Summary
C. elegans er vanligvis dyrket på fast agar plater eller i flytende kulturer seeded med E. coli. For å hindre bakterie biprodukter fra blander sammen toksikologiske og ernæringsmessige undersøkelser, benyttet vi en axenic flytende medium, CeHR, for å vokse, og synkronisere et stort antall ormer for en rekke nedstrøms applikasjoner.
Abstract
I denne protokollen, presenterer vi de nødvendige materialer, og prosedyren for å lage modifiserte C. E legans Tilvenning og reproduksjon media (mCeHR). I tillegg, er fremgangsmåten for å utsette og acclimatizing C. elegans dyrket på E. coli til axenic flytende medier er beskrevet. Endelig, nedstrøms eksperimenter som utnytter axenic C. elegans illustrere fordelene ved denne prosedyren. Evnen til å analysere og finne C. elegans næringsstoff kravet ble illustrert ved å dyrke N2 vill type ormer i axenic flytende medier med varierende heme konsentrasjoner. Denne prosedyren kan replikeres med andre næringsstoffer for å fastslå den optimale konsentrasjonen for orm vekst og utvikling, eller, for å bestemme de toksikologiske effektene av medikamentell behandling. Virkningene av varierende heme konsentrasjoner på veksten av vill-type ormer ble bestemt ved kvalitativ mikroskopisk observasjon og ved kvantifisering tHan antall ormer som vokste i hvert heme konsentrasjon. I tillegg kan effekten av varierende næringskonsentrasjoner analyseres ved anvendelse av ormer som uttrykker fluorescerende sensorer som reagerer på endringer i det næringsstoffet er av interesse. Videre er et stort antall ormer ble lett fremstilt for generering av transgene C. elegans ved hjelp av mikropartikkel bombardement.
Introduction
Jordsmonnet nematode, Caenorhabditis elegans, er en kraftig modell organisme som brukes i en rekke studier fra genetikk til toksikologi. Som et resultat av dens 1 mm størrelse, hurtig generasjonstid på fire dager, enkle dyrking, og store avkoms tall, har disse nematoder blitt benyttet i en rekke genetiske og farmakologiske skjermer 1, 2. Forskere dra nytte av denne ormen å identifisere molekyler og trasé bevart i virveldyr systemer. Disse banene inkluderer celledød signaler, veier av aldring og metabolisme, og nervesystemet 3-6. I tillegg, gjennomsiktigheten C. elegans tillater generering av transgene linjer ved hjelp av fluorescerende protein journalister, noe som kan være direkte visualisert å analysere genuttrykk mønstre og protein lokalisering.
I mange studier denne nematode er dyrket på en solid agar-baserte overflaten ved hjelp av nematode vekstmedium (NGM) plater eller i lVæsken kulturer seeded med Escherichia coli som matkilde 7,8. Disse bakterielle mat kilder kan forvirre biokjemiske og toksikologiske studier med forstyrrelser fra bakteriell biprodukter som påvirker tolkningen av resultatene. For å unngå disse sammensatte virkninger, C. elegans kan dyrkes i en axenic flytende medier som er blottet for bakterier som matkilde. Ved hjelp av dette mediet, vi får dyrket millioner av svært synkroniserte ormer for mange standard C. elegans protokoller inkludert microarray analyse av differensielt regulerte gener i C. elegans utsatt for ulike heme konsentrasjoner, og produksjon av transgene ormer som bruker genet bombardement. Dette mediet er kjemisk definerte og endret fra en original oppskrift formulert av Dr. Eric Clegg ni. Ved hjelp av denne mCeHR medier, har vi lykkes identifiserte gener involvert i heme homeostase, referert til som heme responsive gener (HRG e) 10, som villehar ikke vært mulig i vanlige vekstbetingelser som utnytter NGM agarplater podet med E. coli.
I denne protokoll beskrives fremgangsmåten for innføring og opprettholdelse C. elegans dyrket på E. coli til axenic mCeHR og benytte denne metode for å oppnå et stort antall ormer for fremstilling av transgene C. elegans linjer ved hjelp av mikropartikkel bombardement. Vi presenterer også studier som viser nytten av å bruke axenic media for å bestemme ernæringsmessige krav om C. elegans hjelp heme som et eksempel. Disse studiene viser at ved bruk av mCeHR media har en rask vekst av et stort antall C. elegans for mange nedstrøms programmer benyttes av ormen forskere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Worm Stammer
- Skaffe C. elegans villtype Bristol N2 stammer fra Caenorhabditis Genetics Center (CGC) (http://www.cbs.umn.edu/cgc) og vedlikeholde dem på NGM plater seeded med E. coli stamme OP50 7. Merk: Transgenic ormen stammer IQ6011 (Phrg-1 :: GFP) utnyttet ble generert som tidligere beskrevet 11. IQ6011 kan fås fra tilsvarende forfatteren.
2. Utarbeidelse av Modified C. elegans Habitation og Reproduksjon Medium (mCeHR)
Forbered mCeHR flytende medier som beskrevet nedenfor 12. Dette axenic flytende medier gjør at ormer å vokse uten noen ekstra mat kilder. Utføre alle manipulasjoner av axenic væske og axenic ormer som bruker strengt sterile forhold som for eksempel en laminær hette.
- Skaffe ultra pasteurisert fettfri melk fra en matbutikk. Bruk nedkjølt prokanalen og ikke romtemperaturen produktet. Før bruk i mCeHR medium, strek melken på hjerne-hjerte-infusjon (BHI) agar plater og inkuberes i 3 dager ved 30 ° C og 37 ° C for å undersøke med hensyn på sterilitet. Overfør melken til 50 ml sterile rør og oppbevar ved -80 ° C
- Forbered hver av de følgende komponenter og kombinere i den rekkefølge og mengder er gitt for å forberede en L av mCeHR (tabell 1A): 10 ml 2 mM kolin disyren citrat, 10 ml av vitamin-og vekstfaktor-blanding (se oppskrift i tabell 1B), 10 ml av 2,4 mM myo-inositol, 10 ml 2 mM hemin-klorid, 250 ml deionisert vann. Påfør suge og filter gjennom en 0,22 mikrometer filter enhet.
- Tilsett 20 ml nukleinsyre blanding (oppskriften i tabell 1C), 100 ml av mineral blanding (oppskriften i tabell 1D), 20 ml 170 mg / ml lactalbumin hydrolysat, 20 ml av essensielle aminosyrer, 10 ml av ikke-essensielle amino syre, 20 ml av 450 mM KH PO 2 til 4,50 ml av 1,45 M D-glukose, 10 ml 1 M HEPES, natriumsalt, 250 ml deionisert vann.
- Påfør sug for å filtrere sterilisere komponentene. Fjern filter og tilsett 1 ml av 5 mg / ml kolesterol. Påse at pH-verdien av mediet er omtrent 6-6,5. Merk: Denne løsningen kan oppbevares ved -80 ° C i inntil ett år.
- Tilsett 20% (v / v) ultra pasteurisert organiske skummet melk til mCeHR medium før bruk. Bruk scrupulously steril teknikk (for eksempel i en laminær strømningshette) ved åpning og aliquoting melken. Oppbevar media ved 4 ° C.
Tre. Forbered C. elegans for kultur i Axenic mCeHR Væske Medium
- Grow ormer på ti 60 mm NGM plater til det er mange av gravid ormer og en minimal mengde OP50 E. coli på platene.
- Fjern ormer fra hver plate ved å skylle med 5 ml av M9 buffer (oppskriften i tabell 1 F), og kombinere i et 50 ml konisk rør.
- Tillate ormer til settle ved å la røret stå i 5 til 10 minutter og deretter forsiktig fjerne supernatanten inneholdende E. coli.
- Gjenta trinn 3,2 og 3,3 2x å fjerne så mye av de gjenværende bakterier som mulig før du fortsetter prosedyren.
- Resuspender ormer i 0,1 N NaCl i et volum som er et multiplum av tre, for eksempel 1,5 ml, 3 ml og 6 ml hvori de enkelte ormer kan sees i røret.
- Bleach ormene ved å tilsette 5 N NaOH og 5% natriumhypokloritt (blekemiddel) oppløsning i en 01:02:06-forhold til snekken suspensjon. For eksempel, 1 ml 5 N NaOH: 2 ml 5% natriumhypokloritt: 6 ml av snekke suspensjon. Bland NaOH og blekemiddel før du legger til ormen suspensjon.
- Vortex løsningen kraftig til de av gravid ormer er oppløst, og bare egg er synlig i suspensjon (omtrent 5 til 10 min). Overvåke prosessen ved hjelp av en fase kontrast mikroskop med en 10X objektiv.
- Etter ormene er fullstendig oppløst, umiddelbart pelletereegg ved 800 xg i 45 sekunder ved 4 ° C. Fjern supernatanten og skyll pelleten to ganger med 10 ml sterilt vann ved sentrifugering av pellets ved 800 xg i 45 sekunder ved 4 ° C.
- Etter bleking, overføre egg pellet til en 25 cm2 vevskultur-kolbe inneholdende 10 ml av mCeHR media supplert med 100 pg / ml tetracyklin. Utfør denne prosedyren ved hjelp av sterile teknikker. Dersom det er ønskelig, å legge til flere antibiotika, inklusive 250 pg / ml nalidiksinsyre, for å hindre bakterievekst i de axenic flytende kulturer.
- Inkuber de flytende kulturer ved 20 ° C på en rysteinkubator ved omtrent 70 opm.
- Sjekk ormer daglig for å merke den fasen av utviklingen og veksten.
Merk: Worms vil først vokse langsomt og krever 7 til 10 dager for å bli gravid. Imidlertid, ettersom ormer akklimatisere til det flytende medium generasjonstiden reduseres til omtrent 4 dager for villtype (N2) ormer. - Etter ormene har utvikloped til gravid stadium i flytende medier, overfører ormen kultur til et konisk rør og pellet ormer ved 800 xg i 5 min ved 4 ° C ved hjelp av en svingende spannrotor.
- Fjern supernatant og resuspender forsiktig snekke pellet i et likt volum av 0,1 M NaCl. For eksempel ved å bruke 10 ml av 0,1 M NaCl for ormer dyrket i 10 ml mCeHR. Tillate ormer til takke med 5 min på isen.
- Utføre blekeprosedyren som beskrevet ovenfor i trinn 3.5 til 3.8, og lar ormer å vokse i en andre generasjon i axenic flytende medier. Tilsett om nødvendig antibiotika igjen for å hemme bakterievekst.
- Igjen tillater ormer for å bli gravid deretter pellet og resuspender ormer i 0,1 M NaCl slik det er beskrevet i trinn 3,12 og 3,13, og deretter blekes på nytt som beskrevet i trinn 3.5 til 3.8, for å produsere en synkronisert populasjon. Grow L1 larve ormer i flytende medier uten antibiotika fra nå av.
4. Synkronisering Worms fra VæskeKultur
- Pellet-og resuspender ormer i 0,1 M NaCl slik det er beskrevet ovenfor i trinn 3,12 og 3,13. Blekemiddel som beskrevet ovenfor i trinn 3.5 til 3.8.
- Resuspender pelleten egg i 10 ml M9 buffer og tillater larvene å klekke O / N ved 20 ° C på en roterende plattform shaker. Merk: Eggene klekkes til L1 larver, men vil ikke utvikle seg videre, synkronisering ormer på L1 scenen.
- For å opprettholde og subkultur ormer, pellet L1 larver ved 800 xg i 5 min, deretter resuspender larvene i 10 ml mCeHR og overføring til en 25 cm2 kolbe. Tillat ormer til å vokse ved 20 ° C på en roterende plattform. Opprettholde en maksimal tetthet av 3000 ormer / ml / cm 2 for å sikre tilstrekkelig ernæring for ormer.
Merk: På dette stadiet, er antibiotika ikke nødvendig for å opprettholde axenic forhold når prosedyrene er utført ved hjelp av sterile teknikker i en laminær hette. Worms bør sjekkes daglig for å overvåke veksten.
5. Freezing og tining Worms for Axenic Medium kulturer
- Fryse axenic asynkrone orm kulturer eller synkronisert L1 larver i flytende nitrogen. Pellets ormer på 800 xg i 5 min så resuspender i S buffer (6,45 mM KHPO 4, 43,55 mM KHPO 4, 146.25 mM NaCl) med 0,5 ml for hvert hetteglass. Til et likt volum av S-buffer med 30% v / v glycerol til hver ampulle og overføre ormer til -80 ° C før langtidslagring i flytende N2. Frys ca 1 x 10 6 ormer per ml i hvert hetteglass.
- Tin ormer ved å inkubere ampullene ved 37 ° C i ca 2 min inntil nesten all isen er smeltet. I en laminær strømningshette, overføre ormer til en steril kolbe inneholdende mCeHR og plassere dem ved 20 ° C.
6. Bestemme effekten av Hemin Konsentrasjon om vekst og reproduksjon i mCeHR
- Bruk axenic mCeHR media til analysen næringsstoff avhengige vekst av C. elegans. For å bestemme effekten of hemin konsentrasjon på ormen vekst og utvikling, bruker synkronisert axenic N2 ormer eller andre stammer av interesse. Synkron L1 larver som beskrevet ovenfor i pkt. 4.
- På den påfølgende dag, pellet og telle synkronisert L1 larver og fortynn til en orm per mL av axenic medier. Gjør 10 mM hemin klorid i 0,3 M NH 4 OH og juster til pH 8 bruker konsentrert HCl.
- Legg 800 mL av mCeHR media til en 24-brønns plate. Legg 100 ormer til hver brønn i 100 ul av mediet. Legg hemin-klorid til hver brønn i konsentrasjoner som varierer fra 0 uM, 1,5 uM til 1,000 uM i triplikat. Sikre at alle brønner inneholder den samme konsentrasjon av 0,3 M NH 4 OH. Forsiktig resuspendert ormer før pipettering for å sikre at 100 L1 larvene blir tilsatt til hver brønn.
- Undersøk ormer daglig og merk veksten i hver konsentrasjon i hver brønn. Tell antall ormer etter 9 dagers inkubering og plotte antall ormer / ml svarer til hver hemekonsentrasjon (figur 1).
7. Effekt av Hemin Konsentrasjon om Heme Sensor Worms
- Inkuber synkronisert L1 heme sensor ormer (Phrg-1 :: GFP) i mCeHR inneholder fire mikrometer, 8 mikrometer, 10 mikrometer og 20 mikrometer hemin.
- Bilde ormene bruker fluorescens konfokalmikroskopi, 48 hr innlegg inkubasjon (figur 2).
8. Utnytte mCeHR å generere Transgenic C. elegans Bruk mikropartikkel bombardementet
Merk: Fremgangsmåten for å generere og å utføre mikropartikkel bombardering ved hjelp av unc-119 (ED3) ormer dyrket i mCeHR er skissert i figur 3. 13.
- Worm Forberedelse
- Overfør ca 1 x 10 6 asynkrone unc-119 (ED3) ormer i 90 ml av mCeHR media i en 175 cm 2 kolbe én uke før bombingen. Tillate ormer til å vokse ved 20 ° C ona risting plattform på ~ 70 rpm (figur 3-1).
Merk: En uke senere, skal ormen tetthet bli betydelig større med mange voksne av gravid ormer. Ca 3 x 10 7 ormer vil være nødvendig for mikropartikkel bombardement. - Chill JM109 E. coli utsådd på 10 cm NGM platene på is.
- Overfør axenic ormer til to 50 ml koniske rør og sentrifuger ormer på 800 xg for 2 min. Aspirer supernatanten og resuspender ormer i hvert rør i 50 ml M9 buffer (figur 3-2).
- Tillat den voksne ormer til pellet ved hjelp av gravitasjon i 10 til 15 min på is.
Merk: 2 ml pellet skal nå inneholde> 90% voksne ormer. Denne 2 ml pellet bør ha omtrent 5 x 10 6 ormer og er tilstrekkelig for en mikropartikkel bombardement. - Smør inn hele overflaten av kjølt JM109 seeded NGM plate med 2 ml pellet av ormer. La væsken til å bli fullstendig absorbert og deretter la platenfor 30 min på is før du fortsetter (figur 3-3).
- Overfør ca 1 x 10 6 asynkrone unc-119 (ED3) ormer i 90 ml av mCeHR media i en 175 cm 2 kolbe én uke før bombingen. Tillate ormer til å vokse ved 20 ° C ona risting plattform på ~ 70 rpm (figur 3-1).
- Utarbeidelse av gull partikler
- Vei opp 30 mg av gullpartiklene i en silikonisert mikrosentrifugerør. Tilsett 1 ml 70% etanol og vortex røret i 5 min.
- La røret stå i 15 min, deretter sentrifuger ved 6000 xg i 10 sek for å klumpe de gullpartikler. Fjern supernatanten ved hjelp av en pipette ved forsiktig å berøre spissen til siden av røret rett overfor gullpartiklene.
- Vask de gullpartikler med 1 ml sterilt vann, vortex i 1 minutt, og en kort sentrifuge røret ved 6000 xg i 10 sek. Gjenta vasketrinn to ganger, og resuspendere gullpartiklene i 0,5 ml steril 50% glycerol.
Merk: Den endelige konsentrasjonen av gullpartiklene vil være 60 mg / ml, og det kan lagres i 1-2 måneder ved 4 ° C.
- Forbered DNA-gull partikkel mix
- Kombiner 10 ug av det ønskede plasmid-DNA med 10 &# 956; g UNC-119 rednings plasmid i en silikonisert 1,5 ml mikrosentrifuge tube. Tilsett 50 mL DI vann og 100 pl av brønn suspendert på nytt gull partikkel-løsning og deretter vortex i 1 min.
- Tilsett 150 pl av 2,5 M CaCl 2 og vortex-løsning på nytt i 1 minutt. Til denne løsningen, tilsett 60 pl av 0,1 M spermidin og virvle i 3 til 5 min.
- Puls Sentrifuger oppløsningen ved 6000 xg i 10 sek, fjern supernatanten og tilsett 300 ul av 70% etanol. Vortex godt i 1 min, puls sentrifuger ved 6000 xg, fjern supernatanten og resuspender i 170 pl av 100% etanol. Kraftig vortex løsningen i 5 til 10 min deretter puls sentrifuge og fjern supernatanten.
- Bombardement (figur 3-3)
Merk: Denne protokollen er utført med partikkel levering system som er angitt i tabellen over Materialer / utstyr. Følg instruksjonene for partikkel levering instrument tilgjengelig.- <li> Plasser et ark med silkepapir i en 15 cm plate. Ved hjelp av pinsett, dypp syv macrocarriers individuelt i 100% etanol og legger dem på vevet til tørk.
- Rengjør biolistic kammer, macrocarrier holder, og sikteplate med 70% etanol. Rengjør og autoklav stoppe skjermene før hver bombardement prosedyre.
- Laste macrocarrriers i holderen ved hjelp av pinsett og trykk inn i holderen ved hjelp av sitte verktøyet.
- Jevnt fordelt 20 ul av DNA-belagte gull partikler i midten av hver macrocarrier og deretter la oppløsningen helt tørr.
- Rens de to delene av trykk divider med etanol og sammen med etanol renset brudd disker. Skru den monterte trykk skillelinjen og brudd disker inn bombardementet kammeret.
- Monter en autoklavert stoppskjerm med macrocarrier holderen og plassere anordningen på metallsokkelen er nødvendig og låses på plass.
- Sett den monterte MACRocarrier apparat inn i biolistic kammeret i den avsatte sporet under press skillevegg og justere med trykk skillelinjen.
- Tape den åpne NGM plate med ormer på målet sokkel plate og lukk døren til kammeret.
- Å bombardere ormer, justere trykket til som måtte bryte ruptur disker. Slå på vakuum til 28 inches av Hg press, trykk deretter på brann-knappen til diskene sprekke.
- Frigjør vakuum og fjern NGM plate fra apparatet. Vask ormer fra platen og redistribuere i tjue 10 cm NGM plater seeded med JM109 E. coli (figur 3-4).
- Tillate ormer å vokse i 10 til 14 dager ved 25 ° C og sulte platene. Worms reddet fra UNC-119 defekt vil ha normal bevegelse og kan bli identifisert på dette tidspunktet. Plukk minst 10 "villtype" ormer fra separate plater for videre analyse som disse representerer uavhengige transgene linjer (Figure 3-5).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dyrking C. elegans i axenic flytende medium hjelpemidler i fastsettelse av næringsstoffer som kreves av ormer, uten innblanding fra sekundære metabolitter produsert av E. coli. Villtype N2 ormer akklimatisere til mCeHR media i løpet av tre generasjoner og vise vekst sammenlignes med ormer dyrket på NGM bakterielle plater. Faktisk disse ormer bli gravid løpet av 4 dager, sammenlignet med 3,5 dager for ormer dyrket på OP50 bakterier.
En fordel med å bruke mCeHR ble sett i studier som undersøkte den eksakte næringsstoff kravet om disse ormene 14. I figur 1 ormer ble dyrket i mCeHR supplert med økende mengder av heme, opp til 1 mM. Observasjoner av disse ormene viste en tydelig forsinkelse i vekst på heme konsentrasjoner under 4 mikrometer, med ormer utvikler til L4 larvestadiet, men ute av stand til å gå videre til gravid scenen etter ni dager i mCeHR. Ved konsentrasjoner på 10 uM og 2056; M heme ormer utvikles til gravid stadium i 4 dager og produsere store antall avkom. Maksimalt antall avkom ble sett da ormer ble dyrket i mCeHR inneholder 20 mikrometer heme. Worms fortsatte å utvikle og produsere avkom på 100 mikrometer og 500 mikrometer heme. Imidlertid avtok antall larve avkom betydelig i forhold til ormer dyrkes ved optimal heme-konsentrasjon på 20 uM heme. Heme konsentrasjoner på eller over 800 mikrometer resulterte i forkrøplet, sykelig ormer på L3 larvestadiet, noe som indikerte at disse heme konsentrasjoner var giftig for ormer.
I tillegg til å bestemme den optimale konsentrasjonen heme og effekten av heme savn og heme toksisitet på C. elegans vekst, kan heme reporter-stammer anvendes for indirekte å vurdere status av heme ormen innenfor et mindre konsentrasjonsområde. Den IQ6011 ormen er en transgen orm som uttrykker en heme responsive transcriptional reporter, P HRG-en figur 2.. GFP ekspresjon er undertrykt ved 20 uM heme og øker etter hvert som konsentrasjonen heme er redusert. Den trinnvise endringer i heme konsentrasjonen kan være nøyaktig korrelert med gen respons og uttrykk i mCeHR media.
I tillegg til å være i stand til nøye å kontrollere næringskonsentrasjoner gitt til snekken, tillater mCeHR axenic medier for effektiv vekst av et stort antall synkroniserte ormer. Denne funksjonen kan utnyttes for mikropartikkel bombardement (figur 3). Ved hjelp av denne fremgangsmåten minst én integrert linje har blitt utviklet fra hver mikropartikkel bombardement utført (tabell 2).
Figur 1. C. elegans heme vekstkurve. Worms ble dyrket i en rekke heme konsentrasjoner fra 0 mikrometer til 1000 mikrometer i mCeHR for ni dager. Antall ormer i hver konsentrasjon ble tellet og plottes. På 1,5 mikrometer heme konsentrasjoner ormer var L4 og ute av stand til å videreutvikle. På 800 mikrometer heme ormene ble forkrøplet på L2-L3 etapper og viste effekter av heme toksisitet.
Figur 2. Response av heme sensor (Phrg-1 :: GFP) belastning til forskjellige heme konsentrasjoner i mCeHR. Synkronisert transgen C. elegans uttrykke HRG-1 :: GFP ble dyrket i mCeHR media supplert med 4, 8, 10, eller 20 mikrometer heme i 48 timer. Bildene ble tatt med et Zeiss LSM 710 confocal mikroskop. Scale bar er 100 mikrometer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3.. Skjematisk av mikropartikkel bombardement i C. elegans hjelp unc-119 ormer dyrket i mCeHR. (1) Ca 3 x 10 7 unc-119 (ED3) ormer er dyrket i 90 ml mCeHR media. (2) Gravids ble tillatt å sedimentere på is i 10 til 15 min i 50 ml koniske rør. (3) En 2 ml pellet på ca 5 x 10 6 av gravid ormer ble spredt jevnt på en unseeded NGM plate. Den ormer ble bombardert med 12 pg av plasmid av interesse og 6 ug av unc-119 rednings plasmid kompleksert til gullpartikler. (4) Than bombardert ormer ble delt på tjue 10 cm plater seeded med E. coli stamme JM109. (5) Etter 2 ukers inkubering ved 25 ° C, ble platene med vill-type ormer valgt for analyse av transgene expression styrke og segregerings priser.
| Tabell 1A | |
| CeHR, en L | |
| Ved å bruke steril teknikk og en 1 L (0,22 mikrometer) vakuumfilterenhet, filtrere de følgende volumer av stamløsninger og vann i den rekkefølge som er beskrevet. | |
| Kolin diacid citrate | 10 ml |
| Vitamin-og vekstfaktor mix | 10 ml |
| myo-inositol | 10 ml |
| Hemin klorid | 10 ml |
| Avionisert vann | 250 ml |
| Nukleinsyre mix | 20 ml |
| Mineral Mix | 100 ml |
| Lactalbumin hydrolysat | 20 ml |
| Essential Amino Acid Mix | 20 ml |
| Non-essensiell aminosyre Mix | 10 ml |
| KH 2 PO 4 | 20 ml |
| D-glukose | 50 ml |
| HEPES, natriumsaltet | 10 ml |
| Avionisert vann | 250 ml |
| Volum blir 800 ml på dette punktet Fjern filterenheten fra vakuum deretter legge til: | |
| Kolesterol | 1 ml |
| Ultra-pasteurisert skummet melk | 200 ml |
| Tabell 1B | |
| Vitamin-og vekstfaktor-blanding, 100 ml | |
| Løsning 1: Til 60 ml vann add: | |
| N-acetyl-α-D-glukosamin | 0,15 g |
| DL-alanin | 0,15 g |
| Nikotinamid | 0,075 g |
| D-pantethine | 0,0375 g |
| DL-pantotensyre, hemikalsiumsalt | 0,075 g |
| Folsyre | 0,075 g |
| Pyridoxamine 2HCl | 0,0375 g |
| Pyridoksin HCl | 0,075 g |
| Flavinmononukleotid, natrium-salt | 0,075 g |
| Tiaminhydroklorid | 0,075 g |
| Løsning 2: Forbered følgende kjemikalier i 5 ml 1 N KOH: | |
| p-aminobenzosyre | 0,075 g |
| D-biotin | 0,0375 g |
| Cyanokobalamin (B12) | 0,0375 g |
| Folinsyre, kalsiumsaltet | 0,0375 g |
| Nikotinsyre | 0,075 g |
| Pyridoxal 5-fosfat | 0,0375 g |
| Løsning 3: 0,0375 g (±)-α-L-liponsyre, oksydert form i 1 ml etanol: | |
| Kombiner løsninger 1, 2 og 3 og bringe sluttvolumet til 100 ml. Lagres i mørke ved 4 ° C eller fryses alikvoter ved -20 ° C. Lag små mengder aksjer for denne blandingen slik at det er raskt i bruk. | |
| Tabell 1C | |
| Nukleinsyre blanding, 100 ml | |
| Til 60 ml vann add: | |
| Adenosin-5'-monofosfat, natrium-salt | 1,74 g |
| Cytidin 5 '-fosfat | 1,84 g |
| Guanosin 2 '- og 3'-monofosfat | 1,82 g |
| ELLER | |
| Guanosin-5'-fosfat | 2,04 g |
| Uridin 5 '-fosfat, dinatriumsalt | 1,84 g |
| Tymin (legg siste) | 0,63 g |
| Bring løsningen til 100 ml og lagrer i mørket ved 4 ° C eller fryses alikvoter ved -20 ° C. Lag små mengder aksjer for denne blandingen slik at det er raskt i bruk. | |
| Mineral Mix, 1 L | |
| MgCl 2 • 6 H 2 O | 4,1 g |
| Natriumsitrat | 2,9 g |
| Kaliumsitrat monohydrat | 4,9 g |
| CuCl 2 • 2H 2 O | 0,07 g |
| MnCl 2 • 4H 2 O | 0,2 g |
| ZnCl 2 | 0,1 g |
| Fe (NH4) 2 (SO 4) 2 • 6 H 2 O | 0,6 g |
| CaCl 2 • 2H 2 O (alltid legge siste) | 0,2 g |
| Lag små mengder aksjer for denne blandingen slik at det er raskt i bruk. | |
| Andre komponenter | |
| KH 2 PO 4 | 450 mM |
| Kolin di-syre citrate | 2 mM |
| myo-inositol | 2,4 mM |
| D-glukose | 1,45 M |
| Hemin klorid | 2 mM i 0,1 N NaOH pH 8,0 |
| HEPES, natriumsaltet | 1 M stamløsning |
| Kolesterol | 5 mg / ml i etanol |
| Lactalbumin enzymatisk hydrolysat | 170 mg / ml |
| Tabell 1F | |
| M9 Buffer, en L | |
| KH 2 PO 4 | 3 g |
| Na 2 HPO 4 | 6 g |
| NaCl | 5 g |
| H 2 O | 1 L |
| Autoklav 30 min | |
| 1 M MgSO 4 (sterilt) | 1 ml |
Tabell 1. Oppskrifter for komponenter av mCeHR og mCeHR.
| Bombardement | Linjer med vill type redning | Linjer med redning / transgenet | Stabile linjer |
| 1 | 2 | 2 | 1 |
| 8 | 5 | 0 | |
| 3 | 4 | 4 | 2 |
| 4 | 5 | 2 | 1 |
| 5 | 5 | 3 | 1 |
| Gjennomsnittlig | 4,8 | 3.2 | 1 |
Tabell 2. Average antall transgen C. elegans generert ved hjelp av mikropartikkel bombardement.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen presenterer vi en modifisert axenic flytende medier mCeHR som gir mulighet for rask C. elegans generasjon med produksjon av et stort antall ormer. Dette mediet viser flere fordeler som ormene er dyrket uten forurensende E. coli eller bakteriell biprodukter og kan utnyttes i ernæringsmessige og toksikologiske studier. Bruken av E. coli eller andre bakterier i slike studier har flere ulemper. For eksempel, kan veksten av bakteriene endres under forskjellige betingelser, og de bakterier som kan metabolisere molekyler som blir analysert, blander sammen tolkningen av resultatene. Derfor er utvikling av et definert medium for å utføre disse undersøkelsene meget fordelaktig.
Selv C. elegans har blitt dyrket i flytende medier i tidligere studier 15, ormer dyrket i C. elegans vedlikehold medium (CeMM) viser en tydelig forsinkelse i generasjons ganger 16, i motsetning til hva vi observe i mCeHR medium. Vårt hovedmål var å utnytte C. elegans å studere nærings homeostase med spesiell vekt på heme og metall metabolisme. Med dette i bakhodet, mCeHR og modifikasjoner som genereres av vår gruppe oppnå dette målet, og har direkte ført til identifisering av en rekke gener som kreves for å opprettholde heme homeostase i ormen og til slutt i virveldyr modellsystemer 17, 18. Reformulert mCeHR-1 media kan også utnyttes for andre nematode arter inkludert Panagrellus redivivus, Oscheius myriophila, og C. remanei. I tillegg lave metallpriser formuleringer mCeHR-2 og mCeHR-3 kan utnyttes i studier som undersøker heavy metal toksisitet og krav 12.
Før akklimatisering, N2 ormer utviser en lengre generasjonstid på ca 7 til 10 dager i mCeHR media. Som ormene er subkultiveres, denne generasjonen tiden reduseres til fire dager, lik som ormer dyrket på op50 bakterier. Imidlertid kan den generasjonen tiden være lengre for enkelte mutant ormer, troverdig på grunn av feil i fôring, bevegelse, eller spesielle ernæringsmessige behov.
Ved bruk axenic flytende medier er det kritisk at kresne sterile teknikker benyttes. Vanligvis er bruken av antibiotika er minimert, og til slutt fjernes så ormer akklimatisere seg til mediet, og den gjenværende bakterier er eliminert. Antibiotika er i utgangspunktet pålagt å sikre at kulturene er axenic når etablert som det hindrer vekst av rest bakterier som kan overvelde ormen kulturer. Etter to påfølgende runder med bleking, er antibiotika utelatt fra de kulturene som kontinuerlig bruk av antibiotika bare masker fattige aseptiske teknikker som er avgjørende for voksende ormer axenically. Ved hjelp av disse teknikkene i en laminær kabinett, har forfatterne vært i stand til å vokse ormer axenically uten forurensning. I tillegg er riktig lagring av Media og komponentene er viktig for snekke vedlikehold og vekst. Ormene bør sjekkes for veksttakten og subkultiveres å forhindre trengsel, noe som kan føre til dauer formasjon som essensielle næringsstoffer er oppbrukt. Dette kan hindres ved å sikre at tettheten av ormer ikke overstiger 3000 ormer / ml / cm 2. Forskere som er nye til voksende C. elegans axenically kan oppnå dette ved å sjekke ormer daglig og telle ormer ukentlig.
C. elegans forskere dra nytte av sine gjennomsiktige egenskaper ved å generere transgene ormer uttrykker fluorescently-merket markører som gir mulighet for visualisering av genekspresjon og proteiner lokalisering. Utnytte biolistic bombardement tillatt for generering av lave kopi integranter som unngikk spørsmål om ekstrakromosomale arrays og forhøyet genuttrykk bemerket med transgenics generert ved hjelp av injeksjon 19. Tidligere, en ulempe for å generere transgenics hjelpmikropartikkel bombardement av C. elegans var kravet til egg plate forberedelse til å generere et stort antall unc-119 (ED3) ormer som er nødvendige for fremgangsmåten 20.. Hver transformasjon kreves 20 egg plater for antall ormer som trengs. Bruke axenic mCeHR flytende kultur tillater mer effektiv vekst og senere flere ormer for bombardement. I tillegg kan bombardement brukes i forbindelse med medikament-seleksjon for å unngå bruk av unc-119 (ED3) ormer 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer det ikke er noen konkurrerende økonomiske interesser eller interessekonflikter.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of HealthGrants DK85035 og DK074797 (IH).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MgCl2•6H2O | Sigma | M-2393 | |
| Sodium citrate | Sigma | S-4641 | |
| Potassium citrate monohydrate | Sigma | P-1722 | |
| CuCl2•2H2O | Fisher | C455-500 | |
| MnCl2•4H2O | Fisher | M87-100 | |
| ZnCl2 | Sigma | Z-0152 | |
| Fe(NH4)2(SO4)2•6H2O | Sigma | F-1018 | |
| CaCl2•2H2O | Fisher | C70-500 | |
| Adenosine 5 -monophosphate, sodium salt | Sigma | A-1752 | |
| Cytidine 5 -phosphate | Sigma | C-1006 | |
| Guanosine 2' - and 3' -monophosphate | Sigma | G-8002 | |
| Uridine 5 -phosphate, disodium salt | Sigma | U-6375 | |
| Thymine | Sigma | T0376 | |
| N-Acetylglucosamine | Sigma | A3286 | |
| DL-Alanine | Fisher | S25648 | |
| p-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | |
| Biotin | Sigma | B-4639 | |
| Cyanocobalamine (B-12) | Sigma | V-2876 | |
| Folinate (Ca) | Sigma | F-7878 | |
| Niacin | Sigma | N-0761 | |
| Niacinamide | Sigma | N-3376 | |
| Pantetheine | Sigma | P-2125 | |
| Pantothenate (Ca) | Sigma | P-6292 | |
| Pteroylglutamic Acid (Folic Acid) | ACRCS | 21663-0100 | |
| Pyridoxal 5'-phosphate | Sigma | P-3657 | |
| Pyridoxamine 2HCl | Sigma | P-9158 | |
| Pyridoxine HCl | Sigma | P-6280 | |
| Riboflavin 5-PO4(Na) | Sigma | R-7774 | |
| Thiamine HCl | Sigma | T-1270 | |
| DL-6,8-Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | |
| KH2PO4 | Sigma | P-5379 | |
| Choline di-acid citrate | Sigma | C-2004 | |
| myo-Inositol | Sigma | I-5125 | |
| D-Glucose | Sigma | G-7520 | |
| Lactalbumin enzymatic hydrolysate | Sigma | L-9010 | |
| Brain Heart Infusion | BD | 211065 | |
| Hemin chloride | Frontier Scientific | H651-9 | |
| HEPES, sodium salt | Sigma | H-3784 | |
| Cholesterol | J.T. Baker | F676-05 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| MEM Amino Acids Solution | Invitrogen | 11130-051 | |
| Nalidixic acid sodium salt | Sigma | N4382 | |
| Tetracycline Hydrochloride | MP Biomedicals | 2194542 | |
| Biolistic Delivery System | BioRad | 165-2257 | |
| Gold particles (Au Powder) | Ferro Electronic Material Systems | 6420 2504, JZP01010KM | |
| or | |||
| Gold Particles 1.0 μm | BioRad | 165-2263 |
References
- Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, 231-237 (2003).
- Nass, R., Blakely, R. D. The Caenorhabditis elegans dopaminergic system: opportunities for insights into dopamine transport and neurodegeneration. Annual review of pharmacology and toxicology. 43, 521-544 (2003).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C elegans signaling pathways for longevity. Trends in endocrinology and metabolism TEM. 23, 637-644 (2012).
- Kenyon, C. The plasticity of aging insights from long-lived mutants. Cell. 120, 449-460 (2005).
- Vanfleteren, J. R., Braeckman, B. P. Mechanisms of life span determination in Caenorhabditis elegans. Neurobiology of aging. 20, 487-502 (1999).
- Poole, R. J., Bashllari, E., Cochella, L., Flowers, E. B., Hobert, O. A Genome-Wide RNAi Screen for Factors Involved in Neuronal Specification in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 7, e1002109 (2011).
- Stiernagle, T. Maintenance of C elegans WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-11 (2006).
- Win, M. T., et al. Validated Liquid Culture Monitoring System for Lifespan Extension of Caenorhabditis elegans through Genetic and Dietary Manipulations. Aging and disease. 4, 178-185 (2013).
- Clegg, E. D., LaPenotiere, H. F., French, D. Y., Szilagyi, M. Use of CeHR Axenic Medium for Exposure and Gene Expression Studies. East Coast Worm Meeting. , (2002).
- Severance, S., et al. Genome-wide analysis reveals novel genes essential for heme homeostasis in Caenorhabditis elegans. PLoS genetics. 6, e1001044 (2010).
- Rajagopal, A., et al. Haem homeostasis is regulated by the conserved and concerted functions of HRG-1 proteins. Nature. 453, 1127-1131 (2008).
- Nass, R., Hamza, I. Chapter 1 Unit 1 9. The nematode C. elegans as an animal model to explore toxicology in vivo: solid and axenic growth culture conditions and compound exposure parameters. Current protocols in toxicology editorial board, Mahin D. Maines. , (2007).
- Schweinsberg, P. J., Grant, B. D. C. elegans gene transformation by microparticle bombardment WormBook the online review of C. elegans biology. , 1-10 (2013).
- Rao, A. U., Carta, L. K., Lesuisse, E., Hamza, I. Lack of heme synthesis in a free-living eukaryote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 4270-4275 (2005).
- Szewczyk, N. J., Kozak, E., Conley, C. A. Chemically defined medium and Caenorhabditis elegans. BMC biotechnology. 3, 19 (2003).
- Szewczyk, N. J., et al. Delayed development and lifespan extension as features of metabolic lifestyle alteration in C elegans under dietary restriction. The Journal of experimental biology. 209, 4129-4139 (2006).
- White, C., et al. HRG1 is essential for heme transport from the phagolysosome of macrophages during erythrophagocytosis. Cell metabolism. 17, 261-270 (2013).
- Chen, C., Samuel, T. K., Sinclair, J., Dailey, H. A., Hamza, I. An intercellular heme-trafficking protein delivers maternal heme to the embryo during development in C elegans. Cell. 145, 720-731 (2011).
- Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans. Genetics. 157, 1217-1226 (2001).
- Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation. Nucleic acids research. 32, e40 (2004).
- Semple, J. I., Biondini, L., Lehner, B. Generating transgenic nematodes by bombardment and antibiotic selection. Nature Methods. 9, 118-119 (2012).
