Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Højkapacitetsforskning Assay til Fænotype Published: August 11, 2014 doi: 10.3791/51759
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 4, 1
1Department of Veterinary Pathobiology, College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences, Texas A&M University, 2Department of Microbial and Molecular Pathogenesis, College of Medicine, Texas A&M University System Health Science Center, 3University of California, Irvine, 4Department of Medical Microbiology & Immunology, School of Medicine, University of California, Davis

Summary

En høj-throughput assay til in vitro-fænotype salmonella eller andre bakterielle forening, invasion og replikation i fagocytiske celler med højt gennemløb kapacitet blev udviklet. Metoden blev anvendt til at vurdere Salmonella gen knockout mutantstammer for deres Involvering i værtspatogene interaktioner.

Abstract

Salmonella-arter er zoonotiske patogener og førende årsager til fødevarebårne sygdomme hos mennesker og husdyr 1. Er vigtigt at belyse den molekylære patogenese salmonellainfektion forstå de mekanismer, der ligger til grund Salmonella -host interaktioner. Gentamicin beskyttelse assay til fænotype Salmonella forening, invasion og replikation i fagocytceller blev tilpasset til at tillade højkapacitetsscreening at definere roller deletionsmutanterne Salmonella enterica serotype Typhimurium i værts interaktioner ved hjælp af RAW 264,7 murine makrofager. Ifølge denne protokol, variansen i målingerne er betydeligt reduceret i forhold til standard-protokollen, fordi vildtype-og multiple mutantstammer kan testes på samme dyrkningsskål og på samme tid. Anvendelsen af ​​multikanalpipetter forøger gennemløbet og forbedrer præcision. Endvidere bekymringer vedrørende anvendelse af mindre host brønd i 96-brønds dyrkningsskål blev behandlet. Her blev protokollen af den modificerede in vitro Salmonella invasion under anvendelse fagocytceller anvendt med succes til fænotype 38 individuelle Salmonella deletionsmutanterne for foreningen, invasion og intracellulær replikation. In vitro fænotyper præsenteres, hvoraf nogle senere blev bekræftet at have in vivo fænotyper i en dyremodel. Således, at den modificerede, standardiserede analyse fænotype Salmonella forening, invasion og replikation i makrofager med high-throughput kapacitet kunne udnyttes mere bredt for at studere bakteriel-vært interaktioner.

Introduction

Nontyphoidal Salmonella er vigtige årsager til enteriske sygdomme i alle hvirveldyr. Salmonellose hos mennesker er blandt de øverste bakterielle fødevarebårne sygdomme 1. Karakterisering af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for interaktioner af Salmonella med deres dyreværter opnås primært gennem studiet af Salmonella enterica serotype Typhimurium (STM) i vævskultur og dyremodeller for infektion. Opsamling indsigt i STM-vært interaktioner vil hjælpe os med at forstå, hvordan Salmonella overleve og vokse inde i værtsceller. Den første udfordring i at studere disse interaktioner er at identificere så mange deltagende faktorer som muligt fra både vært og patogen, men disse bestræbelser er i høj grad hindres af de betydelige vanskeligheder ved at håndtere to uafhængige komplekse biologiske systemer samtidigt, dvs vært og Salmonella, under fysiologiske betingelser. Derudover store repertoire af Salmonella og værtsgener potentielt koder for faktorer involveret i værts interaktioner kræver high-throughput biologisk platform til at håndtere denne udfordring.

En modificeret, standardiseret assay fænotype Salmonella forening, invasion og replikation i makrofager med high-throughput kapacitet blev udviklet for at undersøge et stort sæt af gener sandsynligvis deltager i Salmonella -host interaktioner. Gentamicin beskyttelse assay blev udviklet i 1973 2, men blev først grundigt ved Elsinghorst beskrevet i 1994 3,4. Det er nu blevet en standard værktøj til at studere mange intracellulære bakterielle patogener ex vivo, herunder Salmonella 5,6. Internaliserede bakterier undgå at blive dræbt af nogle antibiotika, ligesom gentamicin, der ikke kan trænge eukaryote celler 3. Ved at drage fordel af dette fænomen, gentamicin beskyttelse assayet måler overlevelse og vækst af intracellulært bacterial patogener. Tre begivenheder i løbet af infektion, dvs sammen med eukaryote celler, invasion og replikation, kan vurderes for intracellulære bakterielle patogener, baseret på tidsintervallet mellem infektion, gentamicin behandling, og yderligere inkubation (figur 1). Eukaryote cellelinier giver et fysiologisk miljø, der er mindre kompleks end relevante dyremodeller for vært-patogen interaktionsundersøgelser.

Gentamicin beskyttelse assayet er et godt udgangspunkt for at studere STM-vært interaktioner, men standard-assay i en 24-brønds dyrkningsplade har lav gennemløb kapacitet. Computational analyse af in vivo-datasæt identificeret 149 Salmonella genprodukter, der er forudsagt at interagere med cirka 300 vært genprodukter (upublicerede data). Standarden Gentamicin beskyttelse analysen ikke har kapacitet til at fænotype dette antal mutanter effektivt.

I Addition kan Gentamicin beskyttelse assayet teoretisk detektere invasionen af ​​selv en enkelt bakterie. På grund af denne iboende følsomhed, rådata er modtagelige for tekniske forskelle når gentaget på forskellige tidspunkter. De interne kontroller og relativ præsentation af data efter normalisering er afgørende for en meningsfuld fortolkning af resultaterne. På baggrund af disse overvejelser blev en modificeret, standardiseret Gentamicin beskyttelse assay udviklet til at forbedre test kapacitet og øge præcision.

Følgende protokol er detaljeret og illustreret for at udføre den modificerede Gentamicin beskyttelse under anvendelse af 96-brønds dyrkningsskåle og den murine makrofag RAW264.7 cellelinie. Sammenlignet med standard-protokol i 24-brønds dyrkningsskåle, den modificerede protokol har følgende fordele: 1) Anvendelse af 96 brønde dyrkningsskåle tillader op til 10 forskellige mutantstammer at fænotypebestemmes herunder interne positive og negative kontroller med tilstrækkelig statistisk styrke;2) variation i resultaterne er reduceret betydeligt, fordi de mutante stammer testes i samme dyrkningsskål og på samme tid; 3) Anvendelsen af ​​multikanalpipetter øger hastigheden og operatør træthed reducere. Endelig sammenligner til 24 brønds dyrkningsskåle, blev bekymringer færre værtsceller per brønd i 96-brønds dyrkningsplade løses gennem protokol optimering og standardisering.

Sammenfattende modificerede, standardiserede analyse til in vitro-fænotype Salmonella eller andre bakterielle forening, invasion og replikation i fagocytceller øger præcision og opnår high-throughput kapacitet mens operatør træthed reducere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Murin makrofag RAW264.7 Cellekultur

  1. Grow lavpassage antal murine makrofag celler RAW264.7 (ATCC ® Nummer TIB-71) i en T-75 cellekultur kolbe ventileret filterhætten i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) , 0,5% NaHCO3 og 1% 100x ikke-essentielle aminosyrer (NEAA) ved 37 ° C, i en 5% CO2-inkubator.
  2. Når cellerne når en 60-80% sammenflydning i kolben, skal du bruge en celle skraber til at høste celler og tælle cellerne i en hæmacytometer og beregne koncentrationen i cellen.
  3. Cellerne og fortynde cellekoncentrationen i 2,5 x 10 5 / ml i frisk DMEM cellekulturmedium. Brug multikanalpipetter til pladen 200 pi DMEM cellekulturmedium indeholdende 5 x 10 4 celler i hver brønd i 96 brønds cellekultur-plader.
  4. Plate fire brønde for hver Salmonella stamme. Oprettet tre separate plader for et sætaf fagocytceller invasion assay og markere dem med "forening", "invasion" og "replikation" hhv.
  5. Placer pladerne i 5% CO2-inkubator ved 37 ° C for at tillade makrofagcellerne at fastgøre til bunden af brøndene.

2. Fremstilling af Salmonella Vildtype og mutanter

  1. På den samme dag til fremstilling af makrofag RAW264.7 celler, plukke enkelte kolonier af vildtype (WT) Salmonella enterica serotype Typhimurium-14028s, DinvA mutant, DphoP mutant, og de ​​ønskede test mutantstammerne og kultur dem i Luria-Bertani ( LB) bouillon suppleret med antibiotika som passende. Brug hvert sæt af fagocytceller invasion assays til at teste op til 10 mutantstammer (DinvA mutant og DphoP mutant er defekte i invasion og intracellulær replikation, henholdsvis).
  2. Grow bakterierne i 14 timer ved 37 ° C med filtreHaking ved 220 rpm i 5 ml af hver af LB-bouillon i løst udjævnede 14 ml polypropylen i en rundbundet rør. LB-bouillon indeholder passende antibiotika, i vores tilfælde, de fleste af mutantstammer er resistente over for kanamycin, 50 pg / ml
  3. Den næste dag, videredyrke hver ON kulturer af Salmonella-stammer i almindelige 5 ml LB-bouillon i et forhold på 1:50 i en yderligere 4 timer med omrystning ved 220 rpm.
  4. Læs OD 600 værdier for hvert bakteriekultur på et spektrofotometer, og hver læsning bør ligge fra 0,6 til 1,2 for at optimere Salmonella patogenicitet island-1 type III sekretionssystem (SPI-1 TTSS) genekspression til invasion.
  5. Brug formlen 1 OD 600 = 7,5 x 10 8 CFU / ml til at estimere den bakterielle koncentration, derefter fortyndes bakterier til en koncentration på 5 x 10 6 CFU / ml i frisk DMEM cellekulturmedium.

3. invasion assay i 96-brønds dyrkningsplade

  1. Fjern tre 96-brønds cell dyrkningsplader fra CO2-inkubator og vask hver brønd gang med 200 pi 1x PBS-buffer.
  2. Efter vask og fuldstændig fjernelse af PBS tilsættes 200 ul bakterier i DMEM-medium (se ovenfor) i hver brønd. Dette resulterer i 1 x 10 6 Salmonella celler i hver brønd og multiplicitet af infektion (MOI) på 20: 1.
  3. Centrifuger plader ved 1000 xg i en forseglet bærer i 10 minutter, derefter erstatte plader (tid nul) i et 37 ° C, 5% CO2-inkubator i 30 min. For hver stamme, der er oprettet mindst fire duplikatbrønde.
  4. Efter 30 minutter fjernes pladerne fra inkubatoren og vask tre gange med 200 pi 1x PBS for at fjerne ikke-tilknyttede bakterier.
  5. Efter vask, gemme pladen mærket med "forening" til yderligere behandling. Tilsæt 200 pi DMEM-medium indeholdende 100 ug / ml gentamicin til hver brønd af pladerne markeret med "invasion" og "replikation" for to dræbe ekstracellulære salmonella. tilbage pladerne til 37 ° C, 5% CO2 inkubator i en yderligere time.
  6. Gem en brønd fra hver inficeret stamme til optagelse makrofag celletal, behandle resten af ​​brønde på "associering" plade med 200 pi 1x PBS indeholdende 1% Triton X-100 i 10 min. Triton løsning lysere makrofagceller og slip forbundet salmonella.
  7. Harvest Salmonella fra hver brønd og placere dem i 1,5 ml Eppendorf-rør. Udfør tre 10 fold seriefortyndinger med 900μl 1x PBS på de høstede prøver fra hver brønd, bliver vortex udføres mellem hver fortynding.
  8. Plate den tredje fortynding 10 -3, på enten LB (WT) eller LB Kan (mutanter) plader. Mærk pladerne med passende Salmonella stamme-navn, fortynding nummer, tidspunkt og dato.
  9. Efter omhvirvling tredje fortynding rør, dispensere 10 pi prøve på overfladen af ​​agaren og gentag fvores tider for i alt 5 dråber. Vær sikker på at rummet i fem 10 pi falder jævnt fordelt på petriskålen pladerne 7.
  10. Efter dråberne trænger ned i agar vende pladerne om og inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2-inkubator.
  11. Forkæl brønde gemt til tælling af makrofager med 150 ul 1 x PBS indeholdende 0,25% trypsin-EDTA i 10 min.
  12. Efter trypsinisering, sted makrofager i 1,5 ml Eppendorf-rør, og behandle dem med 50 ul FBS at neutralisere trypsin / EDTA-opløsning, bejdse cellerne med 0,4% trypanblåt og score dem ved at anvende hæmacytometer.
  13. Når den ene timers inkubation er gået, skal du fjerne "invasion" og "replikation" plader fra CO 2 inkubator, og vask hver brønd som "Trin 3.4".
  14. Gem "invasionen" plade til yderligere behandling som "Trin 3,6-3,12".
  15. Tilsæt 200 pi DMEM-medium indeholdende 10 ug / ml gentamicin tilden "replikation" plade til at opretholde clearance af ekstracellulære Salmonella i mediet. Retur pladen til 37 ° C, 5% CO2 inkubator i yderligere 22,5 timer.
  16. Den næste dag, fjerne "replikation" plade fra 37 ° C, 5% CO2-inkubator, og vask hver samt "Trin 3.4" og behandle dem som "Trin 3,6-3,12".
  17. Endelig fjernes agarplader efter inkubation natten over i 37 ° C inkubator og score antallet af bakteriekolonier.
  18. En god koloni fordeling bør være mellem 10 og 100 kolonier, hver plet omtrent indeholder 2 til 20 kolonier, ville det være svært at score, hvis der var mere end 20 kolonier på ét sted. Hvis tallet er for lav eller for høj, replate prøven med 10 gange højere eller lavere fortyndinger efter behov.

4. Data Analysis

  1. Beregn CFU (kolonidannelse enheder pr ml) af hver plade baseret på klædningenvolumen og fortyndingsfaktor.
  2. Fastslå antallet af Salmonella pr makrofag gennem indspillede makrofag celletallet fra hver stamme.
  3. Beregn de geometriske middelværdier for CFU pr makrofag fra mindst tre uafhængige forsøg for celle forening, invasion eller replikation, henholdsvis og normalisere yderligere til WT for den relative værdi.
  4. Analysere data for foreningen, invasion, og replikation ved Students t-test henholdsvis ved at sammenligne hver stamme til WT, og bestemme den statistiske signifikans ved p-værdien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Se repræsentative resultater (figur 2), efter at dataene er plottet baseret på det ændrede fagocytisk celle invasion assay. Dataene omfatter fem forskellige stammer, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A, og mutant B. Δ INVA, der er kendt for at være defekt invasion, og ΔphoP kendt for at være defekt for replikation 8, anvendes som positive kontroller til at vurdere eksperimentelle gyldighed . Faktisk, i den modificerede invasion assay en ΔinvA mutant internaliseres dårligt af RAW264.7-celler, og en ΔphoP mutant havde reduceret replikation efter 24 timer. Mutanter A og B er repræsentative stammer analyseret ved hjælp af denne protokol. Mutant A viser signifikant reduktion af replikation (figur 2), svarende til en ΔphoP mutant; interessant mutant B viser en betydelig stigning i replikation (figur 2). Tallene viser tydeligt, begge af disse mutaNTS har ændret fænotyper for invasion og overlevelse i makrofager.

Sammenfattende blev der talrige Salmonella deletionsmutanterne individuelt fænotypebestemmes for involvering i den bakterielle forening, invasion, og replikation i RAW264.7 makrofager anvendelse af den modificerede invasion analysen. Tyve ud af 38 testede mutanter hidtil vist variable men væsentlige mangler i bakteriel infektion af makrofager (Tabel 1), hvorved den modificerede assay in vitro fænotype Salmonella eller andre bakterielle forening, invasion og replikation i fagocytceller øger præcision og højt gennemløb kapacitet under reducerer træthed hos føreren.

Figur 1
Figur 1. Arbejdsgruppen ordning for high-throughput analyse. Gentamicin beskyttelse analysen er modiceret, standardiseret til fænotype mange Salmonella mutanter samtidigt i plader med 96 brønde. De vigtigste trin udføres som ovenfor for at undersøge forening, invasion og replikation af salmonella i RAW264.7 makrofagceller.

Figur 2
. Figur 2. Repræsentative resultater er high-throughput analyser udført for Salmonella stammer - WT ΔinvA, ΔphoP, mutant A og mutant B - i RAW264.7 makrofagceller. For hver stamme, er de geometriske middelværdier for CFU pr makrofag indhentet fra tre uafhængige forsøg for celle forening, invasion og replikation, henholdsvis, som er yderligere normaliseret til WT og grafisk gengivelse vises. Fejlsøjler betegne standard fejl, og statistisk signifikans af hver stamme refererestil WT blev bestemt ved Students t-test. * P <0,05. MOI = 20.

Tabel 1
Tabel 1. fænotyper af kandidatgener. Ansøgerlandene Salmonella mutanter er fænotypebestemmes med den modificerede, standardiserede analyse for foreningen, invasion og replikation i RAW264.7 makrofagceller. 20 mutanter har betydelige defekter i forening, invasion og / eller replikation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gentamicin beskyttelse analyse er almindeligt anvendt til at undersøge invasion og replikation af intracellulære bakterielle patogener inden værtscelle, og det er især et vigtigt biologisk redskab til at studere patogener, såsom Salmonella, hvis invasion er forudsætningen trin for at etablere infektion 1. Standarden Gentamicin beskyttelse assay i Salmonella forskersamfund er implementeret i 24-brønds dyrkningsskål 5. Selvom anvendelse af 48 eller endda 96-brønds plader blev diskuteret før til high-throughput kapacitet 9 har ingen egentlig protokol blevet påvist i detaljer og med held anvendt til at teste en samling af bakterielle mutanter. Her en modificeret og standardiseret protokol blev udviklet til at anvende 96-brønds dyrkningsskåle fænotype Salmonella mutanter. Især blev denne protokol kun testet for Salmonella og fagocytceller, således ændringer og optimering ville naturligvis være nødvendigt med othe r bakterier eller værtsceller.

Der er flere fordele ved at den modificerede Gentamicin beskyttelse assay til Fænotype Salmonella forening, invasion og replikation i fagocytceller. For det første 96-brønds dyrkningsplade format giver high-throughput afprøvning og analyse, op til 10 forskellige stammer kan testes samtidigt med tilstrækkelig gentagelse statistisk analyse og interne kontroller. For det andet, på grund af den høje følsomhed af analysen, kan de rå data for Gentamicin beskyttelse assayet være modtagelige for tekniske forskelle når gentaget på forskellige tidspunkter. Under dette modificeret protokol, er flere stammer fænotypebestemmes under de samme betingelser i hele processen, hvilket reducerer varians. Endelig er brugen af ​​multikanalpipetter øger effektiviteten og reducerer træthed hos føreren. Den nye protokol lettet hurtig fænotypebestemmelse talrige Salmonella mutanter samtidig skaber store mængder af de kvantitative, reproducerbare data.

ove_content "> En bekymring i at gøre invasion assays i 96-brønds dyrkningsskåle er, at brøndene indeholder færre eukaryote celler, og på grund af denne kvantificering kunne blive kompromitteret. For at løse dette problem, blev en stor serie af analyser udført for at optimere reproducerbarhed. Første De RAW264.7 makrofager, der anvendes i denne protokol havde færre end 20 passager, og cellerne blev podet i 96 brønde dyrkningsskål natten før analysen andet blev MOI reduceret til 20:. 1 fra den bruges regelmæssigt 50: 1 eller 100: 1 A MOI 20:.. 1 sikrer, at 99% af makrofager vil blive udsat for smitte med 10 til 30 bakterier beregnet ved Poisson-fordeling i henhold til den stokastiske punkt Det menes, at ikke begrænset til biologiske faktorer, cellulære skader kunne være . forårsaget af overvældende bakterier fysisk kontakt 10 Derudover kunne Salmonella invasion inducere apoptose af makrofager, som er positivt forbundet med høj MOI 11 Brug en MOI på 20:. 1 cellulær DAMAGe blev fundet at være minimal, formodentlig på grund af begrænsede bakterie-makrofag fysisk kontakt. For det tredje, inkubationstiden intervallet blev optimeret til de tre tidspunkter: forening for 30 minutter med ingen Gentamicin; invasion for yderligere 1 time (i alt 1,5 timer efter infektion) med 100 ug / ml Gentamicin; replikering for yderligere 22,5 timer (i alt 24 timer efter infektion) med 10 ug / ml gentamicin. I vores test, 5 ug / ml Gentamicin er tilstrækkelig til at dræbe alle Salmonella i celle-fri DMEM med 10% føtalt bovint serum (upublicerede data), således, 100 ug / ml gentamicin ville forventes at sikre en hurtig aflivning og 10 g / ml Gentamicin ville opretholde clearance af ekstracellulære bakterier i cellekulturmediet for inkubering natten over in vivo, det tager omkring 15 minutter for at detektere væv forbundet Salmonella med kalvetarm epitelceller 12,13;. in vitro, er 30 min inkubation rapporteret til være tilstrækkelige til vildtype 14. Til standard invasion assay arbejdsbyrden for de første to tidspunkter er ganske intens som følge af vask, seriel fortynding og plettering. Den nøjagtige tidsinterval for hvert tidspunkt blev opnået ved at udnytte multikanalpipetter, da enheden øger operatørens effektivitet og præcision. Derudover blev prøven udstryges ændret efter seriel fortynding, i stedet for udpladning 100 ul og manuelt spredes, 5 separate dråber 10 ul blev udpladet for hver gentagelse godt på plader, som i høj grad reducerer klædningen og øger nøjagtigheden, fordi den endelige optælling per brønd er scoret fra 5 forgyldt prøver. Kollektivt, disse optimering og standardisering procedurer øge reproducerbarheden af ​​assayet, kan forskellige operatører gentagne gange opnå ensartede resultater på forskellige tidspunkter.

Denne protokol beskæftiger fagocytiske celler i stedet for epitelceller til dette assayi en mindre 96-brønds format. Ved at studere patogenesen af ​​salmonellose, den mest udbredte epitelial cellelinje er Caco-2, afledt af heterogene humant epitel kolorektal adenocarcinom. Ved hjælp af regelmæssig 24-brønds dyrkningsplade invasion test med Caco-2-celler, det faktiske antal af genvundne bakterier ved hvert tidspunkt, især 22,5 timers tidspunkt til fænotypebestemmelse replikation, er meget lavere, end når fagocytiske celler, såsom J774 eller RAW264 .7 makrofager, anvendes (upublicerede data). Således dette gør det vanskeligere at udføre fænotypebestemmelse anvendelse af en 96-brønds dyrkningsplade, når hver brønd har færre værtsceller. Det er kendt, at makrofager celler aktivt kunne opsluge bakterier, der kan føre til flere bakterier bliver internaliseret, og det kan heller ikke udelukkes, at salmonella tilsyneladende replikere langsommere i Caco-2-celler. Evnen af Salmonella til at overleve og replikere inde makrofagceller er relateret til nøgleroller i patogenesen afsalmonellose, dvs udløser massive vært betændelse svarene og lette systemisk infektion 1. Vi primært ansat den modificerede og standardiseret Gentamicin beskyttelse assay fænotype et stort sæt af beregning pipeline udvalgte gener til deres potentielle forpligtelser i værtslandene interaktioner. Det viste sig næsten 50% af Salmonella mutanter blev fænotypebestemt som gener, der er involveret i intracellulær replikation i fagocytceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette projekt blev til dels understøttet af et tilskud til National Institutes of Health NIAID (til AJB og LGA, R01 AI076246). Salmonella-mutant samling blev delvist støttet af National Institutes of Health tilskud (for MM, U01 A152237-05, R01 AI07397-01, R01 AI039557-11 og R01 AI075093-01), dels af National Institutes of Health tilskud (for HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Vi takker Steffen Prowollik for replikaudpladning og bekræfter mutanter i samlingen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Life Technologies 11965
Fetal bovine serum HyClone SH30910.03
T-75 Cell culture flask vented filter cap Nest Biotechnology 708003
100x Non-Essential Amino Acids Life Technologies 11140
Cell scraper BD Falcon 353086
96-well Cell culture plate Corning Incorporated 3595
Luria-Bertani (LB) broth MP Biomedicals 3002-075
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tube BD Falcon 352059
PBS pH 7.4 (1x) Life Technologies 10010
Triton X-100 Sigma T-8787
Kanamycin solution Sigma K0254
Gentamicin solution Sigma G1272
0.25% Trypsin-EDTA Life Technologies 25200
Trypan blue Sigma T8154

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. Salmonellae interplay with host cells. Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).
  2. Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).
  3. Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).
  4. Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein. Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).
  5. Behlau, I., Miller, S. I. A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells. J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).
  6. Hueck, C. J., et al. Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins. Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).
  7. Steele-Mortimer, O. Infection of epithelial cells with Salmonella enterica. Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).
  8. Foster, J. W., Spector, M. P. How Salmonella survive against the odds. Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).
  9. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).
  10. Molinari, G., et al. The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells. Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).
  11. Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium. Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).
  12. Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves. Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).
  13. Lawhon, S. D., et al. Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach. PLoS One. 6, e26869 (2011).
  14. Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion. Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).

Tags

Smitsomme sygdomme , forening invasion replikering fænotype intracellulære patogener makrofager
Højkapacitetsforskning Assay til Fænotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Typhimurium Association, Invasion, og replikering i makrofager
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, J., Pugh, R., Laughlin, R. C.,… More

Wu, J., Pugh, R., Laughlin, R. C., Andrews-Polymenis, H., McClelland, M., Bäumler, A. J., Adams, L. G. High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages. J. Vis. Exp. (90), e51759, doi:10.3791/51759 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter