Vurdering af Sekretorisk Kapacitet bugspytkirtlen acinusceller

Summary

Isolerede pancreas acini bevarer deres in vivo morfologi og aktivitet og tilbyde effektive måder til at overvåge og manipulere sekretion. Dette arbejde viser, hvordan acini kan isoleres fra muse-bugspytkirtlen, og hvordan deres sekretoriske kapacitet kan vurderes.

Abstract

Pancreas acinære celler producerer og udskiller fordøjelsesenzymer. Disse celler er organiseret som en klynge, der danner og deler en fælles lumen. Dette arbejde viser, hvordan sekretorisk kapacitet af disse celler kan vurderes ved dyrkning af isolerede acini. Opsætningen er en fordel, da isolerede acini, som bevarer mange egenskaber intakte exokrin bugspytkirtlen kan manipuleres og overvåges lettere end i hele dyret. Korrekt isolering af pancreas acini er et centralt krav, således at ex vivo kultur vil repræsentere in vivo natur acini. Protokollen viser, hvordan man isolere intakt acini fra muse bugspytkirtlen. Efterfølgende to komplementære metoder til evaluering pancreassekretion fremlagt. Den amylasesekretion analysen fungerer som et globalt mål, mens direkte billeddannelse af pancreassekretion tillader karakterisering af sekretion ved en sub-cellulær opløsning. Kollektivt, de teknikker Presented her muliggøre et bredt spektrum af forsøg for at studere eksokrine sekretion.

Introduction

Den exokrine pancreas udgør det meste af massen af pattedyr bugspytkirtel og er dedikeret til produktion og sekretion af fordøjelsesenzymer ^1. Den funktionelle enhed af eksokrine bugspytkirtlen, acinus, er en klynge af epitelceller, som danner og deler en fælles lumen. Ved hormonal og neuronal stimulation er vesikler fyldt med enzymer, transporteres til den apikale celleoverfladen, sikring med det og uddrive deres indhold ind i hulrummet ^1-3. De udskilte enzymer derefter drænes af sammensmeltende sæt af kanaler i tyndtarmen, hvor de katalyserer nedbrydningen af ​​fødevarer i næringsstoffer.

Denne video viser, hvordan intakt acini isoleres fra hele bugspytkirtlen, og hvordan deres sekretorisk kapacitet kan vurderes. Ved hjælp af denne opsætning er pancreassekretion kvantificeres ved at måle den relative mængde amylase, der blev udgivet efter stimulering. Alternativt kan sekretion skal afbildes direkte ved anvendelse af forskelligesensorer og farvestoffer.

Ex vivo opsætning af pancreas-acini er fordelagtig, eftersom isoleret acini, som bevarer mange karakteristika af de intakte bugspytkirtlen, kan manipuleres og overvåges lettere end i hele dyret ^4-6. Denne opsætning blev oprindelig udviklet i slutningen af 1970'erne og var siden forlænget til undersøgelse af flere exokrine væv, såsom spyt og mælkekirtler ^3-7. Især det giver studiet af sekretion med minimal indblanding på de komplekse cellulære organisationer i disse polariserede epithel.

Protocol

BEMÆRK: procedurer, der involverer dyreindivider er blevet godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Weizmann Institute of Science.

1. Prøvefremstilling

1. Isolering af pancreas acini
   1. Forbered 300 ml frisk Krebs-Ringer bicarbonat HEPES (KRBH), før du begynder. Bland 140 mM NaCI, 4,7 mM KCI, 1,16 mM _MgCl2, 1 mM _CaCl2, 11 mM glucose, 10 mM HEPES. Tilføj bovint serumalbumin (BSA) og 0,1 mg / ml sojabønnetrypsininhibitor (STI) (resuspenderingsmedium). Forbered 5 - 10 ml resuspenderingsmedium suppleret med collagenase (~ 0,75 mg / ml) (fordøjelse-medium).
   2. Ilte KRB medium for ~ 30 min. Tilføj BSA efter iltning at undgå bobler. Bring resuspension og fordøjelse medier til 37 ° C. BEMÆRK: ilte mediet reducerer celle dødelighed og forbedrer lydhørhed over for antidiabetika. Virkningen af ​​iltning fremgår mindst i 6 timer.
   2 kvælning, efter fastlagte retningslinier dyreplejepraksis. Placer ofrede dyr på ryggen, vedhæfte den til en dissektion pad og rengør den abdominale overflade med ethanol.
   BEMÆRK: For at undgå forurening, autoklavere dissektion værktøjer og det vand, der anvendes til KRBH medium inden brug. Filter KRBH medium gennem et 0,2 um filter. Før udskæring af bugspytkirtlen skylles dissektion værktøjer med 70% ethanol og udføre dissektion på en ren bænk. Udføre virusinfektioner i et niveau 3 biosikkerhed kabinet. Føj antibiotika til O / N-dyrkningsmedium (se afsnit 4).
2. Udskæring af muse pancreas
   1. Incision bredt den abdominale hud og subkutane lag. Identificer lever, mave, tarm, bugspytkirtel og milt (figur 1). BEMÆRK: I de følgende trin, håndtag pancreasvævet forsigtigt og undgå at anvende overdreven mekanisk kræfe for at forhindre automatisk fordøjelse af væv og celledød.
   2. Ved at bruge to stumpe pincet, træk tyndtarmen. Start ved tyndtarmen proksimale ende, nær afkørsel fra maven. Adskil bugspytkirtlen fra tarmen og beholde den i kroppen hulrum. Når nå tyktarmen, bemærker en lyserød / hvid bindevæv. Må ikke forveksle det med bugspytkirtlen.
   3. Fjern så meget pancreasvæv som muligt uden opsamling af fedt eller bindevæv. Fjern bugspytkirtel ved at afmontere det fra milten og maven og skærer abdominale blodkar under det (figur 1A-C).
      BEMÆRK: Da udbyttet af pancreas-acini fra et enkelt dyr er høj, kan man undlade at indsamle alle pancreasvævet for at forhindre opsamling af andre væv.
3. Collagenasefordøjelse
   1. Skyl bugspytkirtlen et par gange i resuspenderingsmedium opvarmet til 37 ° C, og fjerne de resterende dele af andre pancreasvæv. Fordyb bugspytkirtlen i ~ 5 ml forvarmet fordøjelse medium i et 20 ml scintillationshætteglas. Hakke bugspytkirtlen til at stykker af 1-3 mm. Placer den i et opvarmet vandbad (optimalt under omrøring af ~ 100 rpm). For at fremskynde fordøjelsen afpipettér fordøjet væv op og ned en gang hvert par minutter.
      BEMÆRK: Varigheden af ​​collagenasefordøjelse afhænger primært på collagenase-koncentrationen og mængden af ​​mekanisk kraft, der påføres på vævet. Anvendelse af 0,75 mg / ml collagenase i cirka 15 minutter og pipettering af vævet med et 5 ml polystyren-pipette med en 2 mm dyse hver 3. - 5 min, hvilket resulterer i acini på 10 - 30 celler. Efter fordøjelse, vises suspensionen grumset indeholder synlige stykker af væv. Da kollagenaser effektivitetsgevinster varierer mellem forskellige handelstyper og masser, bestemme tidspunktet for fordøjelsen empirisk.
   2. Vask og filtrering
      1. Overfør det fordøjede væv i et 50 ml rør og afslutte graveestion ved tilsætning af 45 ml resuspenderingsmedium. Filtreres suspensionen gennem et groft (~ 1 mm) metalnet i et frisk rør. Centrifugeres gennemstrømningen ved 100 x g i 3 minutter.
      2. Supernatanten fjernes, og resuspenderet de spaltede bugspytkirtlen i 50 ml resuspenderingsmedium. Filtreres suspensionen gennem en 70 eller 100 um nylonnet. Centrifugeres som før.
      3. For at fjerne flydende, beskadigede acini, supernatanten og resuspender pankreasvæv i 3 - 5 ml resuspenderingsmedium. Anvend 1 ml portioner af pancreas-acini i 15 ml koniske rør fyldt med 7 ml resuspenderingsmedium. Lad acini at nøjes med 2 - 3 min. Saml acini der har bosat sig i bunden af ​​røret med en 1 ml pipette, og gentag dette trin 2 - 3 gange.
      4. Se pancreas acini under en lys eller dissektionsmikroskop for at teste deres tilstand. I figur 2, iagttage renheden af isolation og skader påført cellerne During isolation. Brug disse acini straks eller kultur for op til 20 timer.

2. amylasesekretion Assay

BEMÆRK: amylasesekretion analysen fungerer som et globalt mål for den sekretoriske kapacitet pancreas acini. Dette opnås ved at opsamle det medium, hvori pancreas-acini blev inkuberet, og bestemmelse af amylase-aktivitet i mediet, sædvanligvis ved anvendelse af et kommercielt kit.

1. Bestem antallet af eksperimentelle betingelser, der skal undersøges (fx ikke-stimuleret vs stimuleret). Brug mindst tre gentagelser for hver tilstand. Hertil kommer, tilføje et sæt af gentagelser at bestemme det samlede cellulære amylase indhold ('total' prøve) og et sæt for amylase-aktivitet af mediet (»nul« prøve). Mærk en multi-brønds plade, hvor analysen vil blive udført, og to sæt mikrorør for hver af de gentagelser, der skal anvendes.
   BEMÆRK: 12 eller 24 brønds pladefiltre kan anvendes til at overvåge en og 0,5 ml acinære suspensioner hhv.
2. Vask acini to gange i 30 ml KRBH resuspenderingsmedium og inkubere dem i resuspenderingsmedium i 30 minutter ved 37 ° C. Til multi-brønds plade tilsættes en 10 gi dråbe sekretionsfremmende at nå passende slutkoncentration.
3. Pankreatiske acini reagere på en gradient af secretagogue i en tofaset måde. Koncentrationerne med optimale sekretion værdier er 50-100 pM Cholecystokinin (CCK) og 1 uM af Carbachol (figur 3A) ^5.
4. Vask og resuspender acini i resuspenderingsmedium. Sørg for, at acini er fordelt homogent i suspension og alikvote lige store mængder af suspensionen i multi-brønds plade og ind i 'total'-mærkede mikrorør. Inkubér pladen i 30 minutter ved 37 ° C. (Fortrinsvis i et vandbad under mild omrøring (~ 50 min)).
   BEMÆRK: Det nøjagtige antal acini kan variere mellem Experimentariumts men bør være ens i replikater inden hvert forsøg. Således præcis alikvoteringsprocessen af ​​acini suspensionen er kritisk for sammenligning mellem forskellige gentagelser og betingelser.
5. Under inkubationen producere 'total' og sågar prøver. Centrifuger 'total' mikrorør for få sekunder ved 5.000 × g, og fjern 50 pi fra supernatanten i »zero'-mærkede mikrorør og placere dem ved 4 ° C. Lyse den acini i 'total' prøver ved at tilsætte Triton X-100 til mikrorør at nå til en endelig koncentration på 1%. Vortexes mikrorør kraftigt.
   BEMÆRK: Aliquote den »totale« replikerer ligner gentagelser af forsøget. Lysering af acini, fører til frigivelse af det totale amylase indhold. Alternativt indsamler acini ved hver betingelse og lyseres ved slutningen af ​​forsøget for at bestemme den cellulære indhold af hver gentagelse.
6. Saml det meste af acinært suspension into det første sæt af præ-mærkede mikrorør. Centrifuger mikrorør i et par sekunder ved 5.000 × g. Supernatanten overføres til det andet sæt af præ-mærkede mikrorør.
7. Bestem supernatanten for amylaseaktivitet med en kommercielt kit. Procentdelen af ​​amylase udskilles.
   BEMÆRK: Det er afgørende at læse amylaseaktiviteten på sin lineære rækkevidde. Present procentdelen af ​​amylase udskilt som procenten af ​​amylase frigøres fra den indledende samlede indhold. Fratræk baggrunden amylase niveau af mediet fra hver tre eksemplarer og dividere det med den tilsvarende normaliseret indledende totale indhold.

3. Levende Imaging af pancreassekretion

Sekretion fra bugspytkirtlen acini kan overvåges direkte af direkte billedvisning. Ved hjælp af forskellige fluorescerende farvestoffer og sensorer, live billeddannelse tillader karakterisering af sekretion ved en sub-cellulær opløsning.

1. Forbered frisk iltet resuspenderingsmedium som jegn trin 1.1 og bringe det til 37 * C. Indstil mikroskopet, og hvis udstyret med en temperatur controller, tilpasse den til 37 * C.
2. Vask acinuscellerne i 30 ml resuspenderingsmedium og placere dem i et glas eller plastik dias. Bemærk: Hvis lipofile farvestoffer er at blive brugt til at mærke for plasmamembranen mærket med lipofile farvestoffer, plette acini i ikke mere end 5 minutter for at forhindre mærkning af interne membraner ved endocytose. Gennem arbejdet, håndtere acini forsigtigt og undgå overdreven pipettering.
3. Når på mikroskopet billedet acini hvis morfologi er klar, og undgå billeddannelse af acini der viser basolaterale blærer eller intracellulære vakuoler. Tilføj secretagogue dråbevis eller ved hjælp af en perfusionskammer, enten under eller umiddelbart forud for indledningen af ​​billeddannelse.
   BEMÆRK: En stor forstørrelse linser med høje numeriske åbninger (f.eks × 63 / 1.4 eller × 100 / 1,4) anbefales at observere subcellulære strukturer.

4. O / N-kultur Pankreatisk acini (Alternate Cell Culture Technique)

BEMÆRK: O / N-dyrkning er ofte brugt til Adeno virusinfektion. Infektion udføres ved 10 ⁶ -10 ⁷ pfu / ml i 9 - 16 timer før eksamen.

1. Kultur pancreas acini op til 20 timer. Resuspenderede acini opnået fra en enkelt bugspytkirtlen i 25 ml dyrkningsmedium (DMEM suppleret med føtalt kalveserum (FCS) (5%), natrium-pyruvat (1%), antibiotika (1%), L-glutamin (0,5%), BSA (10 mg / ml) og STI (0,2 mg / ml), og opdelt i fem 10cm plader. Inficere acini med virus i en niveau 3 biosikkerhed kabinet.
2. Inkuberet pancreas acini ved 37 ° C i en 5% _CO2 befugtet luft. Tillad acini at inddrive i iltet resuspenderingsmedium i 30 min før efterfølgende undersøgelse ^3,8.

Representative Results

Pancreas acini der blev isoleret ordentligt vise en stereotyp morfologi, når de ses ved gennemlysning. Deres basolaterale domæner skal vises rundt og blottet for bleb'er. Den apikale domæne er omgivet af hundredvis af sekretoriske vesikler og synes mørkere i farven (figur 2A, B). Kernerne placeret basal til vesikulær område. Cellerester og komponenter i pancreas gangsystemet og endokrine bugspytkirtlen, som kan detekteres ved tidlige stadier af acini isolering (figur 2C, D) bør være fraværende fra den endelige acinære suspensionen (figur 2A, B). Forkert isolering kan resultere i generering af basolaterale bleb'er og brud af celler, som udleder deres fordøjelsesenzymer i mediet (Figur 2E, F).

Amylase frigivelse fra bugspytkirtlen acini viser en bifasisk kurve når plottet mod koncentrationen af antidiabetika (figur 3A). WUden stimulering omkring 5% af det oprindelige indhold er frigivet i løbet af 30 minutters inkubation. Efter stimulering, er dette tal forhøjet med op til 5 gange. Acini der blev dyrket O / N, vise en lavere andel af stimuleret versus basal amylasefrigivelse sammenlignet med frisk isolerede acini. Det er vigtigt, dyrket acini, der blev inficeret med Adeno virus vise en høj basal amylasesekretion og en sensibiliseret stimuleret sekretion (figur 3B, C). Det er således afgørende at inficere kontrol acini med en tilsvarende dosis af kontrol-virus.

Live-billeddannelse af acini skal muliggøre en klar identifikation af de basolaterale og apikale domæner acinusceller. Lipofile farvestoffer kan være medvirkende til at skelne mellem den smalle apikale domæne og de ​​laterale og basolaterale aspekter af celler (Figur 4). Under fysiologiske stimulation sekretion udelukkende rettet mod den apikale overflade ^{på 1,9.} Anvendelse af F-actin-probe Lifeact-GFPtillader live visualisering af sekretoriske vesikler, da pancreas zymogen vesikler undergår actin belægning kort før exocytose (figur 4).

Figur 1. Lokalisering af bugspytkirtlen og tilstødende organer. (AC) bugspytkirtlen og tilstødende organer efter indsnit i den abdominale hud og subkutane lag (A), før og efter pancreas adskillelse fra tilstødende organer, (B) og (C), hhv. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2. Isolering af pancreas-acini. (A) og (B) i bugspytkirtlen acini isoleret ordentligt vise en stereotyp morfologi; deres basolaterale domæner vises rundt og blottet for blærer, mens deres apikale domæne er omgivet af hundredvis af sekretoriske vesikler og synes mørkere i farven (pil). (C) og (D) cellerester og komponenter s af pancreas gangsystemet kan påvises på tidlige stadier af acini isolation (pilen peger på en eksokrine kanal). (E) og (F) forkert isolering resulterer i generering af basolaterale bleb'er (E, pil) og brud af celler, som udleder deres fordøjelsesenzymer i mediet ( F, pil). Skalapanelerne repræsenterer 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Måling af amylase frigivelse fra isolerede acini. (A) Amylase frigivelse fra bugspytkirtlen acini skildrer en tofaset kurve når plottet mod koncentrationen af et secretagogue. Acini blev isoleret og venstre for at komme sig i 30 minutter før stimulering med de angivne koncentrationer af Cholecystokinin (CCK). Resultaterne repræsenterer gennemsnittet og SEM af tre uafhængige forsøg. (B) acini der blev dyrket O / N, vise en lavere andel af stimuleret versus basal amylasefrigivelse sammenlignet med frisk isolerede acini. Helstøbt acini der var smittet af Adeno virus vise en høj basal amylase sekretion og en sensibiliseret stimuleret sekretion. (C) Ikke-oxygenating dyrkningsbetingelser føre til overdreven discharge af amylase, der slører den stimulerende effekt af secretagogue.

Figur 4. Live-billeddannelse af pancreas sekretion. Levende stimuleret acinarceller, udtrykker Lifeact-GFP (LA, grøn, grå) og farvet med den lipofile farvestof FM4-64 (rød). Anvendelse af Lifeact sonden tillader live visualisering af enkelte fusionsbegivenheder af actin-coatede vesikler (pile). Celler blev inficeret O / N med adenovirus-Lifeact-GFP (Ad-Lifeact-GFP), farves og stimuleret kortvarigt med 100 pM CCK før initiering af billeddannelse. Målestokken repræsenterer 5 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Udover ex vivo kultur, alternative opstillinger til studiet af eksokrine sekretion omfatter intravital mikroskopi og måling af væsker fra pankreasgangen. Intravital mikroskopi blev vist sig at fungere godt i mus spytkirtler ^10. Denne metode kan optage sekretion i realtid i det intakte dyr, men er begrænset i sin beslutning og midlerne til at manipulere exokrine væv. Vurdering sekretion ved at samle fluider fra pankreasgangen blev opnået i bedøvede rotter ^11. Men da kanylering af pankreasgangen er yderst vanskelig, er denne metode anvendes sjældent.

Sammenlignet med disse opsætninger, ex vivo dyrkning af pancreas acini er enkel, hurtig og tillader tilgængelige midler til at overvåge og manipulere cellerne, uden at gribe ind med afholdelse af det intakte væv ^4,5. , Dette setup har dog sine mangler. Pancreasacinære celler er sarte natur og meget følsom over for variationer i dyrkningsbetingelser. Eftersom cellerne er fyldt med proteolytiske enzymer, er de tilbøjelige til at lyse og celledød. Som følge heraf er denne kultur er kortvarig og fører normalt ikke strække sig over 20 timer.

Det er altid bedst at identificere og løse problemer, når de opstår. Nøglen metodiske skridt er at isolere intakt pancreas acini uden væsentlige tegn på celleskader og dødelighed. Sådanne tegn er indlysende, og omfatter overdreven cellerester og acini med basolaterale blærer eller intracellulære vakuoler. I amylasesekretion analysen vil celleskader føre til en lav stimuleret / ikke-stimuleret sekretion ratio. For at forhindre en sådan skade, anbefales det at behandle vævet forsigtigt tilsættes BSA og STI til mediet og at berige det med ilt. For eksempel, uden iltning, overdreven celle udledning af amylase masker den stimulerende effekt af secretagogue (Figur3C). Men på grund af den skrøbelige exokrint væv, nogle vævsskade er næsten uundgåeligt - sådanne præparater skal kasseres.

For amylasesekretion assay supernatanten, som indeholder det secernerede amylase, men er fri for celler, der kan opbevares ved 4 ° C i 1 - 2 dage. Denne supernatant skal derefter analyseres ved en kommercielt kit. Mange tilgængelige kits er afhængige af en spaltning af et kunstigt amylase substrat og efterfølgende frigivelse af en chromophor. Således højere koncentrationer amylase fører til en hurtigere ændring i opløsningens farve. Da det udskilte amylase i sidste ende vil frigive alle kromoforen fra substratet, er det vigtigt at følge reaktionen over tid, og bruger kun opsamlet under den lineære fase data.

Live-billeddannelse af pancreas acini kan være en frustrerende oplevelse for forskeren. Nogle cellepræparater, især dem af inficeret acini, ikke kan være egnet til levendebilleddannelse på grund af kompromitteret morfologi acini eller utilstrækkelige niveauer af fluorescerende sensorer. Selv i passende forberedelser, kan det tage tid at finde passende prøver. Billeddiagnostik kan derfor kræve megen tid. Lifeact-GFP, en F-actin-probe er bemærkelsesværdigt ^12. Dette værktøj tillod os at følge dynamikken i F-actin under pancreassekretion for op til 16 timer efter infektion, på et niveau beslutning, som ikke kan nås i faste acinære prøver. Desuden brug af Lifeact sonde sporing af enkelte exocytose begivenheder, som pancreas zymogen vesikler gennemgå actin belægning kort før exocytosen ^3,13.

Kollektivt, når beherskes, de teknikker der er beskrevet her giver forskeren betyder at evaluere pancreassekretion, og sele til at identificere hidtil ukendte deltagere i denne multi-trins proces. Desuden, i betragtning af de strukturelle og funktionelle ligheder mellem bugspytkirtlen og andre exokrine organer,Disse teknikker kan anvendes på andre eksokrine væv samt ^3.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808