Summary
عنيبات البنكرياس معزولة تحتفظ في الجسم الحي على التشكل والنشاط وتوفر وسائل قوية لرصد والتلاعب إفراز. يوضح هذا العمل كيف عنيبات يمكن عزل من البنكرياس الماوس، وكيف يمكن تقييم قدراتها الإفرازية.
Abstract
عنيبية خلايا البنكرياس تنتج وتفرز الإنزيمات الهضمية. ويتم تنظيم هذه الخلايا باعتبارها الكتلة التي تشكل وأسهم التجويف المشترك. يوضح هذا العمل كيف أن قدرة إفرازية من هذه الخلايا يمكن تقييمها من قبل ثقافة عنيبات معزولة. الإعداد هو مفيد منذ عنيبات معزولة، التي تحتفظ بخصائص كثيرة من إفرازات البنكرياس سليمة يمكن التلاعب بها ومراقبتها بسهولة أكثر في الحيوان كله. العزلة السليمة للعنيبات البنكرياس هو شرط أساسي بحيث ثقافة فيفو السابقين سوف تمثل الطبيعة في الجسم الحي من عنيبات. يوضح البروتوكول كيفية عزل عنيبات سليمة من البنكرياس الماوس. بعد ذلك، يتم عرض طريقتين التكميلية لتقييم إفراز البنكرياس. يقدم فحص إفراز الأميليز كإجراء العالمي، بينما التصوير المباشر لإفراز البنكرياس يسمح توصيف إفراز في قرار شبه الخلوية. بشكل جماعي، وتقنيات حاضراتيد هنا تمكين طائفة واسعة من التجارب لدراسة إفراز خارجية الإفراز.
Introduction
إفرازات البنكرياس يشكل أكثر من كتلة البنكرياس الثدييات و هو مخصص لإنتاج وإفراز الإنزيمات الهضمية 1. الوحدة الوظيفية للإفرازات البنكرياس، وعنيبة، هي مجموعة من الخلايا الظهارية التي تشكل وأسهم التجويف المشترك. على التحفيز الهرموني أو العصبية، ويتم نقل حويصلات مليئة الانزيمات لسطح الخلية قمي، فتيل معها وطرد محتوياتها في تجويف 1-3. ثم يتم استنزاف الإنزيمات التي يفرزها مجموعة تلاحم القنوات إلى الأمعاء الدقيقة، حيث حفز انهيار المواد الغذائية إلى المواد المغذية.
يوضح هذا الفيديو كيفية عنيبات سليمة يتم عزل من البنكرياس كله، وكيف يمكن تقييم قدرتها الإفرازية. باستخدام هذا الإعداد، يتم إفراز البنكرياس كميا عن طريق قياس كمية النسبي للالأميليز الذي تم إصداره بعد التحفيز. بدلا من ذلك، يمكن إفراز تصوير العيش من خلال استخدام مختلفأجهزة الاستشعار والأصباغ.
الإعداد فيفو السابقين من عنيبات البنكرياس هو مفيد منذ عنيبات معزولة، التي تحتفظ بخصائص كثيرة من البنكرياس سليمة، يمكن التلاعب بها ومراقبتها بسهولة أكثر في الحيوان كله 4-6. وقد تم تطوير هذا الإعداد في الأصل في أواخر عام 1970 وكان منذ تمديدها لدراسة عدة أنسجة خارجية الإفراز مثل اللعابية والغدد الثديية 3-7. والجدير بالذكر، أنه يسمح للدراسة إفراز مع أقل تدخل ممكن للمنظمات الخلوية المعقدة لهذه الظهارة الاستقطاب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: الإجراءات التي تجرى على الحيوانات وقد تمت الموافقة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) في معهد وايزمان للعلوم.
إعداد 1. عينة
- عزل عنيبات البنكرياس
- إعداد 300 مل من الطازجة بيكربونات كريبس-قارع الأجراس HEPES (KRBH) متوسطة قبل البدء. مزيج كلوريد الصوديوم 140 ملم، 4.7 ملم بوكل، 1.16 ملم MgCl 2، 1 مم CaCl 2 و 11 ملي الجلوكوز، 10 ملي HEPES. إضافة ألبومين المصل البقري (BSA) و 0.1 ملغ / مل مثبط التربسين فول الصويا (STI) (إعادة تعليق المتوسطة). إعداد 5-10 مل من إعادة تعليق تستكمل المتوسطة مع كولاجيناز (~ 0.75 ملغ / مل) (وسط الهضم).
- الأوكسجين المتوسط KRB ل~ 30 دقيقة. إضافة BSA بعد الأوكسجين لمنع محتدما. إعادة تعليق الهضم وجلب وسائل إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: بالاكسجين المتوسط يقلل وفيات الخلية ويحسن القدرة على الاستجابة للsecretagogues. تأثير الأوكسجين هو ظاهر على الأقل لمدة 6 ساعة.
ملاحظة: من أجل تجنب التلوث، الأوتوكلاف أدوات تشريح والمياه المستخدمة في KRBH المتوسطة قبل الاستخدام. تصفية KRBH المتوسطة من خلال مرشح 0.2 ميكرون. قبل استئصال البنكرياس شطف الأدوات تشريح مع الايثانول 70٪ وإجراء تشريح على مقاعد البدلاء النظيفة. تنفيذ العدوى الفيروسية في مستوى 3 مجلس الوزراء السلامة البيولوجية. إضافة المضادات الحيوية إلى O / N زراعة المتوسطة (انظر القسم 4).
- على نطاق واسع شق الجلد في البطن وطبقة تحت الجلد. التعرف على الكبد والمعدة والأمعاء والبنكرياس والطحال (الشكل 1). ملاحظة: في الخطوات التالية، والتعامل مع أنسجة البنكرياس بلطف وتجنب تطبيق forc الميكانيكية المفرطه لمنع السيارات الهضم وفاة الأنسجة والخلايا.
- باستخدام اثنين ملقط حادة، سحب الأمعاء الدقيقة. تبدأ في نهاية الأمعاء الدقيقة القريبة، بالقرب من الخروج من المعدة. فصل البنكرياس من الأمعاء والاحتفاظ بها داخل تجويف الجسم. وبمجرد الوصول إلى الأمعاء الغليظة، لاحظ أ / النسيج الضام بيضاء وردية اللون. لا تخلط بين ذلك مع البنكرياس.
- مسح قدر الأنسجة البنكرياس ممكن من دون جمع الأنسجة الدهنية أو الضامة. إزالة البنكرياس من قبل فصلها من الطحال والمعدة وقطع الأوعية الدموية في البطن تحته (الشكل 1A-C).
ملاحظة: بما أن العائد من عنيبات البنكرياس من حيوان واحد مرتفع، ويمكن للمرء أن الامتناع عن جمع كل أنسجة البنكرياس من أجل منع جمع الأنسجة الأخرى.
- شطف البنكرياس عدة مرات في إعادة تعليق المتوسطة تسخينها إلى 37 درجة مئوية وإزالة الأجزاء المتبقية من غير البنكرياسالأنسجة. تزج البنكرياس في ~ 5 مل من قبل ساخنة المتوسطة الهضم في 20 مل قارورة التلألؤ. تخطر على البنكرياس لقطعة من 1-3mm. وضعه في حمام الماء الساخن (الأمثل في إطار التحريض من ~ 100 دورة في الدقيقة). لتسريع الهضم، ماصة صعودا وهبوطا الأنسجة هضمها مرة واحدة كل بضع دقائق.
ملاحظة: مدة كولاجيناز الهضم تعتمد بشكل رئيسي على تركيز كولاجيناز وعلى مقدار القوة الميكانيكية المطبقة على الأنسجة. استخدام 0.75 ملغ / مل كولاجيناز لحوالي 15 دقيقة وpipetting لالأنسجة مع ماصة 5 مل البوليسترين مع 2 مم فوهة كل 3-5 دقيقة، مما أدى إلى عنيبات من 10-30 الخلايا. بعد الهضم، وتعليق يبدو العكرة التي تحتوي على قطع مرئية من الأنسجة. منذ collagenases الكفاءة تختلف بين أنواع مختلفة تجارية والكثير، وتحديد توقيت الهضم تجريبيا. - الغسيل والترشيح
- نقل الأنسجة هضمها في أنبوب 50 مل وإنهاء حفرestion بإضافة 45 مل من إعادة تعليق المتوسطة. تصفية تعليق من خلال الخشنة (~ 1 ملم) شبكة معدنية إلى أنبوب جديد. أجهزة الطرد المركزي من خلال تدفق في 100 × ز لمدة 3 دقائق.
- تجاهل طاف ومعلق البنكرياس هضمها في 50 مل من إعادة تعليق المتوسطة. تصفية تعليق من خلال 70 أو 100 ميكرومتر شبكة النايلون. الطرد المركزي كما كان من قبل.
- من أجل إزالة العائمة، عنيبات التالفة، تجاهل طاف و resuspend الأنسجة في البنكرياس 3-5 مل من إعادة تعليق المتوسطة. تطبيق 1 مل أجزاء من عنيبات البنكرياس إلى 15 مل أنابيب مخروطية مليئة 7 مل من إعادة تعليق المتوسطة. السماح للعنيبات ليستقر عن 2 - 3 دقيقة. جمع عنيبات التي استقرت في قاع الأنبوب مع ماصة 1 مل، وتكرار هذه الخطوة 2 - 3 مرات.
- عرض عنيبات البنكرياس تحت المجهر الخفيفة أو تشريح لاختبار حالتهم. في الشكل 2، ومراقبة نقاوة العزلة والأضرار التي لحقت الخلايا الدورينانوغرام العزلة. استخدام هذه عنيبات فورا أو الثقافة لمدة تصل إلى 20 ساعة.
2. الأميليز إفراز الفحص
ملاحظة: يقدم فحص إفراز الأميليز كمقياس عالمي لقدرة إفرازية من عنيبات البنكرياس. ويتحقق ذلك من خلال جمع المتوسطة التي حضنت عنيبات البنكرياس، وتحديد النشاط الأميليز من المتوسط، عادة باستخدام عدة التجارية.
- تحديد عدد من الشروط التجريبية ليتم فحص (مقابل مثل غير حفز حفز). استخدام لا يقل عن ثلاثة مكررات لكل حالة. بالإضافة إلى ذلك، إضافة مجموعة من مكررات لتحديد المحتوى الكلي الخلوي الأميليز ('مجموع' عينة) ومجموعة للنشاط الأميليز من المتوسط (عينة "الصفر"). تسمية لوحة متعددة جيدا التي ستجرى الفحص، ومجموعتين من microtubes لكل من مكررات لاستخدامها.
ملاحظة: 12- أو 24 لوحة جيداق يمكن استخدامها لرصد 1 و 0.5 مل من تعليق عنيبية، على التوالي. - غسل عنيبات مرتين في 30 مل من إعادة تعليق KRBH المتوسطة واحتضان لهم في إعادة تعليق متوسطة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. لوحة متعددة جيدا إضافة قطرة 10μl من افراز للوصول إلى التركيز النهائي المناسب.
- عنيبات البنكرياس تستجيب إلى التدرج من افراز بطريقة ثنائية طوري. تركيزات مع القيم المثلى هي إفراز 50-100 من مساء كوليسيستوكينين (CCK) و1μM من كرباكول (الشكل 3A) 5.
- غسل و resuspend عنيبات في إعادة تعليق المتوسطة. تأكد من أن عنيبات توزع متجانس في تعليق وقسامة كميات متساوية من تعليق في لوحة متعددة جيدا والى "microtubes المسمى total'. احتضان لوحة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. (يفضل أن يكون في حمام مائي في إطار التحريض معتدل (~ 50 دورة في الدقيقة)).
ملاحظة: العدد الدقيق للعنيبات قد تختلف بين التجربهTS لكن يجب ان يكون مماثلا في مكررات في كل تجربة. وبالتالي، aliquoting الدقيق للتعليق عنيبات أمر بالغ الأهمية لمقارنة بين مكررات وظروف مختلفة. - أثناء الحضانة، وإنتاج "الكل" والعينات "الصفر". أجهزة الطرد المركزي في "المجموع" microtubes لبضع ثوان في 5،000 × ز وإزالة 50 ميكرولتر من طاف في "microtubes zero' المسمى ووضعها في 4 درجات مئوية. ليز عنيبات في "المجموع" عينات بإضافة تريتون X-100 إلى microtubes للوصول إلى تركيز النهائي من 1٪. دوامة microtubes بقوة.
ملاحظة: Aliquote في "المجموع" يتطابق مماثل لمكررات التجربة. Lysing وعنيبات، يؤدي إلى الإفراج عن المحتوى الكلي الأميليز. بدلا من ذلك، جمع عنيبات في كل حالة وليز في نهاية التجربة، لتحديد محتوى الخلوي للكل تكرار. - جمع معظم عنيبية تعليق طn لأول مجموعة من microtubes صفت مسبقا. الطرد المركزي microtubes لبضع ثوان في 5،000 × ز. نقل طاف في المجموعة الثانية من microtubes صفت مسبقا.
- مقايسة طاف للنشاط الأميليز مع مجموعة تجارية. حساب النسبة المئوية من يفرز الأميليز.
ملاحظة: من المهم جدا لقراءة النشاط الأميليز في مجموعة خطية لها. تقديم نسبة الأميليز يفرز مثل الأميليز في المئة من المفرج عنهم من المحتوى الأولي الكلي. طرح مستوى الأميليز خلفية المتوسطة من كل ثلاث نسخ ونقسمه على المحتوى الكلي الأولي تطبيع بالمثل.
3. تصوير لايف من إفراز البنكرياس
إفراز من عنيبات البنكرياس يمكن رصدها مباشرة بواسطة التصوير الحي. باستخدام مختلف الأصباغ الفلورية وأجهزة الاستشعار، والتصوير الحي يسمح توصيف إفراز في قرار شبه الخلوية.
- إعداد المؤكسج حديثا المتوسطة إعادة تعليق وكما قلتن خطوة 1.1 وإحضاره إلى 37 درجة مئوية. تعيين المجهر، وإذا مجهزة تحكم في درجة الحرارة، وضبط إلى 37 درجة مئوية.
- غسل الخلايا عنيبية في 30 مل من إعادة تعليق متوسطة ووضعها في كوب أو البلاستيك الشريحة. ملاحظة: إذا الأصباغ محبة للدهون سوف تستخدم لتسمية لغشاء البلازما المسمى مع الأصباغ محبة للدهون، وصمة عار على عنيبات مدة لا تزيد عن 5 دقائق لمنع وضع العلامات الأغشية الداخلية من خلال الإلتقام. في جميع أنحاء العمل، والتعامل مع عنيبات بلطف وتجنب pipetting لالمفرط.
- مرة واحدة على المجهر، صورة عنيبات التي التشكل هو واضح، وتجنب التصوير من عنيبات التي تعرض الفقاعات basolateral أو فجوات داخل الخلايا. إضافة قطرة افراز الحكمة أو باستخدام غرفة التروية، إما أثناء أو مباشرة قبل بدء التصوير.
ملاحظة: عدسات التكبير عالية مع فتحات رقمية عالية (مثل × 63 / 1.4 × 100 أو / 1.4) ويوصى لمراقبة الهياكل التحت خلوية.
4. O / N ثقافة البنكرياس عنيبات (خلية البديل ثقافة وتقنيات)
ملاحظة: O / N غالبا ما تستخدم لزراعة عدوى فيروس الغدة. تتم الإصابة بها في 10 -10 6 7 PFU / مل ل9 - 16 ساعة قبل الفحص.
- ثقافة عنيبات البنكرياس لمدة تصل إلى 20 ساعة. عنيبات معلق تم الحصول عليها من البنكرياس واحدة في 25 مل مستنبت (DMEM تستكمل مع مصل العجل الجنين (FCS) (5٪)، الصوديوم البيروفات (1٪)، والمضادات الحيوية (1٪)، L-الجلوتامين (0.5٪)، BSA (10 ملغ / مل) والأمراض المنقولة جنسيا (0.2 ملغ / مل)، وتنقسم إلى خمس لوحات 10CM. تصيب عنيبات مع الفيروس في مستوى 3 مجلس الوزراء السلامة البيولوجية.
- حضنت عنيبات البنكرياس في 37ºC في 5٪ CO 2 ترطيب الهواء. تسمح عنيبات لاسترداد في المؤكسج المتوسطة إعادة تعليق لمدة 30 دقيقة قبل الفحص اللاحق 3،8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عنيبات البنكرياس التي تم عزلها بشكل صحيح عرض مورفولوجيا النمطية عندما ينظر اليها من الضوء المرسل. يجب أن تظهر المجالات basolateral من جولة وخال من الفقاعات. ويحيط المجال قمية من قبل مئات من الحويصلات الإفرازية ويبدو أكثر قتامة في اللون (الشكل 2A، B). وتقع النواة القاعدية في المنطقة حويصلي. الحطام الخلية ومكونات نظام الأقنية البنكرياس والبنكرياس والغدد الصماء، والتي يمكن الكشف عنها في مراحل مبكرة من عنيبات العزلة (الشكل 2C، D)، وينبغي أن تكون غائبة عن تعليق عنيبية النهائي (الشكل 2A، B). العزلة غير السليمة قد يؤدي إلى توليد الفقاعات basolateral والكسر الخلايا التي التفريغ الانزيمات الهاضمة التي في الوسط (الشكل 2E، F).
الإفراج الأميليز من عنيبات البنكرياس يصور منحنى ثنائية طوري عندما تآمر ضد تركيز secretagogues (الشكل 3A). Wيتم تحرير ithout التحفيز حوالي 5٪ من المحتوى الأولي خلال 30 دقيقة من الحضانة. بعد التحفيز، هو ارتفاع هذا العدد بنسبة تصل إلى 5 أضعاف. عنيبات التي كانت مثقف O / N، عرض نسبة أقل من محفز القاعدية مقابل الإفراج الأميليز بالمقارنة مع عنيبات المعزولة حديثا. الأهم من ذلك، عنيبات مثقف أن كانت مصابة بفيروسات الغدة عرض إفراز ارتفاع الأميليز القاعدية وتوعية حفز إفراز (الشكل 3B، C). وبالتالي فمن الأهمية بمكان تصيب عنيبات التحكم مع جرعة مماثلة من فيروس السيطرة.
تصوير حي من عنيبات ينبغي أن يسمح تحديد واضح من المجالات قمية basolateral والخلايا عنيبية. يمكن الأصباغ محبة للدهون يكون مفيدا للتمييز بين المجال قمية الضيق والنواحي الجانبية وbasolateral من الخلايا (الشكل 4). تحت التحفيز الفسيولوجية، يتم توجيه إفراز حصرا إلى السطح القمي 1،9. استخدام مسبار F-الأكتين Lifeact-GFPيسمح التصور المباشر لحويصلات إفرازية، منذ الحويصلات زايموجين البنكرياس تخضع الأكتين طلاء قبل وقت قصير من إيماس (الشكل 4).
الرقم 1. توطين البنكرياس والأعضاء المجاورة. (AC) والبنكرياس والأعضاء المجاورة بعد شق الجلد في البطن وطبقة تحت الجلد (A)، قبل وبعد الانفصال البنكرياس من الأعضاء المجاورة، (B) و (C)، على التوالي. الرجاء أنقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 2. عزل عنيبات البنكرياس. (A) و (B) عنيبات البنكرياس عزل عرض بشكل صحيح مورفولوجيا النمطية. تظهر مجالاتهم basolateral جولة وخالية من الفقاعات، بينما تحيط بهم المجال قمية من قبل مئات من الحويصلات الإفرازية ويبدو أكثر قتامة في اللون (السهم). (C) ويمكن الكشف عن (D) الحطام الخليوي ومكونات ثانية من نظام الأقنية البنكرياس في المراحل المبكرة من عنيبات العزلة (السهم يشير إلى قناة خارجية الإفراز). (E) و (F) نتائج العزلة غير السليمة في جيل من الفقاعات basolateral (E، السهم)، والكسر من الخلايا، التي التفريغ الإنزيمات الهضمية الخاصة بهم في المتوسطة ( F، السهم). أشرطة النطاق تمثل 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الرقم 3. قياس الإفراج الأميليز من عنيبات معزولة. (A) الإفراج الأميليز من عنيبات البنكرياس يصور منحنى ثنائية طوري عندما تآمر ضد تركيز على افراز. كانت عنيبات معزولة وتركت لاسترداد لمدة 30 دقيقة قبل التحفيز مع تركيزات مبين من كوليسيستوكينين (CCK). وتمثل نتائج المتوسط ووزارة شؤون المرأة من ثلاث تجارب مستقلة. (B) التي كانت عنيبات يا مثقف / N، وعرض نسبة أقل من محفز القاعدية مقابل الإفراج الأميليز بالمقارنة مع عنيبات المعزولة حديثا. عنيبات مثقف أن كانت مصابة بفيروسات الغدة عرض إفراز الأميليز القاعدية عالية وإفراز توعية حفز. (C) غير بالاكسجين الظروف ثقافة تؤدي إلى الإفراط في ديscharge من الأميليز، والذي يخفي تأثير تنشيطية للافراز.
الرقم 4. التصوير لايف من إفراز البنكرياس. ايف حفز خلايا عنيبية، معربا عن Lifeact-GFP (LA والأخضر والرمادي) وملطخة صبغ محبة للدهون FM4-64 (الحمراء). استخدام مسبار Lifeact يسمح التصور المباشر لأحداث الانصهار واحدة من الحويصلات المغلفة الأكتين (السهام). أصيب خلايا O / N مع اتش-Lifeact-GFP (AD-Lifeact-GFP)، ملطخة وحفز لفترة وجيزة مع 100 من مساء CCK قبل بدء التصوير. يمثل شريط النطاق 5 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إلى جانب الثقافة فيفو السابقين، الاجهزة البديلة لدراسة إفراز خارجية الإفراز وتشمل intravital المجهري وقياس السوائل من القناة البنكرياسية. وقد تبين intravital المجهري للعمل بشكل جيد في الماوس الغدد اللعابية 10. هذه الطريقة يمكن تسجيل إفراز في الوقت الحقيقي في الحيوان سليمة، ولكن يقتصر في قرارها والوسائل لمعالجة الأنسجة الإفرازية. وقد تحقق من خلال جمع تقييم إفراز السوائل من القناة البنكرياسية في الفئران تخدير 11. ومع ذلك، منذ القسطرة من القناة البنكرياسية من الصعب للغاية، ونادرا ما تستخدم هذا الأسلوب.
بالمقارنة مع هذه الاجهزة، ثقافة فيفو السابقين من عنيبات البنكرياس بسيطة وسريعة وتتيح وسائل الوصول إليها لرصد والتلاعب الخلايا، دون التدخل في تنظيم أنسجة سليمة 4،5. ومع ذلك، هذا الإعداد له عيوبه. البنكرياسعنيبية خلايا حساسة في الطبيعة وحساسة جدا للتغيرات في ظروف الثقافة. منذ يتم تحميل الخلايا مع الإنزيمات المحللة للبروتين، فهي عرضة للتحلل وموت الخلايا. ونتيجة لذلك، هذه الثقافة هي قصيرة الأجل وعادة لا يدوم أكثر من 20 ساعة.
هو دائما الأفضل لتحديد واستكشاف المشاكل عند ظهورها. الخطوة الأساسية هي المنهجية لعزل عنيبات البنكرياس سليمة دون علامات كبيرة من تلف الخلايا والوفيات. هذه هي علامات جلية واضحة، وتشمل الحطام الخلية المفرط وعنيبات مع الفقاعات basolateral أو فجوات داخل الخلايا. في إفراز الأميليز الفحص، سوف يؤدي إلى تلف الخلايا أدنى حفز نسبة غير حفز إفراز /. من أجل منع هذا الضرر، فمن المستحسن لمعالجة الأنسجة بلطف، إضافة BSA وSTI إلى المتوسطة، وإثراء مع الأكسجين. على سبيل المثال، دون الأوكسجين، التصريف خلية المفرط للأقنعة الأميليز تأثير تنشيطية من افراز (الشكل3C). ومع ذلك، وبسبب هشاشة النسيج خارجية الإفراز، وبعض تلف الأنسجة أمر لا مفر منه تقريبا - يجب التخلص من هذه المستحضرات.
لإفراز الأميليز الفحص، طاف، والذي يحتوي على الأميليز يفرز لكن خالية من الخلايا، ويمكن أن تبقى في 4 درجة مئوية لمدة 1 - 2 يوم. وينبغي بعد ذلك يعاير هذا طاف بواسطة مجموعة تجارية. العديد من مجموعات المتاحة تعتمد على الانقسام من الأميليز الركيزة الاصطناعية والإفراج لاحقا من حامل اللون. وهكذا، وتركيزات أعلى الأميليز تؤدي إلى تغير في اللون أسرع حل ل. منذ الأميليز يفرز في نهاية المطاف الإفراج عن جميع من حامل اللون الركيزة، فمن الضروري لمتابعة رد فعل على مر الزمن، واستخدام البيانات التي تم جمعها خلال المرحلة الخطية فقط.
تصوير حي من عنيبات البنكرياس يمكن أن يكون تجربة محبطة للباحث. بعض الاستعدادات خلية، خصوصا تلك التي عنيبات مصاب، قد لا تكون مناسبة لحيةالتصوير بسبب التشكل خطر من عنيبات أو إلى مستويات غير كافية من أجهزة الاستشعار الفلورسنت. حتى في الاستعدادات المناسبة، قد يستغرق وقتا لتحديد العينات المناسبة. وبالتالي التصوير قد تتطلب وقتا طويلا. Lifeact-GFP، تحقيقا F-الأكتين، الجدير بالذكر 12. هذه الأداة تسمح لنا لمتابعة ديناميات F-الأكتين خلال إفراز البنكرياس لمدة تصل إلى 16 ساعة بعد الإصابة، على مستوى القرار التي لا يمكن تحقيقها في عينات عنيبية الثابتة. بالإضافة إلى ذلك، استخدام Lifeact التحقيق تمكين تعقب أحداث إيماس واحدة، والحويصلات زايموجين البنكرياس يخضع الأكتين طلاء قبل وقت قصير من إيماس 3،13.
جماعيا، عندما يتقن، التقنيات الموصوفة هنا تقدم الباحثة يعني لتقييم إفراز البنكرياس، وتسخير ذلك لتحديد المشاركين الرواية في هذه العملية متعددة الخطوات. بالإضافة إلى ذلك، نظرا لأوجه التشابه الهيكلية والوظيفية بين البنكرياس وأجهزة أخرى خارجية الإفراز،هذه التقنيات يمكن تطبيقها على الأنسجة خارجية الإفراز الأخرى كذلك 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال منحة من البنك السعودي الفرنسي الولايات المتحدة وإسرائيل لدرجة البكالوريوس وEDSBS هو شاغل كرسي هيلدا وسيسيل لويس استاذي في علم الوراثة الجزيئي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | Harlan | Any strain will do | |
| HBSS | Sigma Aldrich | H8264 | Can substitude for KRB |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Fraction V |
| Trypsin inhibitor | Sigma Aldrich | T9003 | |
| Collagenase XI | Sigma Aldrich | C0130 | |
| Nylon mesh | BD Falcon | 352360 | 70-100µm |
| Amylase infinity reagent | Thermo | TR25421 | |
| CCK | Sigma Aldrich | C2175 | |
| FM4-64 | Lifetechnologies | F34653 | Diluted to 16µM |
| 20mL scintillation vial | Sigma Aldrich | Z190527 | |
| DeltaVision system | Applied Precision | Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus) | |
| Zeiss 510 or 710 confocal microscope | Zeiss | 60x/1.4 or 100x/1.4 objectives | |
| Ultra Microplate reader | BioTek | ELx808 |
References
- Williams, J. A. Regulation of pancreatic acinar cell function. Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).
- Schnekenburger, J., et al. The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).
- Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).
- Jerdeva, G. V., et al. Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells. Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).
- Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini. Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).
- Bi, Y., Williams, J. A. A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).
- Palade, G.
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).
- Petersen, H., Grossman, M. I. Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats. The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).
