Abstract
En væsentlig del af post-fosterudvikling hos bananfluen, Drosophila melanogaster, finder sted inden for et sæt af SAC-lignende strukturer, der kaldes fantasiens diske. Disse diske giver anledning til en høj procentdel af voksne strukturer, der findes inden den voksne flue. Her beskriver vi en protokol, der er optimeret til at inddrive disse diske og forberede dem til analyse med antistoffer, transkriptionale reportere og protein fælder. Denne procedure er bedst egnet til tynde væv som imaginal discs, men kan let modificeres til anvendelse med tykkere væv, såsom larve hjerne og voksen æggestok. Den skriftlige protokol og tilhørende video vil guide læseren / seeren gennem dissektion af tredje stadie larver, fiksering af væv, og behandling af fantasiens diske med antistoffer. Protokollen kan bruges til at dissekere imaginære diske fra yngre første og andet stadium larver samt. Fordelen ved dette er, at den er forholdsvis kort, og det har væreOr optimeret til høje konservering af det dissekerede væv kvalitet. En anden fordel er, at fiksering procedure, der anvendes fungerer godt med det overvældende antal af antistoffer, der genkender Drosophila-proteiner. Det er vores erfaring, at der er et meget lille antal følsomme antistoffer, der ikke fungerer godt med denne procedure. I disse situationer synes middel til at være at bruge en alternativ fiksering cocktail samtidig med at følge de retningslinjer, som vi har angivet for dissektion trin og antistofinkubationer.
Introduction
For mere end et århundrede bananfluen, Drosophila melanogaster, har været en førende system til at studere udvikling, adfærd og fysiologi. Udvikling i fluen kan inddeles i to brede faser: embryonale og post-embryonale med meget af den sidstnævnte finder sted i monolag epiteler kaldet fantasiens diske 1-3. Tegninger af fantasiens diske blev først udgivet i 1864 af August Weismann som en del af hans brede monografi om insekt udvikling 1. Disse diske begynder deres udvikling under embryogenese, er mønstret i de larvestadier, overleve den massive histolysis af de tidlige puppe stadier, og i sidste ende føre til en høj procentdel af voksne strukturer, der findes inden den voksne flyve 1-14. Under larveudvikling hver disk gør flere kritiske beslutninger om skæbne, form og størrelse. Inden for de første og anden larvernes instars er skiverne opgave at vedtage en primær skæbne, establishing Rumopdelinger vedtagelse den rigtige form og skabe det nødvendige antal celler 15-16. I løbet af tredje larve stadie og tidlig præ-puppestadiet, fantasiens diske fortsat at dele og mønstrede som celler vedtager deres terminale skæbner 16.
Under den tidlige historie Drosophila udviklingsmæssige biologi blev fantasiens diske studeret næsten udelukkende i forbindelse med en normal udvikling og i de begrænsede tilfælde, hvor et tab eller gevinst af funktion mutanten var levedygtig. Brugen af røntgenstråler til at inducere mitotisk rekombination tilladt for letale mutationer, der skal analyseres i cellekloner i larvestadiet og voksne væv. Denne metode er blevet forbedret ved indførelse af transgene metoder til at analysere tab og få af funktion-mutationer i både larvernes og voksne væv. Antallet af antistoffer, transkriptionale reportere og proteinholdigt lokkemiddel til at beskrive den molekylære landskab af vildtype og mutant væv er også constgelige vokser. Ved hjælp af disse molekylære markører til at analysere tab og få af funktion mutant cellekloner har gjort det stadig muligt at opnå en real-time forståelse af, hvordan mutantceller afvige fra deres vildtype fætre under udviklingen. Til korrekt at drage fordel af disse værktøjer og reagenser er det afgørende at have præparater af fantasiens diske, der kan ses, fotograferet og analyseret af høj kvalitet. Målet med dette manuskript er at give en optimeret protokol til isolering og forberedelse af øje-antennal disk-kompleks (figur 1A). Det kan også med held anvendes til at isolere en lang række yderligere diske, herunder dem, der giver anledning til vinger, halteres, T1-T3 ben og kønsorganerne (Figur 1B-E). Denne procedure, med mindre modifikationer, er blevet anvendt til at isolere imaginære diske fra Drosophila i næsten 80 år.
Som beskrevet ovenfor, eftersom de fleste gener udtrykkes i multiple udviklingsstadier og i et væld af væv, er det ofte umuligt at undersøge de virkninger, som nulmutanter har på hele øjet som dyret dør længe før tredje stadie larvestadiet. Fire metoder har gjort undersøgelse af mere udviklede væv, såsom nethinden betydeligt mere medgørlige. Den første er Flippase (FLP) / Flippase rekombination Target (FRT) fremgangsmåde til generering af mutante cellekloner i en ellers vildtype væv 17-19. I dette tilfælde mutant væv identificeres ved fraværet af en visuel markør, såsom grønt fluorescerende protein (GFP) og kan sammenlignes med det omgivende vildtype væv, hvori GFP er til stede (figur 2D). Den anden er "FLP-out" metode, hvor et transgen udtrykkes i en population af celler 20. I dette tilfælde de cellekloner identificeret ved tilstedeværelsen af GFP og i forhold til det omgivende vildtype væv, der mangler GFP reporter (figur2E). Den tredje er den mosaiske Analyse med en repressibel cellemarkør (MARCM) teknik, der kombinerer elementer af FLP / FRT mutant klon og FLP-out ekspressionssystemer 21. Med denne metode et transgen kan udtrykkes i en population af celler, som samtidig er mutant for et enkelt genetisk locus. Ligesom FLP-ud kloner er MARCM kloner identificeres ved tilstedeværelsen af GFP og i forhold til det omgivende vildtype væv, der mangler GFP markør (figur 2F). Og endelig kan de gener og RNAi konstruktioner udtrykkes indenfor fantasiens væv under kontrol af specifikke promotor-GAL4 konstruktioner. Disse fire metoder har øget interessen for at studere fantasiens diske siden mutant eller overekspression kloner eller mønstre kan direkte sammenlignes med tilstødende vildtype væv. Beskrevet i denne procedure metode er udviklet således, at forskere, der studerer den post-embryonale udvikling af voksent væv i Drosophila,især dem, der stammer fra øjet-antennal disk, vil være i stand til at opnå væv af høj kvalitet til analyse. Selv om de enkelte forskere har lavet mindre ændringer, er kernen i denne procedure (som vi beskriver her) forblev stort set uændret. Da opnåelse af væv af høj kvalitet er afgørende for studiet af fantasiens diske vi håber denne skriftlige protokol og tilhørende video vil fungere som en værdifuld ressource i undervisningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af Larver
- Fyld en 35 mm petriskål med dissektion buffer.
- Placer larver i petriskål og give dem mulighed for at svømme rundt i et par minutter (selvrensende trin).
- Overførsel larver til en pulje af dissektion buffer på et silikonebaseret dissektion plade. Denne pulje bør være ved en kant af pladen. Dissektion plade består af en silikone løsning, der er hældt og hærdet i et glas petriskål.
- Ved hjælp af en Pasteur-pipette, placere en større pulje af dissektion buffer i midten af dissektion plade.
- Brug af # 5 pincet, overføre et enkelt renset larve fra den lille pool til de større pulje af dissektion buffer.
2. Grov Dissektion af larver
- Mens larve er stadig inden for den store pulje af dissektion buffer hægte larve med pincet. En tang bør anvendes til at få munden kroge, mens den anden tang bruges til at holde den Animal stadig (få fat larve forsigtigt ved 1/3 kropslængde).
- Hold stabilisere tang indeholder kutikula nær munden kroge mens hurtigt at trække resten af kroppen væk med det andet par af pincet.
- Når larven begynder at rive fra hinanden, vil du føle en let udgivelse i spænding. Slip larve fra pincet og tage hensyn til de "tarme" af larve til spill ud. Dette giver mulighed for fantasiens diske til at forblive i deres normale kropsbygning og forhindrer dem i at blive deformeret.
- Med en tang forstå munden kroge igen for at holde den forreste ende af larve på plads. Brug af den anden tang fjern den nederste 2/3 af larver, herunder de indvendige indvolde. Bemærk: et kompleks indeholdende munden kroge, eye-antennal diske, hjernehalvdele, ventrale ganglion, spytkirtlerne, nogle ben diske, og den overliggende neglebånd vil forblive.
- Med en pincet forsigtigt fjerne overliggende neglebånd, spytkirtlerne, ben diske ogandet væv. Bemærk: Kun væv, der bør forblive er munden kroge, eye-antennal diske, hjernehalvdele, og ventrale ganglion (Figur 3).
- Gentag trin 2,1-2,5 med yderligere larver i 15-20 min. Bemærk: fantasiens diske, der forbliver i dissektion buffer i længere perioder har tendens til at nedbryde og i sidste ende vil fremstå som mindre end ideelle prøver at blive fotograferet. Således efter højst 20 minutter alle dissekerede væv skal overføres til PLP fiksativ (se nedenfor).
3. fiksering og farvning af væv med antistoffer
- Ved hjælp af en P-200 Pipetman, overføre dissekerede væv til et urglas indeholdende kold Paraformaldehyd-lysin-Periodat (PLP) fiksativ. Begræns mængden af overført dissektion buffer til 50 pi at minimere fortynding af PLP. Vær sikker på at skære spidsen med et barberblad, så spidsen åbningen er stor nok til at rumme de dissekerede væv. Ved hjælp af en pincet elleren wolfram nål sikre, at de dissekerede væv er helt nedsænket, for korrekt fiksering at forekomme. Inkubér dissekerede væv i kold PLP fiksativ i 45 min. Denne inkubation kan finde sted ved stuetemperatur uden omrøring.
- Ved hjælp af en P-200 Pipetman, overføre dissekerede væv at vaske buffer (RT) ved hjælp af en anden cut gul spids i 45 min. Begræns mængden af overført PLP til 50 pi for at minimere fortynding af vaskebuffer. Bemærk: alle dissekerede væv skal helt neddykket.
- Overfør 20-30 sæt dissekeret væv til 1,5 ml mikrofugerør. Bemærk: Hvis et større antal af øjet-antennal disc komplekser kombineres inden i røret, er der en mulighed for, at vævet i bunden af røret ikke vil blive udsat korrekt til antistofferne. For at opnå optimale resultater højst 20-30 eye-antennal disc komplekser bør være til stede i et enkelt rør. Det dissekerede væv vil sedimentere til bunden af mikrofugerør. Derfor, i efterfølgende trin uSE en Pipetman at fjerne og udskifte vaskebuffer, blokerende opløsning, og antistoffer.
- Fjern vaskebuffer og erstat med 100 ul blokerende opløsning: 10% normalt gedeserum i vaskebuffer. Der inkuberes ved stuetemperatur med forsigtig rotation på en bordplade rotator i 10 minutter.
- Fjern blokerende opløsning og erstatte med 100 ul primære antistoffer, der er blevet passende fortyndet i 10% normalt gedeserum. Der inkuberes ved stuetemperatur med forsigtig rotation i 16 timer.
- Fjern primære antistoffer og erstatte med 750 ul vaskebuffer. Rørene anbringes på et nutator og tillade at nutate ved stuetemperatur i 10 min. Bemærk: Det primære antistof kan gemmes (opbevares ved 4 ° C) og genbruges senere. Genbrug antistoffer flere gange kan hjælpe med at reducere ikke-specifik binding.
- Tillad hoveder til at sedimentere til bunden af røret, fjern derefter vaskebuffer, og 100 pi af sekundære antistoffer, som er blevet passende fortyndet i 10% normalt serum. Der inkuberes ved stuetemperatur med forsigtig rotation til 2̵1, 4 timer.
- Fjern sekundært antistof-løsninger fra væv og erstatte med 500 ul vaskebuffer. Tillad væv at sedimentere til bunden af røret.
- Ved hjælp af en P-200 og et snit gul spids, overføre alle dissekerede væv til en pulje af vaskebuffer, der er blevet placeret på dissekere fad. Mens der fortsættes med næste trin af fine dissektion, vil vævet inkuberes i vaskebuffer. Dette medvirker til at fjerne overskydende sekundære antistoffer.
4. Fin Dissektion af Eye-Antennal Disc komplekser og montering på lysbilleder
- Brug en tang til at hægte neglebånd ved munden kroge med den ventrale side af komplekset vender nedad. Med et andet par pincet fjerne hjernens to lapper ved at lukke den anden pincet i mellemrummet mellem hjerne og øjne diske (figur 3, rød pil) og hurtigt trække hjernen væk fra munden kroge.
- Samtidig med at holde fast i munden kroge, knivspids offvæv så tæt som muligt på forbindelsen mellem antennal del af øjet antennal skive og munden kroge (Figur 3, blå pil). Bemærk: Eye-antennal disc komplekser skal være fri for alle væv (figur 1A). Fortsæt indtil alle ønskede væv ønskes, kan anbringes på objektglas er blevet dissekeret. Denne protokol kan tilpasses til at isolere fløj, haltere, ben og kønsorganer fantasiens diske (Figur 1B-E).
- Tilsæt to små stykker silkepapir (størrelse af dækglas) Ca. 3 i. Fra hinanden på dissekere fad. Placer en glasplade på skålen - de to stykker tissuepapir bør være under enderne af objektglasset. Dette vil forhindre dias klistrer til silikone bunden af dissekere fad.
- Ved hjælp af en P-20 med en uslebne spids tilsættes 9 pi af et anti-blegemiddel til midten af objektglas. Dette forhindrer blegning af vævet, når de ses med fluorescerendelys.
- Brug af samme uslebne spids, samle alle eye-antennal diske og tilføje dem til drop af anti-blegning reagens. Minimere mængden af vaske buffer, der fremføres. Prøv at begrænse mængden af vaskebuffer til 10 pi eller derunder.
- Brug en pincet til at adskille og sprede eye-antennal diske i drop af anti-blegning reagens. Tillad diske til at inkubere i anti-blegning reagens til flere minutter. Bemærk: diske vil vende klart som vævet absorberer anti-blegning reagens.
- Ved hjælp af en fin pensel forsigtigt sænke en dækglas på prøven. Dette forhindrer dannelsen af luftbobler.
- Opbevar glider ved -20 ° C indtil den er klar til at se øje-antennal eller andre fantasiens diske med lys eller fluorescerende mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den metode, der er beskrevet ovenfor, pålideligt producerer materiale af høj kvalitet til analyse med in situ-prober, transkriptionale reportere, protein fælder og antistoffer. I figur 1 viser vi øje-antenne, kønsorganer, fløj, haltere og ben diske, der er rutinemæssigt inddrives med denne metode. Disse skiver har været behandlet med et phalloidin-konjugeret fluorofor, som binder til F-actin, og derfor beskriver hver celle. Hvis vævet er blevet ordentligt fast derefter morfogenetiske fure i øjet disken kanterne af koncentriske væv foldes på genital, antennal og ben diske, og den dorsale-ventrale akse vinge og haltere diske alle vises som skarpe kanter . Hvis en væv fikseres ordentligt så antistoffer, fluorescerende proteiner og in situ-sonder vil også afsløre skarpe mønstre. Flere eksempler er vist i figur 2. De øverste tre paneler display diske, der er farvet med forskellige antistoffer, mens dentre lavere paneler viser diske, hvor GFP, der markerer populationer af celler.
Et af de mest slående træk i øjet-antennal disk er den morfogenetiske fure (figur 1A), som kan ses som en fordybning i vævet løber langs ryggens-ventrale akse 1, 22. Forud for tredje larve stadie alle celler i udviklingslandene øje er umønstret, udifferentieret og morfologisk ikke kan skelnes fra hinanden. Ved starten af den tredje larvestadiet stadie initierer morfogenetiske fure ved den bageste kant af feltet øjet og skrider fortil mod øjet / antennal kant 22. Som furen skrider tværs af feltet øje havet af uordnede celler er omdannet til en ordnet række af periodisk afstand unit øjne eller ommatidia (figur 1A) 22-23. Forud for fure et genregulatorisk netværk, der omfatter Pax6- homolog Eyeless (Ey) kanaler cellermod et øje skæbne (figur 2A) 15. Indledningen og progression af furen i sig selv er afhængig af aktiviteterne i Hedgehog (hh) og decapentaplegic (DPP) signalveje 24-29. Faktisk en DPP-lacZ reporter trofast afspejler udtryk for DPP locus i furen (figur 2B) 30-31. Som celler forlade furen og begynder at vedtage deres terminale skæbner, de udtrykker celle specifikke markører, såsom embryonale dødbringende synsforstyrrelser (elav), som koder for et pan-neuronal RNA-bindende protein (figur 2C) 32-34.
Figur 1. fantasiens skiver af Drosophila melanogaster. (
Figur 2. Klonale og udtryk analyse af øjet fantasiens skive (A - F). Konfokale billeder af øjet fantasiens diske. (A) Pax6- protein Eyeless (Ey) fordeles bredt foran morfogenetiske fure. (B) en DPP-lacZ transkriptionel reporteR reagerer på Hh-signalering og udtrykkes i morfogenetiske fure. (C) Det fælleseuropæiske neuronal RNA-bindende protein Elav distribueres i alle udviklingslande fotoreceptorer bag morfogenetiske fure. (D) Et øje disc med tab af funktion kloner genereret af FLP / FRT-systemet. Klonerne identificeres ved manglen af GFP (E). Et øje disk, der indeholder over-ekspression kloner dannet med FLP-ud-system. Kloner er positivt markeret med GFP. (F) Et øje disc med MARCM kloner. Ligesom FLP-ud system kan MARCM kloner identificeres ved tilstedeværelsen af GFP. Alle detekterede proteiner og genotyper er angivet i figuren. Anterior er til højre og dorsale er op.
Figur 3. Eye-antenne-hjerne-kompleks. Et schematic tegning af den første dag grove dissektion produkter. De eneste væv, der skal fastsættes, er munden kroge, øjen-antenne diske og hjerne (ofte gange den ventrale ganglion bliver siddende samt - ikke vist). Lilla = hjerne, grøn = øje-antenne diske, Brun = munden kroge. Anterior er til højre. Hvis dissekering ben, fløj, haltere og kønsorganer diske skal ydre neglebånd af larve stadig være knyttet til disse væv. Fjern ikke den overliggende neglebånd, som du kan miste fantasiens diske under efterfølgende overførsler gennem forskellige antistof, blokere og vask løsninger. Den overskydende væv kan fjernes i løbet af de fine dissektion trin (4,1-4,2).
Figur 4. Placering af fantasiens diske i Drosophila larve. Et skematic tegning af den relative position af de øje-antenne, ben, fløj, haltere og kønsorganer diske i et tredje stadie larve. Øjet-antennal disk er farvet i grønt, benet diske er i blå, grimen disken er i lilla, vingen disken er i brun / orange og den genitale disken er i lys brun. Anterior er til højre.
| Navn Løsning |
| 8% Paraformaldehyd |
| 0,2 M natriumphosphat monobasisk |
| 0,2 M natriumphosphat Disbasic |
| 1 N natriumhydroxid |
| 10% Triton |
| 0,1 M natriumphosphatpuffer (Dissektion Buffer) |
| 0,1 M natriumphosphatbuffer + 0,1% Triton (vaskebuffer) |
| Lysin Buffer |
| 2% paraformaldehyd-lysin-Periodat Fixative (PLP) |
| 10% normalt gedeserum |
Tabel 1: Liste over Krævede Solutions.
| 8% Paraformaldehyd stamopløsning |
| I en 50 ml Erlenmeyerkolbe tilføje følgende: |
| 2,0 g paraformaldehyd |
| 23,0 ml destilleret vand |
| 4,0 dråber 1 N natriumhydroxid (fra et glas pasteurpipette) |
| Mix og varme på en omrøringsplade indtil opløsningen når en blid kog |
| Lad det forsigtigt koge indtil paraformaldehyd er helt opløst |
| Placer på is, indtil koldt (gøre frisk før hver dissektion) |
| 0,1 M phosphatpuffer (Dissektion (P) Buffer) |
| Til en 50 ml konisk rør tilføjes følgende: |
| 18,0 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat |
| 7,0 ml 0,2 M natriumphosphat monobasisk |
| 25,0 ml destilleret vand |
| Opbevares ved 4 ° C (1 uge holdbarhed) |
| 0,1 M fosfat + detergentbuffer (Wash (W) Buffer) |
| Til en 50ml konisk rør tilføje følgende: |
| 18,0 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat |
| 7,0 ml 0,2 M natriumphosphat monobasisk |
| 25,0 ml destilleret vand |
| 0,5 ml 10% Triton |
| Opbevares ved stuetemperatur (1 uge holdbarhed) |
| Lysin (L) puffer |
| Til en 50 ml konisk rør tilføjes følgende: |
| 0,4 g lysin |
| 1,2 ml 0,2 M Dinatriumhydrogenphosphat |
| 8,0 ml Dissektion (P) puffer |
| 10,0 ml destilleret vand |
| Ryst løsning indtil lysin er helt opløst |
| Placer på is, indtil koldt (gøre frisk før hver dissektion) |
| 2% Paraformaldehyd - lysin - Periodat (PLP) fiksativ |
| 0,1 g natriumperiodat |
| 15,0 ml lysin (L) puffer |
| 5,0 ml 8% Paraformaldehyd |
| Ryst opløsningen godt, indtil natrium periodat er fuldstændig opløst |
| Placer på is, indtil koldt (gøre frisk før hver dissektion) |
Tabel 2: Opskrifter til efterspurgte løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om denne fremgangsmåde i høj grad har fokuseret på isolation og efterfølgende behandling af øjet-antennal diske, er det muligt at foretage en bruges til at isolere og analysere fløj, haltere, ben og genitale diske (Figur 4). Den eneste nødvendige ændring af protokollen for at isolere disse diske (i modsætning til den øje-antennal disk) er metoden for grov dissektion (afsnit 2 i protokollen). Den første thorax ben (T1) par er fundet ved den forreste af larve og kan udvindes ved at følge protokollen for øje-antennal disk isolation. Men den anden thorax ben (T2) diske er knyttet til neglebånd. For at isolere disse diske en pincet bør anvendes til at holde munden kroge (som beskrevet ovenfor), mens en anden tang skal bruges til at hægte den ventrale neglebånd af dyret (sørg for at hægte larve omkring 1/3 fra munden kroge. Larven kan simpelthen mørbrad ved at rive den ventrale kutikula væk fra resten af larva. T2 ben vil blive siddende på neglebånd. Den tredje thorax (T3) ben er fastgjort til vingen og haltere diske som en del af et kompleks, som i sig selv er også fastgjort til neglebånd. Du kan vælge at adskille komplekse disken og T2 benene fra neglebånd på dette tidspunkt, eller beholde den komplekse neglebånd-disk sammen under de efterfølgende rentebindingsperiode / antistof inkubationstrinnene og isolere de diske under den fine dissektion del af proceduren (afsnit 4) . For inddrivelse genitale diske, er det bedst at forstå larver på midtersektionen med en tang, og så skræl den ventrale neglebånd væk med det andet par pincet starter ved midtersektionen og slutter ved den bageste ende af larve. Det anbefales, at tang kan bruges til at rydde al uvedkommende væv og derefter overføre bare genital disken til fikseringsopløsning ved hjælp af en P-200 Pipetman og en gul spids, hvis ende er blevet skåret med et barberblad.
Denne procedure er bedst egnet til Tissdier af begrænset tykkelse såsom fantasiens diske og fungerer bedst, hvis antistofferne bliver brugt er af høj titer og specificitet. Det kan imidlertid være indrettet til at arbejde godt sammen med tykkere væv, såsom den voksne ovarie, testikel, og hjernen, såvel som med lave antistoftitre eller dem, der giver højere end ønsket "baggrund" farvning. Ved arbejde med tykkere væv, foreslås det, at optimale resultater kan opnås ved blot at forøge koncentrationen af paraformaldehyd og / eller inkubering i PLP fiksativ i længere perioder. Da korrekt fiksering af dissekerede væv er afgørende for succes med denne protokol er det også foreslået, at effektiviteten af stigende paraformaldehydet koncentration og / eller forøgelse af fiksering længde vurderes med phalloidin (figur 1). Især bør man være betalt til "skarphed" af celle konturer og andre fysiske kendetegn i vævet (dvs. morphogenetic fure). En anden måde at sikre, at din væv (især tykkere prøver) er fastgjort ordentligt, er at forberede 8% paraformaldehyd og PLP løsninger frisk før hver dissektion. Og endelig kan den overordnede kvalitet af dissektion øges, hvis væv dissekeres i korte perioder og væv overføres til fiksativ så hurtigt som muligt. Det foreslås, at dissekere ikke længere end 15-20 min. Dissekere kortere varigheder øger kvaliteten af væv konservering.
Denne protokol fungerer godt med en bred vifte af antistoffer, men det er rigtigt, at nogle antistoffer ikke fungerer godt med PLP fiksativ. Et berygtet eksempel er antistof, der genkender Rough (RO) transskription faktor. Groft udtrykkes i og er nødvendig til specifikation af en delmængde af at udvikle fotoreceptorer 35. Den anti-Ro-antistof fungerer bedst, ikke med PLP, men snarere med et rør - EGTA - MgSO4 (PEM) Buffer 36. Tilsvarende kan andre antistoffer virker bedst på væv, der er blevet inkuberet i endnu andre fikseringsmidler. Det foreslås, at, medmindre andet er angivet, skal PLP fiksativ være forsøgt først. Hvis det ikke lykkes så processen med at finde en alternativ fiksativ skal begynde.
Et fælles problem at konfrontere er koncentrationen af antistoffet pågældende arbejde. Ofte gange du kan være den første forsker til at bruge en bestemt antistof til påvisning af proteiner i dit væv af interesse. Arbejdsgruppen koncentration kan afvige fra, hvad der er rapporteret for andre væv. Det foreslås, at den anbefalede koncentration være forsøgt først. Øge koncentrationen af antistoffet, hvis et signal ikke kan ses. På den anden side, hvis den anbefalede koncentration giver høj baggrundsfarvning derefter fortynde antistoffet bør være forsøgt. Arbejdstid koncentrationer blandt antistoffer kan variere. For eksempel er anti-Eyes Fraværende (Eya) antistof fortyndet 1: 5, mens anti-Elav antistof virker godt, selv ved en 1: 500 fortynding. Nogle antistoffer kan endog blive svækket så langt ned som 1: 3.000. Derudover denne procedure, som skrevet, fungerer bedst med høj specificitet antistoffer. Men som mange har oplevet, kan nogle antistoffer binder uspecifikt til vævet, og dette kan skabe en suboptimal billede. Denne situation kan ofte korrigeres ved at inkubere det fortyndede antistof med faste embryoner eller larvernes slagtekroppe før føjes til de faste fantasiens diske. Afhængig af omfanget af ikke-specifik baggrund farvning, kan den nødvendige længde af "pre-absorption" varierer, og bliver nødt til at være udarbejdet på forsøgsbasis. Det er også muligt at øge signal / støj-forholdet ved at genbruge antistoffer flere gange eller ved at udføre flere runder af præ-absorption.
Når det besluttes, hvilke diske skal bruges i publikationer og / eller præsentationer, er det bedst at vælge diske, der er orienteret med den apikale side orienteret op afdelinger. Det er også bedst at bruge diske, der ikke er foldet. Dette er især tilfældet i øjet-antennal disk. Den ventrale side af disken er tilbøjelig til at folde og desværre er der ikke meget man kan gøre for at forhindre dette i at ske. En løsning er at dissekere yngre diske, da disse har tendens til at folde langt mindre. En anden mulighed er at bare dissekere et stort antal diske, indtil du får en, der er helt flad. Den overordnede form af øjet-antennal disk kan blive påvirket af den hastighed, hvormed larven er revet fra hinanden. Hvis man trækker larve fra hinanden for hurtigt hul, hvorigennem den komplekse hjerne-disk gennemløb er lille og øje-antennal disk kommer ud foldet og / eller strakt. Det er bedst at trække langsomt, indtil larve begynder at rive da hullet bliver større. Derefter kan du fortsætte med at trække hjerne-øje-antennal disk kompleks langsomt. Husk, at du aldrig kan trække for langsomt. Bemærk også, at den hastighed, hvormed du rive væv er ikke en faktor i isoleringen af andre væv.
ve_content "> Livscyklus Drosophila består af tre larvestadie. Vigtige udviklingsmæssige begivenheder finder sted i løbet af hver af disse faser, og dermed kan det være vigtigt at isolere væv ikke bare fra tredjelande larvernes instars (som er det vigtigste fokus i denne procedure) men også fra både første og anden larve instars så godt. Med én mindre undtagelse, kan denne fremgangsmåde anvendes, som skrevet, at isolere andet stadium diske. Under den fine dissektion del af proceduren (afsnit 4), anbefales det at skarp wolfram ledning skal anvendes til at adskille øjet-antennal disk fra uvedkommende væv ligesom munden kroge, hjerne og spytkirtler. Wolfram tråd kan også bruges til at adskille T2 / T3 ben, vinge og haltere diske fra hinanden, og den overliggende kutikula . Det anbefales, at den ene ende af wolframtråd (den ende, der vil blive brugt til at adskille væv) skærpes ved opvarmning i et kogende natriumnitrat bad Den anden ende kan indsættes i en utrolig skruestik;. ther vil give dig mulighed for lettere at holde wolfram tråd. Desværre er det betydeligt vanskeligere at isolere intakte første stadiums diske, hvorfor det anbefales, at du placerer hele øjet-antennal disk / hjerne / mund krog kompleks på dias og dække med et dækglas. Mængden af dissekerede væv kan minimeres ved hjælp af en skarp wolfram tråd at fjerne spytkirtlerne og overliggende neglebånd før montering af disken / hjerne / mund krog kompleks på diaset. Det er relativt let at identificere den første instar eye-antennal disken, når det stadig er fastgjort til hjernen og munden kroge (se figur 6A, D Kumar og Moses, 2001) 37. De andre fantasiens diske skal adskilles fra neglebånd og placeres på et dias til visning.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Anders Ready og Kevin Moses til undervisning JPK den oprindelige fantasiens disk dissektion procedure. Vi takker også Bonnie Weasner for genital disk i figur 1B og øjet disken i figur 2A, Brandon Weasner til figur 3, Bloomington Drosophila Stock Center for flyve pletter og Developmental Studies Hybridom Bank for antistoffer. CMS er blevet støttet af et stipendium fra National Institutes of Health (NIH) GCMS Training Grant (T32-GM007757), Frank W. Putnam Research Fellowship, og Robert Briggs Research Fellowship. JPK er støttet af en bevilling fra National Eye Institute (R01 EY014863)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5 KG | Used to create base for dissection plate |
| Pryex Glass Petri Dish 150 x 20 mm | Dow Corning | 3160-152CO | Use the cover for dissection plate |
| #5 Dissecting Forceps | Ted Pella | 525 | Forceps must be kept very sharp |
| 9 well watch glass | Vairous Vendors | Used for fixation of imaginal disc complexes | |
| 50 ml Erlenmeyer Flask | Various Vendors | ||
| Small Stir Bar | Various Vendors | Small enough to fit into Erlenmeyer Flask | |
| 50 ml Conical Tubes | Various Vendors | ||
| 1.5 ml Microfuge Tubes | Various Vendors | Clear or Dark depending upon application | |
| Microfuge Rack | Various Vendors | ||
| Benchtop Rotator | Various Vendors | 100 μl volume should not splatter at low setting | |
| Paraformaldehyde | Macron Chemicals | 2-26555-1 | Serves as fixative |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Chemical Co | S-3139 | Used to make dissection and wash buffers |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Chemical Co | 71636 | Used to make dissection and wash buffers |
| Lysine | Acros Organics | 125221000 | Used in the fixative solution |
| Sodium Periodate | Sigma Chemical Co | S-1878 | Used in the fixative solution |
| Triton X-100 | EMD Chemicals | MTX1568-1 | Used to perforate imaginal discs |
| Sodium Hydroxide | EM Science | SX0593-3 | Used to dissolve paraformaldehyde |
| 100% Normal Goat Serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | Serves as a blocking solution |
| Primary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Secondary Antibodies | Various Vendors | Dilute in 10% goat serum as directed by manufacturer | |
| Vectashield | Molecular Probes | H-1000 | Prevents bleaching of samples |
| Microscope Slides | Fischer Scientific | 48312-003 | |
| Glass Cover Slips 18 x 18 mm | Fischer Scientific | 12-542A | |
| Kimwipe Tissue | Various Vendors | Prevents Glass slides from adhering to silicone base | |
| Panit Brush 000 | Various Vendors | Use to gently lower coverslip on to samples |
References
- Weismann, A. Die nachembryonale entwicklung der Musciden nach beobachtungen an Musca vomitoria und Sarcophaga carnaria. Zeit. Wiss. Zool. 14, 187-336 Forthcoming.
- Cohen, S. M. Imaginal disc development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 747-841 (1993).
- Held, L. I. Imaginal Discs: The Genetic and Cellular Logic of Pattern Formation. Developmental and Cell Biology Series. 39, Cambridge Press. 460 (2002).
- Miall, L. C., Hammond, A. R. The development of the head of the imago of Chironomus. Trans. Linn. Soc. Zool. 5, 265-279 Forthcoming.
- Kellog, V. L. The development and homologies of the mouth parts of insects. Am. Nat. 36, 683-706 (1902).
- Eassa, Y. E. E. The development of imaginal buds in the head of Pieris brassicae Linn. (Lepidoptera). Trans. R. Entomol. Soc. Lond. 104, 39-51 (1953).
- Bryant, P. J., Schneiderman, H. A. Cell lineage, growth, and determination in the imaginal leg discs of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 20, DOI. 263-290 (1969).
- Postlethwait, J. H., Schneiderman, H. A. A clonal analysis of development in Drosophila melanogaster: morphogenesis, determination and growth in the wild type antenna. Dev. Biol. 24, 477-519 (1971).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 165-242 (1972).
- Anderson, D. T. The development of hemimetabolous insects. Developmental Systems. Counce, S., Waddington, C. H. , Academic Press. New York. 96-163 (1972).
- Crick, F. H. C., Lawrence, P. A. Compartments and polyclones in insect development. Science. 189, 340-347 (1975).
- Wieschaus, E., Gehring, W. Clonal analysis of primordial disc cells in the early embryo of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 50 (2), 249-263 (1976).
- Lawrence, P. A., Morata, G. The early development of mesothoracic compartments in Drosophila. An analysis of cell lineage and fate mapping and an assessment of methods. Dev Biol. 56 (1), 40-51 (1977).
- Madhaven, M. M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux Archive. 183, 269-305 (1977).
- Kumar, J. P. Retinal determination the beginning of eye development. Curr Top Dev Biol. 93, 1-28 (2010).
- Kumar, J. P. My what big eyes you have: how the Drosophila retina grows. Dev Neurobiol. 71 (12), 1133-1152 (2011).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117 (4), 1223-1237 (1993).
- Duffy, J. B., Harrison, D. A., Perrimon, N. Identifying loci required for follicular patterning using directed mosaics. Development. 125 (12), 2263-2271 (1998).
- Ito, K., et al. The Drosophila mushroom body is a quadruple structure of clonal units each of which contains a virtually identical set of neurones and glial cells. Development. 124 (4), 761-771 (1997).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).
- Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice. Dev. Biol. 53, 217-240 (1976).
- Wolff, T., Ready, D. F. The beginning of pattern formation in the Drosophila compound eye: the morphogenetic furrow and the second mitotic wave. Development. 113, 841-850 (1991).
- Heberlein, U., Wolff, T., Rubin, G. M. The TGF beta homolog dpp and the segment polarity gene hedgehog are required for propagation of a morphogenetic wave in the Drosophila retina. Cell. 75, 913-926 (1993).
- Ma, C., et al. The segment polarity gene hedgehog is required for progression of the morphogenetic furrow in the developing Drosophila eye. Cell. 75, 927-938 (1993).
- Heberlein, U., et al. Growth and differentiation in the Drosophila eye coordinated by hedgehog. Nature. 373, 709-711 (1995).
- Dominguez, M., Hafen, E. Hedgehog directly controls initiation and propagation of retinal differentiation in the Drosophila eye. Genes Dev. 11, 3254-3264 (1997).
- Pignoni, F., Zipursky, S. L. Induction of Drosophila eye development by Decapentaplegic. Development. 124, 271-278 (1997).
- Borod, E. R., Heberlein, U. Mutual regulation of decapentaplegic and hedgehog during the initiation of differentiation in the Drosophila retina. Dev. Biol. 197, 187-197 (1998).
- Masucci, J. D., Miltenberger, R. J., Hoffmann, F. M. Pattern-specific expression of the Drosophila decapentaplegic gene in imaginal disks is regulated by 3' cis-regulatory elements. Genes Dev. 4, 2011-2023 (1990).
- Blackman, R. K., et al. An extensive 3' cis-regulatory region directs the imaginal disk expression of decapentaplegic, a member of the TGF-b family in Drosophila. Development. 111, 657-665 (1991).
- Campos, A. R., et al. Molecular analysis of the locus elav in Drosophila melanogaster: a gene whose embryonic expression is neural specific. Embo J. 6 (2), 425-431 (1987).
- Robinow, S., White, K. The locus elav of Drosophila melanogaster is expressed in neurons at all developmental stages. Dev Biol. 126 (2), 294-303 (1988).
- Kumar, J. P. Building an ommatidium one cell at a time. Dev Dyn. 241 (1), 136-149 (2012).
- Kimmel, B. E., Heberlein, U., Rubin, G. M. The homeo domain protein rough is expressed in a subset of cells in the developing Drosophila eye where it can specify photoreceptor cell subtype. Genes Dev. 4 (5), 712-727 (1990).
- Dokucu, M. E., Zipursky, S. L., Cagan, R. L. Atonal, rough and the resolution of proneural clusters in the developing Drosophila retina. Development. 122 (12), 4139-4147 (1996).
- Kumar, J. P., Moses, K. M. EGF Receptor and Notch signaling act upstream of Eyeless/Pax6 to control eye specification. Cell. 104, 687-697 (2001).
