel, P. P., Toulorge, D., Guerreiro, S., Hirsch, E. C. Specific needs of dopamine neurons for stimulation in order to survive: implication for Parkinson disease. FASEB J. 27, 3414-3423 (2013).
- Decressac, M., Volakakis, N., Bjorklund, A., Perlmann, T. NURR1 in Parkinson disease-from pathogenesis to therapeutic potential. Nat Rev Neurol. , (2013).
- Jouve, L., Salin, P., Melon, C., Le Goff, L. K. erkerian- Deep brain stimulation of the center median-parafascicular complex of the thalamus has efficient anti-parkinsonian action associated with widespread cellular responses in the basal ganglia network in a rat model of Parkinson's disease. J Neurosci. 30, 9919-9928 (2010).
- Hirsch, E. C., Jenner, P., Przedborski, S.
- di Porzio, U., Daguet, M. C., Glowinski, J., Prochiantz, A. Effect of striatal cells on in vitro maturation of mesencephalic dopaminergic neurones grown in serum-free conditions. Nature. 288, 370-373 (1980).
- Denis-Donini, S., Glowinski, J., Prochiantz, A. Glial heterogeneity may define the three-dimensional shape of mouse mesencephalic dopaminergic neurones. Nature. 307, 641-643 (1984).
- Barbin, G., Mallat, M., Prochiantz, A. In vitro studies on the maturation of mesencephalic dopaminergic neurons. Dev Neurosci. 7, 296-307 (1985).
- Marey-Semper, I., Gelman, M., Levi-Strauss, M. A selective toxicity toward cultured mesencephalic dopaminergic neurons is induced by the synergistic effects of energetic metabolism impairment and NMDA receptor activation. J Neurosci. 15, 5912-5918 (1995).
- Salthun-Lassalle, B., Hirsch, E. C., Wolfart, J., Ruberg, M., Michel, P. P. Rescue of mesencephalic dopaminergic neurons in culture by low-level stimulation of voltage-gated sodium channels. J Neurosci. 24, 5922-5930 (2004).
- Toulorge, D., et al. Neuroprotection of midbrain dopamine neurons by nicotine is gated by cytoplasmic Ca2. FASEB J. 25, 2563-2573 (2011).
- Rousseau, E., Michel, P. P., Hirsch, E. C. The Iron-Binding Protein Lactoferrin Protects Vulnerable Dopamine Neurons from Degeneration by Preserving Mitochondrial Calcium Homeostasis. Mol Pharmacol. 84, (2013).
- Orme, R. P., Bhangal, M. S., Fricker, R. A. Calcitriol imparts neuroprotection in vitro to midbrain dopaminergic neurons by upregulating GDNF expression. PLoS One. 8 (e62040), (2013).
- Choi, W. S., Kruse, S. E., Palmiter, R. D., Xia, Z. Mitochondrial complex I inhibition is not required for dopaminergic neuron death induced by rotenone, MPP+, or paraquat. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15136-15141 (2008).
- Trancikova, A., Ramonet, D., Moore, D. J. Genetic mouse models of neurodegenerative diseases. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 419-482 (2011).
- Gao, H. M., Liu, B., Zhang, W., Hong, J. S. Critical role of microglial NADPH oxidase-derived free radicals in the in vitro MPTP model of Parkinson's disease. FASEB J. 17, 1954-1956 (2003).
- Lin, X., et al. Conditional expression of Parkinson's disease-related mutant alpha-synuclein in the midbrain dopaminergic neurons causes progressive neurodegeneration and degradation of transcription factor nuclear receptor related 1. J Neurosci. 32, 9248-9264 (2012).
- Bye, C. R., Thompson, L. H., Parish, C. L. Birth dating of midbrain dopamine neurons identifies A9 enriched tissue for transplantation into parkinsonian mice. Exp Neurol. 236, 58-68 (2012).
- Ramonet, D., et al. Dopaminergic neuronal loss, reduced neurite complexity and autophagic abnormalities in transgenic mice expressing G2019S mutant LRRK2. PLoS One. 6 (e18568), (2011).
- Prestoz, L., Jaber, M., Gaillard, A. Dopaminergic axon guidance: which makes what. Front Cell Neurosci. 6, (2012).
- Nunes, I., Tovmasian, L. T., Silva, R. M., Burke, R. E., Goff, S. P. Pitx3 is required for development of substantia nigra dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4245-4250 (1073).
- Ferri, A. L., et al. Foxa1 and Foxa2 regulate multiple phases of midbrain dopaminergic neuron development in a dosage-dependent manner. Development. 134, 2761-2769 (2007).
- Rayport, S., et al. Identified postnatal mesolimbic dopamine neurons in culture: morphology and electrophysiology. J Neurosci. 12, 4264-4280 (1992).
- Kim, K. M., Nakajima, S., Nakajima, Y. Dopamine and GABA receptors in cultured substantia nigra neurons: correlation of electrophysiology and immunocytochemistry. Neuroscience. 78, 759-769 (1997).
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a allows context-specific isolation of progenitors of GABAergic or dopaminergic neurons during neural differentiation of embryonic stem cells. Stem Cells. 30, 1349-1361 (2012).
- Su, H., et al. Immediate expression of Cdh2 is essential for efficient neural differentiation of mouse induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 10, 338-348 (2013).
