Summary
Une analyse à haut débit de Salmonella in vitro du phénotype bactérien ou autre association, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires avec une grande capacité de débit a été développé. La méthode a été utilisée pour évaluer Salmonella gène knock-out souches mutantes pour leur implication dans les interactions hôte-pathogène.
Abstract
espèces de Salmonella sont des agents pathogènes zoonotiques et principales causes de maladies d'origine alimentaire chez les humains et le bétail 1. La compréhension des mécanismes sous-jacents aux interactions Salmonella de sont importants pour élucider la pathogenèse moléculaire des infections à Salmonella. Le dosage de la protection de gentamicine au phénotype association de Salmonella, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires a été adapté pour permettre le criblage à haut débit de définir les rôles des mutants de délétion de Salmonella enterica sérotype Typhimurium dans les interactions hôte à l'aide de RAW 264.7 macrophages murins. Dans ce protocole, la variance dans la mesure est considérablement réduite par rapport au protocole standard, parce que de type sauvage et des souches mutantes multiples peuvent être testés dans la même boîte de culture et dans le même temps. L'utilisation de pipettes multicanaux augmente le débit et améliore la précision. En outre, les préoccupations liées à l'utilisation de moins host cellules par puits dans 96 puits boîte de culture ont été abordés. Ici, le protocole de l'essai in vitro Salmonella modifié d'invasion en utilisant des cellules phagocytaires a été employée avec succès à phénotype 38 mutants individuels Salmonella de suppression d'association, l'invasion et la réplication intracellulaire. Les phénotypes in vitro sont présentées, dont certaines ont été confirmés par la suite avoir des phénotypes in vivo dans un modèle animal. Ainsi, l', test normalisé modifié au phénotype Salmonella association, l'invasion et la réplication dans les macrophages avec une grande capacité de débit pourrait être utilisé plus largement pour étudier les interactions bactéries-hôtes.
Introduction
Salmonella non typhoïdique, sont des causes importantes de maladies entériques dans tous les vertébrés. La salmonellose chez l'homme est parmi les maladies d'origine alimentaire bactériennes top 1. Caractérisation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions de Salmonella avec leurs hôtes animaux se fait principalement à travers l'étude de Salmonella enterica sérotype Typhimurium (STM) en culture de tissus et des modèles animaux d'infection. Obtenir un aperçu des interactions hôtes-STM va nous aider à comprendre comment la bactérie Salmonella survivre et se développer à l'intérieur des cellules hôtes. Le premier défi dans l'étude de ces interactions est d'identifier autant de facteurs participant que possible à la fois l'hôte et l'agent pathogène, mais ces efforts sont largement entravée par les difficultés importantes de faire face à deux systèmes biologiques complexes indépendants simultanément, c'est-à-hôte et Salmonella, dans des conditions physiologiques. De plus, la grande repertoire de Salmonella et de gènes de l'hôte facteurs impliqués dans les interactions hôte codant potentiellement nécessitent plate-forme biologique à haut débit pour relever ce défi.
A, test normalisé modifié au phénotype association de Salmonella, l'invasion et la réplication dans les macrophages avec une grande capacité de débit a été développé pour examiner un grand nombre de gènes susceptibles d'engagement dans les interactions Salmonella de. Le test de protection de gentamicine a été développé en 1973 2, mais a d'abord été décrit en détail par Elsinghorst 3,4 à 1994. Il est maintenant devenu un outil standard pour l'étude de nombreuses bactéries pathogènes intracellulaires ex vivo, y compris Salmonella 5,6. Bactéries internalisées éviter d'être tués par des antibiotiques tels que la gentamicine, qui ne peuvent pas pénétrer les cellules eucaryotes 3. En tirant parti de ce phénomène, l'essai de protection gentamicine mesure la survie et la croissance de ba intracellulairepathogènes cterial. Trois événements au cours de l'infection, c'est à dire, d'une association avec les cellules eucaryotes, l'invasion et la replication, peuvent être évalués pour les bactéries pathogènes intracellulaires en fonction de l'intervalle de temps entre l'infection, le traitement de gentamicine, et une nouvelle incubation (Figure 1). Lignées de cellules eucaryotes offrent un environnement physiologique qui est moins complexe que les modèles animaux pertinents pour les études d'interaction hôte-pathogène.
Le test de protection gentamicine est une plate-forme appropriée pour étudier les interactions STM-hôtes, mais le dosage standard dans une boîte de culture de 24 puits a une capacité faible débit. Analyse informatique des ensembles de données in vivo identifié 149 produits de gènes de Salmonella qui sont prévus pour interagir avec environ 300 produits de gènes de l'hôte (données non publiées). Le dosage standard de protection gentamicine n'a pas la capacité de ce phénotype nombre de mutants de manière efficace.
Dans suppion, l'essai de protection de gentamicine peut théoriquement détecter l'invasion d'un seul bactérie. En raison de cette sensibilité inhérente, les données brutes sont sensibles à des variations lors de techniques répété à des moments différents. Les contrôles internes et rapport de présentation des données après normalisation sont indispensables pour l'interprétation des résultats soit valable. Compte tenu de ces considérations, un test de protection gentamicine normalisé modifié a été développé pour améliorer la capacité de contrôle et d'augmenter la précision.
Le protocole suivant est détaillée et illustrée pour effectuer le test de protection à la gentamicine modifié en utilisant des boîtes de culture à 96 puits et la lignée cellulaire de macrophages murins RAW264.7 d'. Par rapport au protocole standard dans des boîtes de culture de 24 puits, le protocole modifié présente les avantages suivants: 1) À l'aide des boîtes de culture de 96 puits permet jusqu'à 10 souches mutantes différentes à phénotypées y compris les contrôles positifs et négatifs internes avec une puissance statistique suffisante;2) La différence de résultats est considérablement réduit, car les mutants sont testés dans la même boîte de culture et, en même temps; 3) L'utilisation de pipettes multicanaux augmente le débit tout en réduisant la fatigue de l'opérateur. Enfin, la comparaison des boîtes de culture de 24 puits, les préoccupations de moins de cellules hôtes par puits dans 96 puits boîte de culture ont été abordées grâce à l'optimisation du protocole et de la normalisation.
En résumé, la modification, essai normalisée pour in vitro Salmonella phénotype ou autre association bactérienne, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires augmente la précision et réalise capacité à haut débit tout en réduisant la fatigue de l'opérateur.
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Protocol
1 murin macrophage RAW264.7 culture cellulaire
- Cultiver les cellules de macrophages murins faible numéro de passage, RAW264.7 (Le numéro ATCC ®, TIB-71) dans une culture de cellules ballon évacué capuchon T-75 de filtre dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) , 0,5% de NaHCO 3, et 1% d'acides aminés non essentiels 100x (NEAA) à 37 ° C, dans un incubateur à CO2 à 5%.
- Une fois que les cellules atteignent une confluence de 60 à 80% dans le flacon, en utilisant un racleur de cellules pour récolter les cellules et compter les cellules dans un hémacytomètre et calculer la concentration de cellules.
- Remettre en suspension les cellules et diluer la concentration de cellules dans 2,5 x 10 5 / ml dans du milieu de culture cellulaire DMEM frais. Utiliser des pipettes multicanaux à la plaque 200 pl de DMEM milieu de culture cellulaire contenant 5 x 10 4 cellules dans chaque puits de plaques à 96 puits pour culture cellulaire.
- Plate quatre puits de chaque souche de Salmonella. Mettre en place trois plaques distinctes pour un ensemblede phagocytaire essai cellules d'invasion, et les marquer avec «association», «invasion» et de «réplication», respectivement.
- Placer les plaques dans 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C ON pour permettre aux cellules de se fixer des macrophages au fond des puits.
2 Préparation de type sauvage et des mutants de Salmonella
- Le même jour de la préparation des cellules macrophages RAW264.7, prélever des colonies simples de type sauvage (WT) Salmonella enterica sérotype 14028s Typhimurium, mutant DinvA, DphoP mutants, et les souches mutantes de test souhaités, et de la culture eux dans Luria-Bertani ( LB) complété avec des antibiotiques, le cas échéant. Utilisation chaque ensemble de cellules phagocytaires dosages d'invasion de tester un maximum de 10 souches mutantes (mutants DinvA et DphoP mutant défectueux en replication et invasion intracellulaire, respectivement).
- Cultiver les bactéries pendant 14 heures à 37 ° C avec sHaking à 220 tours par minute dans 5 ml de bouillon LB chaque bouchée non hermétiquement dans 14 ml dans un tube en polypropylène à fond rond. Bouillon LB contenant les antibiotiques appropriés, dans notre cas, la plupart des souches mutantes sont résistantes à la kanamycine, 50 pg / ml
- Le lendemain, la sous-culture de chacun des sur des cultures de souches de Salmonella dans la plaine 5 ml de bouillon LB dans un rapport de 1:50 pour un 4 heures supplémentaires sous agitation à 220 rpm.
- Lire OD 600 valeurs de chaque culture bactérienne sur un spectrophotomètre, et chaque lecture doit aller de 0,6 à 1,2 pour optimiser la pathogénicité de Salmonella île-1 de type III système de sécrétion (SPI-1 SSTT) l'expression du gène de l'invasion.
- Utilisation de la formule 1 DO 600 = 7,5 x 10 8 CFU / ml pour estimer la concentration bactérienne, puis diluer les bactéries à une concentration de 5 x 10 6 UFC / ml dans du milieu de culture cellulaire DMEM frais.
3. Invasion test dans 96 puits Culture Plate
- Retirez trois cel 96 puitsplaques l de culture de l'incubateur à CO 2 et laver chaque puits une fois avec 200 pi de tampon PBS 1x.
- Après le lavage et l'élimination complète de PBS, ajouter 200 ul bactéries dans un milieu DMEM (voir ci-dessus) dans chaque puits. Il en résulte une x 10 6 cellules de Salmonella dans chaque puits et la multiplicité d'infection (MOI) de 20: 1.
- Centrifuger les plaques à 1000 x g dans un véhicule fermé pendant 10 min, puis remplacer les plaques (temps zéro) dans un 37 ° C, 5% CO 2 pendant 30 min. Pour chaque souche, mis en place au moins quatre puits en double.
- Après 30 minutes, enlever les plaques de l'incubateur et laver trois fois avec 200 pi de PBS 1x pour éliminer les bactéries non associés.
- Après le lavage, sauf la plaque marqué par «association» pour un traitement ultérieur. Ajouter 200 ul de milieu DMEM contenant 100 pg / ml de gentamicine dans chaque puits des plaques marquées "invasion" et "reproduction" pour to tuer la bactérie Salmonella extracellulaire. Remettre les plaques à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant une heure supplémentaire.
- Enregistrer un puits de chaque souche infectée pour enregistrer le nombre de cellules macrophages, traiter le reste des puits sur la "association" plaque avec 200 pi de PBS 1x contenant 1% de Triton X-100 pendant 10 min. La solution Triton lyser les cellules macrophages et libérer Salmonella associée.
- Récolte Salmonella dans chaque puits et placez-les dans 1,5 ml tubes Eppendorf. Faites trois séries de dilutions 10 fois avec 900μl 1x PBS sur les échantillons récoltés de chaque puits, vortex est effectué entre chaque dilution.
- Plaque de la troisième dilution, 10 -3, soit sur des plaques de LB (WT) ou LB Kan (mutants). Étiqueter les plaques avec Salmonella nom approprié de souche, nombre de dilution, point de date et heure.
- Après le troisième tube vortex de dilution, distribuer l'échantillon de 10 ul sur la surface de la gélose et de répétition fnotre temps pour un total de 5 gouttes. Assurez-vous de l'espace de cinq 10 pi coule uniformément sur le plat des boîtes de Pétri 7.
- Une fois que les gouttes tremper dans la gélose, les plaques tourner sur et incuber une nuit à 37 ° C, 5% CO 2 incubateur.
- Traiter des puits enregistrés pour le comptage des macrophages avec 150 ul 1xPBS contenant 0,25% de trypsine-EDTA pendant 10 min.
- Après traitement à la trypsine, place des macrophages dans 1,5 ml tubes Eppendorf et les traitent avec 50 ul de FBS pour neutraliser la solution de trypsine / EDTA, colorent les cellules avec 0,4% de bleu de Trypan et marquer leur grâce à l'utilisation hématimètre.
- Lorsque l'incubation d'une heure s'est écoulée, enlever l '"invasion" et "plaques de réplication" de l'incubateur à CO 2, et lavez chaque puits comme «l'étape 3.4".
- Enregistrez le "invasion" plaque pour un traitement ultérieur comme "l'étape 3.6 à 3.12".
- Ajouter 200 ul de milieu DMEM contenant 10 ug / ml de gentamicine àla plaque "de réplication" de maintenir un dégagement de Salmonella dans le milieu extracellulaire. Retour de la plaque à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant une heure supplémentaire de 22,5.
- Le lendemain, retirez la plaque "de réplication" à partir de 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, et lavez chaque puits comme «l'étape 3.4" et les traiter comme des «Etape 3.6 à 3.12".
- Enfin, retirez les plaques de gélose après incubation pendant une nuit dans 37 ° C incubateur et marquer le nombre de colonies bactériennes.
- Une bonne répartition de la colonie doit être comprise entre 10 et 100 colonies, chaque spot contient environ 2 à 20 colonies, il serait difficile de marquer si il y avait plus de 20 colonies sur un seul endroit. Si le nombre est trop faible ou trop élevé, Réensemencement l'échantillon avec 10 dilutions supérieures ou inférieures selon les besoins.
Analyse 4. données
- Calculer les (unités de formation de colonies CFU par ml) de chaque plaque sur la base du placagele volume et le facteur de dilution.
- Déterminer le nombre de Salmonella par des macrophages par le nombre enregistré cellulaire de macrophages de chaque souche.
- Calculer les moyennes géométriques de CFU par des macrophages d'au moins trois expériences indépendantes pour association cellulaire, l'invasion ou de la réplication, respectivement, et en outre à normaliser le WT à la valeur relative.
- Analyser les données d'association, l'invasion et la réplication par t la -test de Student respectivement, en comparant chaque souche WT, et déterminer la signification statistique par la valeur p.
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Representative Results
Afficher les résultats représentatifs (figure 2) après que les données sont tracées sur la base de l'analyse de l'invasion des cellules phagocytaires modifié. Les données comprennent les cinq souches différentes, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A, et B. mutant Δ Inva, connu pour être défectueux pour l'invasion, et ΔphoP connus pour être défectueux pour la réplication 8, sont utilisés comme témoins positifs pour évaluer la validité expérimentale . En effet, dans l'essai d'invasion modifié, un mutant ΔinvA est internalisé mal par les cellules RAW264.7 et un mutant ΔphoP a réduit la réplication après 24 h. Mutants A et B sont des souches représentatives analysés en utilisant ce protocole. Mutant A montre une réduction significative de la réplication (figure 2), semblable à un mutant ΔphoP; intéressante, le mutant B montre une augmentation significative de la réplication (figure 2). Les données indiquent clairement que ces deux mutants ont modifié phénotypes de l'invasion et de la survie dans les macrophages.
En résumé, de nombreux mutants de deletion de Salmonella ont été phénotypés individuellement pour leur implication dans la liaison des bactéries, l'invasion et la réplication dans les macrophages RAW264.7 en utilisant l'essai d'invasion modifié. Vingt des 38 mutants testés jusqu'à présent affiché défauts variables mais significatives dans l'infection bactérienne des macrophages (Tableau 1), ainsi le dosage de modification de phénotype in vitro de Salmonella ou autre association bactérienne, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires augmentent la capacité de précision et à haut débit tout en en réduisant la fatigue de l'opérateur.
Figure 1: schéma de travail de test à haut débit. Essai de protection gentamicine est modifiée, standardisé à phénotype de nombreux mutants de Salmonella simultanément dans des plaques à 96 puits. Les principales étapes sont effectuées comme ci-dessus pour examiner association, l'invasion et la réplication de la bactérie Salmonella dans les cellules RAW264.7 macrophages.
. Figure 2: Les résultats représentatifs Les essais à haut débit sont effectuées pour les souches de Salmonella - WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A, et B mutant - dans les cellules RAW264.7 macrophages. Pour chaque souche, les moyennes géométriques de CFU par des macrophages sont obtenus à partir de trois expériences indépendantes pour association cellulaire, l'invasion et la reproduction, respectivement, qui sont de plus normalisés à la WT et la représentation graphique est représenté. Les barres d'erreur représentent l'erreur-type, et la signification statistique de chaque souche référencésWT a été déterminée par la -test t de Student. * P <0,05. MOI = 20.
Tableau 1: Les phénotypes de gènes candidats. Mutants Salmonella candidats sont phénotypées par la, essai normalisé modifié pour l'association, l'invasion et la réplication dans les cellules macrophages RAW264.7. 20 mutants ont des défauts importants en association, l'invasion et / ou la réplication.
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Discussion
Le test de protection gentamicine est largement utilisée pour étudier l'invasion et la réplication des bactéries pathogènes intracellulaires intérieur cellule hôte, et c'est surtout un outil biologique important pour l'étude des agents pathogènes, comme la salmonelle, dont l'invasion est l'étape préalable à l'établissement infection 1. La protection dosage standard de gentamicine dans la communauté de recherche Salmonella est mis en œuvre dans 24 puits boîte de culture 5. Bien que l'utilisation de 48 ou même des plaques à 96 puits ont été examinés avant pour une grande capacité de débit 9, aucun protocole réel a été démontré en détail et utilisé avec succès pour tester une collection de mutants bactériens. Ici, une modification et protocole standardisé a été développé pour utiliser des boîtes de culture de 96 puits à phénotype des mutants de Salmonella. Notamment, ce protocole n'a été testé que pour les salmonelles et les cellules phagocytaires, ainsi modifications et à l'optimisation serait évidemment nécessaire avec Othe r bactéries ou des cellules hôtes.
Il existe plusieurs avantages à l'essai de protection à la gentamicine phénotype modifié Salmonella association, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires. Tout d'abord, le format de plaque de culture de 96 puits d'essai et permet l'analyse à haut débit, de 10 souches différentes peuvent être testés en même temps que l'analyse statistique et de répétition suffisante des contrôles internes. Deuxièmement, à cause de la grande sensibilité du dosage, les données brutes de l'essai de protection contre la gentamicine peuvent être sensibles à des variations lors de techniques répété à des moments différents. En vertu de ce protocole modifié, plusieurs souches sont phénotypées dans les mêmes conditions au long du processus, de réduire la variance. Enfin, l'utilisation de pipettes multicanaux augmente l'efficacité et réduit la fatigue de l'opérateur. Le nouveau protocole a facilité le phénotypage rapide de nombreux mutants Salmonella tout en générant de grandes quantités de données quantitatives reproductibles.
ove_content "> Une préoccupation en faisant des tests d'invasion dans des boîtes de culture de 96 puits est que les puits contiennent moins de cellules eucaryotes, et à cause de cette quantification pourrait être compromise. Pour répondre à cette préoccupation, une grande série de tests a été effectuée pour optimiser la reproductibilité. Première , les macrophages RAW264.7 utilisées dans ce protocole ont moins de 20 passages, et les cellules ont été ensemencées dans 96 puits de culture plat pendant une nuit avant le dosage Deuxièmement, la MOI a été réduite à 20: 1. l'utilisation régulière de 50: 1 ou 100: 1 A MOI 20:.. 1 assure que 99% des macrophages sera exposé à l'infection par 10 à 30 bactéries calculées par la distribution de Poisson en fonction du point stochastique On pense que, ne se limite pas à des facteurs biologiques, des dommages cellulaires pourrait être . contacts physiques causées par des bactéries écrasante 10 En outre, l'invasion de Salmonella pourraient induire l'apoptose des macrophages, qui est positivement associée à la haute MOI 11 Utilisation d'un MOI de 20. 1, dégâ cellulairee a été jugée minime, probablement en raison de peu de contact physique bactéries macrophages. En troisième lieu, l'intervalle de temps d'incubation a été optimisé pour les trois points dans le temps: association pendant 30 min sans gentamicine; invasion pour plus d'1 heure (total de 1,5 heures après l'infection) avec 100 pg / ml de gentamicine; réplication de 22,5 heures supplémentaires (total de 24 heures après l'infection) avec 10 pg / ml de gentamicine. Dans notre essai, 5 ug / ml de gentamicine est suffisante pour tuer toutes les Salmonella dans du DMEM exempt de cellules avec 10% de sérum bovin fœtal (données non publiées), donc, 100 ug / ml de gentamicine On s'attendrait à assurer la mise à mort rapide et 10 g / ml de gentamicine serait de maintenir le dégagement des bactéries extracellulaires dans le milieu de culture cellulaire pour une nuit d'incubation in vivo, il faut environ 15 min de détecter les tissus Salmonella associé à l'intestin de veau cellules épithéliales 12,13;. in vitro, 30 min d'incubation est signalé à être suffisant pour le type sauvageCe protocole utilise des cellules phagocytaires au lieu de cellules épithéliales pour cet essaidans un format à 96 puits inférieur. Dans l'étude de la pathogenèse de la salmonellose, la ligne de la cellule épithéliale la plus largement utilisée est Caco-2, dérivé de l'adénocarcinome colorectal hétérogène épithéliales humaines. Utilisation de la boîte 24 puits de culture test invasion régulier avec cellules Caco-2, le nombre réel de bactéries récupérées à chaque point de temps, en particulier le point de temps de 22,5 heures pour la réplication de phénotypage, est beaucoup plus faible que lorsque les cellules phagocytaires, comme J774 ou RAW264 0,7 macrophages, sont utilisés (données non publiées). Ainsi, ce qui rend plus difficile l'accomplissement de phénotypage en utilisant une boîte de culture de 96 puits quand chacun a bien moins de cellules hôtes. Il est connu que les cellules macrophages pourraient activement engloutir les bactéries, ce qui pourrait conduire à plus de bactéries étant internalisés, et il a aussi ne peut pas être exclu que Salmonella semble reproduire plus lentement en cellules Caco-2. La capacité de la Salmonella de survivre et de se répliquer à l'intérieur des cellules de type macrophage est liée à un rôle clé dans la pathogenèse de l'salmonellose, c'est à dire, déclenchant massives réponses inflammatoires de l'hôte et de faciliter l'infection systémique 1. Nous avons principalement eu recours à l'essai de protection gentamicine modifié et normalisé au phénotype un grand nombre de pipelines de calcul des gènes sélectionnés pour leurs engagements potentiels dans les interactions hôte. Il s'est avéré que près de 50% des mutants de Salmonella ont été phénotypés en tant que gènes impliqués dans la réplication intracellulaire dans les cellules phagocytaires.
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Acknowledgments
Ce projet a été soutenu en partie par une subvention pour les National Institutes of Health NIAID (pour AJB et LGA, R01 AI076246). La collection de mutants de Salmonella a été financé en partie par les Instituts nationaux de la santé (subventions pour MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 et R01 AI075093-01), en partie par les Instituts nationaux de subventions de la santé (pour HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Nous remercions Steffen Prowollik pour réplique de placage et de confirmer les mutants de la collection.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965 | |
| Fetal bovine serum | HyClone | SH30910.03 | |
| T-75 Cell culture flask vented filter cap | Nest Biotechnology | 708003 | |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| Cell scraper | BD Falcon | 353086 | |
| 96-well Cell culture plate | Corning Incorporated | 3595 | |
| Luria-Bertani (LB) broth | MP Biomedicals | 3002-075 | |
| 14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube | BD Falcon | 352059 | |
| PBS pH 7.4 (1x) | Life Technologies | 10010 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Kanamycin solution | Sigma | K0254 | |
| Gentamicin solution | Sigma | G1272 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 |
References
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