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Biology

अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं की स्रावी क्षमता का आकलन

Published: August 28, 2014 doi: 10.3791/51799
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, Weizmann Institute of Science

Summary

पृथक अग्नाशय acini उनके इन विवो आकारिकी और गतिविधि को बनाए रखने और निगरानी और स्राव जोड़ तोड़ के लिए शक्तिशाली तरीके प्रदान करते हैं. इस काम acini माउस अग्न्याशय से अलग किया जा सकता है, और उनके स्रावी क्षमता कैसे मूल्यांकन किया जा सकता है दर्शाता है.

Abstract

अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं के निर्माण और पाचन एंजाइमों का स्राव. इन कोशिकाओं को एक संयुक्त लुमेन रूपों और शेयर जो एक क्लस्टर के रूप में आयोजित कर रहे हैं. यह काम इन कोशिकाओं के स्राव का क्षमता अलग acini की संस्कृति से मूल्यांकन किया जा सकता है दर्शाता है. बरकरार बहि अग्न्याशय की कई विशेषताओं को बनाए रखने, जो पृथक acini, चालाकी और पूरे पशु की तुलना में अधिक आसानी से नजर रखी जा सकती क्योंकि सेटअप फायदेमंद है. पूर्व vivo संस्कृति acini के vivo प्रकृति का प्रतिनिधित्व करेंगे कि इतने अग्नाशय acini के समुचित अलगाव एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है. प्रोटोकॉल माउस अग्न्याशय से बरकरार acini अलग करने के लिए कैसे करें. बाद में, अग्नाशय के स्राव के मूल्यांकन के लिए दो पूरक तरीकों प्रस्तुत कर रहे हैं. अग्नाशय के स्राव का प्रत्यक्ष इमेजिंग एक उप सेलुलर संकल्प पर स्राव के लक्षण वर्णन अनुमति देता है, जबकि एमिलेज स्राव परख, एक वैश्विक उपाय के रूप में कार्य करता है. सामूहिक रूप से, तकनीक presenटेड यहाँ बहि: स्राव का अध्ययन करने के प्रयोगों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम सकें.

Introduction

बहि अग्न्याशय स्तनधारी अग्न्याशय का द्रव्यमान का सबसे गठन और पाचन एंजाइमों 1 के उत्पादन और स्राव के लिए समर्पित है. बहि अग्न्याशय, एसिनस, के कार्यात्मक इकाई एक संयुक्त लुमेन रूपों और शेयरों जो उपकला कोशिकाओं का एक समूह है. हार्मोनल या neuronal उत्तेजना पर, एंजाइमों से भर पुटिकाओं इसके साथ, शिखर कोशिका की सतह तक फ्यूज ले जाया जाता है और लुमेन 1-3 में अपनी सामग्री निष्कासित. स्रावित एंजाइमों तो वे पोषक तत्वों में भोजन के टूटने उत्प्रेरित जहां छोटी आंत में नलिकाओं की एक coalescing सेट से सूखा कर रहे हैं.

यह वीडियो पूरे अग्न्याशय से अलग कर रहे हैं और उनके स्रावी क्षमता कैसे मूल्यांकन किया जा सकता है कि कैसे बरकरार acini दर्शाता है. इस स्थापना का उपयोग कर, अग्नाशय के स्राव उत्तेजना के बाद जारी किया गया था कि एमिलेज के रिश्तेदार राशि को मापने के द्वारा मात्रा निर्धारित है. वैकल्पिक रूप से, स्राव अलग के उपयोग से लाइव imaged किया जा सकता हैसेंसर और रंजक.

बरकरार अग्न्याशय की कई विशेषताओं को बनाए रखने, जो पृथक acini, चालाकी और पूरे पशु 4-6 की तुलना में अधिक आसानी से नजर रखी जा सकती क्योंकि अग्नाशय acini के पूर्व vivo सेटअप फायदेमंद है. इस सेटअप मूल रूप से देर से 1970 में विकसित किया है और इस तरह के लार और स्तन ग्रंथियों 3-7 के रूप में कई बहि ऊतकों का अध्ययन के लिए बढ़ाया के बाद किया गया था. विशेष रूप से, यह इन polarized epithelia की जटिल सेलुलर संगठनों के लिए कम से कम हस्तक्षेप के साथ स्राव के अध्ययन की अनुमति देता है.

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Protocol

नोट: पशु विषयों को शामिल प्रक्रियाओं Weizmann विज्ञान संस्थान में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है.

1 नमूना तैयार

  1. अग्नाशय acini का अलगाव
    1. शुरू करने से पहले ताजा क्रेब्स-घंटी बाइकार्बोनेट HEPES (KRBH) माध्यम के 300 मिलीलीटर तैयार करें. 140 मिमी NaCl, 4.7 मिमी KCl, मिक्स 1.16 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी 2 CaCl, 11 मिमी ग्लूकोज, 10 मिमी HEPES. गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) और 0.1 मिलीग्राम / एमएल सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला (एसटीआई) (मेजबान मध्यम) जोड़ें. मध्यम Collagenase (~ 0.75 मिलीग्राम / एमएल) (पाचन मध्यम) के साथ पूरक मेजबान के 10 एमएल - 5 तैयार करें.
    2. ~ 30 मिनट के लिए KRB मध्यम आक्सीजन के साथ मिलना. बुदबुदाती को रोकने के लिए oxygenation के बाद बीएसए जोड़ें. 37 डिग्री सेल्सियस तक मेजबान और पाचन माध्यमों लाओ. नोट: मध्यम Oxygenating सेल मृत्यु दर कम कर देता है और secretagogues को जवाबदेही में सुधार. oxygenation के प्रभाव को कम से कम 6 घंटे के लिए स्पष्ट है.
      3. 2 asphyxiation द्वारा माउस बलिदान. अपने पीठ पर बलिदान पशु प्लेस एक विच्छेदन पैड को देते हैं और इथेनॉल के साथ पेट की सतह को साफ.
      नोट: संक्रमण से बचने के विच्छेदन उपकरण और उपयोग करने से पहले KRBH माध्यम के लिए उपयोग किए गए पानी आटोक्लेव करने के लिए. एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से KRBH मध्यम फ़िल्टर. पहले अग्न्याशय की छांटना को 70% इथेनॉल के साथ विच्छेदन उपकरण कुल्ला और एक साफ बेंच पर विच्छेदन बाहर ले. एक स्तर 3 जैव सुरक्षा कैबिनेट में वायरल संक्रमण बाहर ले. ओ / एन संवर्धन मध्यम करने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं जोड़ें (धारा 4 देखें).
  2. Murine अग्न्याशय की छांटना
    1. चीरा व्यापक रूप से पेट की त्वचा और चमड़े के नीचे की परत. जिगर, पेट, आंत, अग्न्याशय और प्लीहा (चित्रा 1) पहचानें. नोट: निम्न चरणों में, धीरे अग्नाशय के ऊतक संभाल और अत्यधिक यांत्रिक forc लागू करने से बचनेई ऊतक और कोशिका मृत्यु का ऑटो पाचन को रोकने के लिए.
    2. दो कुंद संदंश का उपयोग करके, छोटी आंत बाहर खींच. पेट से बाहर निकलने के पास, छोटी आंत समीपस्थ अंत में शुरू. आंत से अग्न्याशय अलग और शरीर गुहा के भीतर इसे बरकरार रखें. एक बार जब बड़ी आंत तक पहुंच गया, एक गुलाबी / सफेद संयोजी ऊतक नोटिस. अग्न्याशय के साथ यह भ्रमित मत करो.
    3. वसा या संयोजी ऊतक एकत्रित बिना जितना संभव अग्नाशय के ऊतक को साफ़ करें. तिल्ली और पेट से detaching और पेट की रक्त वाहिकाओं यह नीचे (चित्रा 1 ए सी) के काटने से अग्न्याशय निकालें.
      नोट: एक भी जानवर से अग्नाशय acini की उपज अधिक है के बाद से, एक अन्य ऊतकों का संग्रह को रोकने के क्रम में सभी अग्नाशय के ऊतक एकत्रित करने से बचना कर सकते हैं.
  3. Collagenase पाचन
    1. अग्न्याशय 37 डिग्री सेल्सियस तक गरम मेजबान माध्यम में कुछ बार कुल्ला और गैर अग्नाशय के शेष भागों को दूरऊतकों. एक 20 मिलीलीटर जगमगाहट शीशी में पूर्व गर्म पाचन माध्यम की ~ 5 मिलीलीटर में अग्न्याशय विसर्जित कर दिया. 1-3mm के टुकड़े करने के लिए अग्न्याशय कीमा. (बेहतर ~ 100 आरपीएम के आंदोलन के तहत) एक गर्म पानी के स्नान में जगह है. पाचन में तेजी लाने के लिए, पचा ऊतक ऊपर और नीचे एक बार हर कुछ मिनट विंदुक.
      नोट: collagenase पाचन की अवधि मुख्य रूप से collagenase एकाग्रता पर और ऊतक पर लागू यांत्रिक बल की राशि पर निर्भर है. 30 कोशिकाओं - 10 के acini में जिसके परिणामस्वरूप, 5 मिनट - लगभग 15 मिनट के लिए 0.75 मिलीग्राम / एमएल collagenase का उपयोग करें और एक 2 मिमी के साथ एक 5 मिलीलीटर polystyrene विंदुक के साथ ऊतक pipetting हर 3 छिद्र. पाचन के बाद निलंबन ऊतक के दृश्य टुकड़े युक्त परेशान दिखाई देता है. Collagenases क्षमता विभिन्न वाणिज्यिक प्रकार के और बहुत सारे के बीच होती है के बाद से, अनुभव से पाचन के समय निर्धारित करते हैं.
    2. धुलाई और फ़िल्टरिंग
      1. एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में पचा ऊतक स्थानांतरण और खुदाई समाप्तमेजबान माध्यम के 45 मिलीलीटर जोड़कर estion. एक मोटे के माध्यम से निलंबन फिल्टर (~ 1 मिमी) धातु एक ताजा ट्यूब में जाल. 3 मिनट के लिए प्रवाह के माध्यम से 100 × छ पर अपकेंद्रित्र.
      2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और मेजबान माध्यम के 50 मिलीलीटर में पचा अग्न्याशय resuspended. एक 70 या 100 माइक्रोन नायलॉन जाल के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर. पहले की तरह अपकेंद्रित्र.
      3. मेजबान मध्यम के 5 मिलीलीटर - चल, क्षतिग्रस्त acini हटाने सतह पर तैरनेवाला त्यागने और 3 में अग्नाशय के ऊतक resuspend करने के क्रम में. मेजबान माध्यम के 7 मिलीलीटर से भरा 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में अग्नाशय acini के 1 मिलीग्राम अंश लागू करें. 3 मिनट - acini 2 के लिए समझौता करने की अनुमति दें. एक 1 मिलीलीटर विंदुक के साथ ट्यूब के नीचे बसे है कि acini लीजिए, और इस चरण 2 दोहराने - 3 बार.
      4. उनकी हालत का परीक्षण करने के लिए एक प्रकाश या विदारक माइक्रोस्कोप के तहत अग्नाशय acini देखें. चित्रा 2 में, duri कोशिकाओं पर दिए गए अलगाव की पवित्रता और नुकसान का निरीक्षणएनजी अलगाव. अप करने के लिए 20 घंटे के लिए इन तुरंत acini या संस्कृति का प्रयोग करें.

2 एमाइलेस स्राव परख

नोट: एमिलेज स्राव परख अग्नाशय acini की स्रावी क्षमता के लिए एक वैश्विक उपाय के रूप में कार्य करता है. यह आमतौर पर एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर, अग्नाशय acini incubated रहे थे, जिसमें मध्यम इकट्ठा करने, और मध्यम के एमिलेज गतिविधि का निर्धारण करके हासिल की है.

  1. प्रयोगात्मक शर्तों की संख्या की जांच की जा करने के लिए निर्धारित बनाने के लिए (जैसे गैर प्रेरित बनाम प्रेरित). हर हालत के लिए कम से कम तीन प्रतिकृति का प्रयोग करें. इसके अलावा, मध्यम ('शून्य' नमूना) के एमिलेज गतिविधि के लिए कुल सेलुलर एमिलेज सामग्री ('कुल' नमूना) और एक सेट निर्धारित करने के लिए प्रतिकृति का एक सेट जोड़ें. एक बहु अच्छी तरह से परख का आयोजन किया जाएगा जिसमें थाली, और प्रतिकृति में से प्रत्येक के लिए microtubes के दो सेट लेबल इस्तेमाल किया जाएगा.
    नोट: 12 या 24 अच्छी तरह से थालीएस क्रमशः, कोष्ठकी निलंबन की 1 और 0.5 मिलीलीटर की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  2. KRBH मेजबान माध्यम के 30 मिलीलीटर में दो बार acini धो लें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मेजबान माध्यम में उन्हें सेते हैं. बहु अच्छी तरह से थाली करने के लिए उपयुक्त अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए secretagogue की एक 10μl ड्रॉप जोड़ें.
  3. अग्नाशय acini एक द्वि phasic ढंग से secretagogue की एक ढाल का जवाब. Cholecystokinin (CCK) और Carbachol की 1μM (चित्रा 3) के 100 5 बजे - इष्टतम स्राव मूल्यों के साथ सांद्रता 50 हैं.
  4. धोएं और मेजबान माध्यम में acini resuspend. Acini बहु अच्छी तरह से थाली में और 'total' लेबल microtubes में निलंबन के निलंबन और विभाज्य बराबर मात्रा में homogenously वितरित कर रहे हैं कि सुनिश्चित करें. 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए थाली सेते हैं. (संभवतः हल्के आंदोलन के तहत एक पानी के स्नान में (~ 50 आरपीएम)).
    नोट: acini की सही संख्या experimen के बीच भिन्न हो सकते हैंटीएस प्रत्येक प्रयोग के भीतर replicates में समान होना चाहिए, लेकिन. इस प्रकार, acini निलंबन की सटीक aliquoting विभिन्न replicates और स्थितियों के बीच तुलना करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  5. ऊष्मायन के दौरान, 'कुल' और 'शून्य' नमूने का उत्पादन. अपकेंद्रित्र 'कुल' 5000 × जी पर कुछ सेकंड के लिए microtubes और 'zero' लेबल microtubes में सतह पर तैरनेवाला से 50 μl हटाने और 4 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें जगह है. Lyse microtubes को ट्राइटन X-100 जोड़कर 'कुल' नमूने में acini 1% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने के लिए. सख्ती microtubes भंवर.
    नोट: 'कुल' प्रयोग की प्रतिकृति के समान replicates Aliquote. Acini lysing, कुल एमिलेज सामग्री की रिहाई के लिए जाता है. वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक को दोहराने के सेलुलर सामग्री का निर्धारण करने के लिए, प्रयोग के अंत में प्रत्येक हालत और Lyse पर acini इकट्ठा.
  6. कोष्ठकी निलंबन मैं के सबसे लीजिएपूर्व लेबल microtubes का पहला सेट Nto. 5,000 × जी पर कुछ सेकंड के लिए microtubes अपकेंद्रित्र. पूर्व लेबल microtubes के दूसरे सेट में स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
  7. एक वाणिज्यिक किट के साथ एमिलेज गतिविधि के लिए सतह पर तैरनेवाला परख. स्रावित एमिलेज के प्रतिशत की गणना.
    नोट: यह अपने रैखिक सीमा पर एमिलेज गतिविधि को पढ़ने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रारंभिक कुल सामग्री से जारी एमिलेज के प्रतिशत के रूप में स्रावित एमिलेज का प्रतिशत उपस्थित थे. प्रत्येक तीन प्रतियों से मध्यम की पृष्ठभूमि एमिलेज स्तर घटाएँ और इसी प्रकार सामान्यीकृत प्रारंभिक कुल सामग्री से विभाजित.

अग्नाशय के स्राव के 3 लाइव इमेजिंग

अग्नाशय acini से स्राव लाइव इमेजिंग द्वारा सीधे नजर रखी जा सकती है. विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों और सेंसर का उपयोग करना, लाइव इमेजिंग एक उप सेलुलर संकल्प पर स्राव के लक्षण वर्णन अनुमति देता है.

  1. हौसले से ऑक्सीजन मेजबान माध्यम के रूप में तैयार मैंn 1.1 कदम है और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इसे लाने. माइक्रोस्कोप सेट, और एक तापमान नियंत्रक के साथ सुसज्जित हैं, तो 37 डिग्री सेल्सियस के लिए इसे समायोजित.
  2. मेजबान माध्यम के 30 मिलीलीटर में कोष्ठकी कोशिकाओं को धो लें और एक गिलास या प्लास्टिक स्लाइड में उन्हें जगह है. नोट: lipophilic रंजक, lipophilic रंगों के साथ लेबल प्लाज्मा झिल्ली के लिए लेबल endocytosis द्वारा आंतरिक झिल्ली की लेबलिंग को रोकने के लिए नहीं अधिक से अधिक 5 मिनट के लिए acini दाग करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं. काम के दौरान, धीरे acini संभाल और अत्यधिक pipetting से बचें.
  3. माइक्रोस्कोप पर एक बार, जिनकी आकारिकी छवि acini स्पष्ट है, और basolateral blebs या intracellular रिक्तिकाएं प्रदर्शित जो acini की इमेजिंग से बचें. बुद्धिमान या के दौरान या तुरंत पहले इमेजिंग की दीक्षा के लिए, या तो एक छिड़काव कक्ष का उपयोग करके secretagogue बूंद जोड़ें.
    नोट: उच्च संख्यात्मक apertures के साथ एक उच्च वृद्धि लेंस (जैसे × 63 / 1.4 या 100 / 1.4 ×) subcellular संरचनाओं का निरीक्षण करने के लिए सिफारिश की है.

4. हे / अग्नाशय Acini के एन संस्कृति (वैकल्पिक सेल कल्चर तकनीक)

नोट: ओ / एन संवर्धन अक्सर एडिनो वायरस के संक्रमण के लिए प्रयोग किया जाता है. परीक्षा से पहले 16 घंटा - संक्रमण 9 के लिए 10 6 -10 7 pfu / मिलीलीटर में किया जाता है.

  1. अप करने के लिए 20 घंटे के लिए संस्कृति अग्नाशय acini. 25 मिलीलीटर संस्कृति मध्यम (DMEM में एक भी अग्न्याशय से प्राप्त resuspended acini भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) (5%), सोडियम पाइरूवेट (1%), एंटीबायोटिक दवाओं (1%), एल glutamine (0.5%), बीएसए के साथ पूरक (10 मिलीग्राम / एमएल) और एसटीआई (0.2 मिलीग्राम / एमएल), और पांच 10cm प्लेटें विभाजित. एक स्तर 3 जैव सुरक्षा कैबिनेट में वायरस के साथ acini संक्रमित.
  2. एक 5% सीओ 2 humidified हवा में 37 º सी में अग्नाशय acini incubated. Acini बाद परीक्षा 3,8 से पहले 30 मिनट के लिए ऑक्सीजन मेजबान माध्यम में ठीक करने के लिए अनुमति दें.

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Representative Results

प्रेषित प्रकाश द्वारा देखे जाने पर ठीक से पृथक किया गया कि अग्नाशय acini एक stereotypic आकारिकी प्रदर्शित करते हैं. उनके basolateral डोमेन दौर और blebs से रहित दिखाई देनी चाहिए. शिखर डोमेन स्रावी vesicles के सैकड़ों से घिरा हुआ है और रंग (चित्रा 2A, बी) में गहरे रंग दिखाई देता है. नाभिक vesicular क्षेत्र के लिए बेसल स्थित हैं. सेल मलबे और अग्नाशय ductal प्रणाली की और acini अलगाव (चित्रा -2, डी) के प्रारंभिक दौर में पता लगाया जा सकता है जो अंत: स्रावी अग्न्याशय, के घटकों, अंतिम कोष्ठकी निलंबन से अनुपस्थित होना चाहिए (चित्रा 2A, बी). अनुचित अलगाव उनके पाचन मध्यम (चित्रा 2 ई, एफ) में एंजाइमों जो मुक्ति basolateral blebs और कोशिकाओं का टूटना की पीढ़ी में हो सकता है.

Secretagogues की एकाग्रता (चित्रा 3) के खिलाफ साजिश रची जब अग्नाशय acini से एमाइलेस रिहाई एक द्वि phasic वक्र दर्शाया गया है. डब्ल्यूप्रारंभिक सामग्री के 5% के बारे में ithout उत्तेजना ऊष्मायन के 30 मिनट के दौरान जारी की है. उत्तेजना के बाद इस संख्या में 5 गुना करने के लिए ऊपर से उठाया है. हौसले से अलग acini की तुलना में जब सुसंस्कृत हे / एन थे जो Acini, बेसल एमिलेज रिहाई बनाम प्रेरित का एक कम अनुपात प्रदर्शित करते हैं. महत्वपूर्ण बात है, एडिनो वायरस से संक्रमित थे कि सुसंस्कृत acini एक उच्च बेसल एमिलेज स्राव को प्रदर्शित करने और संवेदनशील एक स्राव (चित्रा 3 बी, सी) को प्रेरित किया. यह नियंत्रण वायरस की एक ऐसी ही खुराक के साथ नियंत्रण acini संक्रमित करने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है.

Acini के लाइव इमेजिंग कोष्ठकी कोशिकाओं की basolateral और शिखर डोमेन की स्पष्ट पहचान की अनुमति चाहिए. Lipophilic रंगों संकीर्ण शिखर डोमेन और कोशिकाओं के पार्श्व और basolateral पहलुओं (चित्रा 4) के बीच भेद के लिए सहायक हो सकता है. शारीरिक उत्तेजना के तहत, स्राव शिखर सतह 1,9 करने के लिए विशेष रूप से निर्देश दिया है. एफ actin जांच Lifeact-GFP का प्रयोगअग्नाशय zymogen पुटिकाओं शीघ्र ही इससे पहले एक्सोसाइटोसिस (चित्रा 4) actin कोटिंग से गुजरना के बाद से, स्रावी vesicles के लाइव दृश्य की अनुमति देता.

चित्रा 1
अग्न्याशय और आसन्न अंगों के चित्र 1 स्थानीयकरण. (एसी) पेट की त्वचा और चमड़े के नीचे की परत (ए) का चीरा के बाद अग्न्याशय और आसन्न अंगों, पहले और अग्नाशय के पड़ोसी अंगों से जुदाई, (बी) और (सी) के बाद, क्रमशः. यहां क्लिक करें का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यह आंकड़ा.

चित्रा 2
अग्नाशय acini के 2 अलगाव चित्रा. (ए) और (बी) अग्नाशय acini ठीक से एक stereotypic आकारिकी प्रदर्शित पृथक; उनके शिखर डोमेन स्रावी vesicles के सैकड़ों से घिरा हुआ है और रंग (तीर) में गहरे रंग दिखाई देता है, जबकि उनके basolateral डोमेन., ​​गोल और blebs से रहित दिखाई देते हैं (सी) और अग्नाशय ductal प्रणाली (डी) सेल मलबे और घटक है पता लगाया जा सकता है (ई). acini अलगाव के प्रारंभिक दौर (एक बहि वाहिनी के लिए तीर अंक) और (एफ) को अपने पाचन माध्यम में एंजाइमों जो मुक्ति basolateral blebs (ई, तीर), और कोशिकाओं का टूटना की पीढ़ी, में अनुचित अलगाव परिणाम ( एफ, तीर). स्केल सलाखों 100 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें. चित्रा 3
एक secretagogue की एकाग्रता के खिलाफ साजिश रची है जब पृथक acini से एमिलेज रिहाई की चित्रा 3 मापन. अग्नाशय acini से (ए) एमाइलेस रिहाई एक द्वि phasic वक्र दर्शाया गया है. Acini अलग थे और Cholecystokinin (CCK) का संकेत सांद्रता के साथ उत्तेजना से पहले 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए छोड़ दिया है. परिणाम हौसले से अलग acini की तुलना में जब सुसंस्कृत हे / एन, बेसल एमिलेज रिहाई बनाम प्रेरित का एक कम अनुपात को प्रदर्शित किया गया है जो औसत और तीन स्वतंत्र प्रयोगों की SEM. (बी) Acini प्रतिनिधित्व करते हैं. एडिनो वायरस से संक्रमित थे कि संवर्धित acini एक उच्च बेसल एमिलेज स्राव और एक अवगत प्रेरित स्राव प्रदर्शित करते हैं. (सी) संस्कृति की स्थिति अत्यधिक डि नेतृत्व करने के लिए गैर oxygenatingएमिलेज, secretagogue की जो मास्क उत्तेजक प्रभाव के scharge.

चित्रा 4
चित्रा 4 अग्नाशय के स्राव के लाइव इमेजिंग. (ला, हरे, ग्रे) और lipophilic डाई FM4-64 (लाल) के साथ दाग Lifeact-GFP व्यक्त, कोष्ठकी कोशिकाओं को प्रेरित रहते हैं. Lifeact जांच का उपयोग actin में लिपटे पुटिकाओं (तीर) के एक संलयन घटनाओं का लाइव दृश्य की अनुमति देता. सेल, ओ / एन adenovirus-Lifeact-GFP (विज्ञापन Lifeact GFP) से संक्रमित दाग और इमेजिंग की दीक्षा से पहले 100 बजे CCK के साथ संक्षिप्त प्रेरित थे. स्केल बार 5 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

पूर्व vivo संस्कृति इसके अलावा, बहि: स्राव के अध्ययन के लिए वैकल्पिक setups अग्नाशय वाहिनी से तरल पदार्थ की intravital माइक्रोस्कोपी और माप शामिल हैं. Intravital माइक्रोस्कोपी लार 10 ग्रंथियों माउस में अच्छी तरह से संचालित करने के लिए दिखाया गया था. इस विधि बरकरार पशु में वास्तविक समय में स्राव रिकॉर्ड कर सकते हैं, लेकिन अपने संकल्प में और बहि ऊतक जोड़ तोड़ के लिए साधन के द्वारा सीमित है. अग्नाशय वाहिनी से तरल पदार्थ इकट्ठा करके स्राव का आकलन anesthetized चूहों 11 में हासिल की थी. अग्नाशय वाहिनी के केन्युलेशन अत्यंत मुश्किल है हालांकि, बाद से, इस विधि को शायद ही कभी इस्तेमाल किया जाता है.

इन setups के साथ तुलना में, अग्नाशय acini के पूर्व vivo संस्कृति, तेजी से आसान है और बरकरार ऊतक 4,5 के संगठन के साथ हस्तक्षेप किए बिना, निगरानी और कोशिकाओं को जोड़ तोड़ के लिए सुलभ साधन की अनुमति देता है. फिर भी, इस सेटअप अपनी कमियों है. अग्नाशयकोष्ठकी कोशिकाओं प्रकृति में नाजुक और संस्कृति की स्थिति में बदलाव के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं. कोशिकाओं एंजाइमों से भरी हुई हैं, वे सेल और कोशिका मृत्यु होने का खतरा है. एक परिणाम के रूप में, इस संस्कृति में 20 घंटे तक नहीं है आमतौर पर कम रहता है और.

यह पहचान और रूप में वे पैदा समस्याओं का निवारण करने के लिए हमेशा सर्वश्रेष्ठ है. कुंजी methodological कदम कोशिका क्षति और मृत्यु दर के महत्वपूर्ण संकेत के बिना बरकरार अग्नाशय acini अलग करने के लिए है. इस तरह के लक्षण आसानी से स्पष्ट कर रहे हैं, और basolateral blebs या intracellular रिक्तिकाएं साथ अत्यधिक सेल मलबे और acini शामिल हैं. एमिलेज़ स्त्राव परख में, सेल क्षति / गैर उत्तेजित के स्राव का अनुपात प्रेरित एक कम करने के लिए नेतृत्व करेंगे. इस तरह के नुकसान को रोकने के क्रम में, यह धीरे ऊतक संभाल मध्यम करने के लिए बीएसए और एसटीआई जोड़ने, और ऑक्सीजन के साथ यह समृद्ध करने की सिफारिश की है. उदाहरण के लिए, oxygenation के बिना, एमिलेज मास्क secretagogue के उत्तेजक प्रभाव के अत्यधिक सेल निर्वहन (चित्रा-3 सी). फिर भी, कारण बहि ऊतक की कमजोरी के लिए, कुछ ऊतकों को नुकसान लगभग अपरिहार्य है - इस तरह की तैयारी खारिज किया जाना चाहिए.

2 दिन - एमिलेज स्राव परख के लिए, स्रावित एमिलेज हैं लेकिन उसकी कोशिकाओं से मुक्त है जो सतह पर तैरनेवाला, 1 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है. इस सतह पर तैरनेवाला फिर से एक व्यावसायिक किट द्वारा assayed किया जाना चाहिए. बहुत से उपलब्ध किट एक कृत्रिम एमिलेज सब्सट्रेट की एक दरार और एक क्रोमोफोर के बाद रिलीज पर भरोसा करते हैं. इस प्रकार, उच्च एमिलेज सांद्रता समाधान के रंग में एक तेजी से परिवर्तन करने के लिए नेतृत्व. स्रावित एमिलेज अंततः सब्सट्रेट से सभी क्रोमोफोर जारी करेंगे के बाद से, यह समय के साथ प्रतिक्रिया का पालन करें, और केवल रैखिक चरण के दौरान एकत्र किए गए आंकड़ों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है.

अग्नाशय acini के लाइव इमेजिंग शोधकर्ता के लिए एक निराशा का अनुभव हो सकता है. संक्रमित acini की विशेष रूप से उन कुछ सेल की तैयारी,, लाइव के लिए उपयुक्त नहीं हो सकताकारण acini के साथ छेड़छाड़ की आकारिकी करने के लिए या फ्लोरोसेंट सेंसर की अपर्याप्त स्तर तक इमेजिंग. यहां तक ​​कि उपयुक्त तैयारी में, यह उचित नमूनों का पता लगाने में समय लग सकता है. इस प्रकार इमेजिंग काफी समय की आवश्यकता हो सकती है. Lifeact GFP, एक एफ actin जांच, उल्लेखनीय 12 है. यह उपकरण तय कोष्ठकी नमूने में नहीं पाया जा सकता है कि संकल्प के स्तर पर, संक्रमण के बाद 16 घंटे के लिए अग्नाशय के स्राव के दौरान एफ actin की गतिशीलता का पालन करने की अनुमति दी. इसके अलावा, अग्नाशय zymogen पुटिका के रूप में एकल एक्सोसाइटोसिस घटनाओं की Lifeact जांच सक्षम ट्रैकिंग, का उपयोग कुछ ही देर पहले एक्सोसाइटोसिस 3,13 actin कोटिंग से गुजरना.

महारत हासिल जब सामूहिक रूप से, यहाँ वर्णित तकनीक शोधकर्ता अग्नाशय के स्राव का मूल्यांकन करने के लिए इसका मतलब है प्रदान करते हैं, और दोहन से यह इस बहु कदम प्रक्रिया में उपन्यास प्रतिभागियों की पहचान करने के लिए. इसके अलावा, अग्न्याशय और अन्य बहि अंगों के बीच संरचनात्मक और कार्यात्मक समानता को देखते हुए,इन तकनीकों अन्य बहि ऊतकों के रूप में अच्छी तरह से 3 के लिए लागू किया जा सकता है.

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Acknowledgments

इस काम के बी एस अमेरिका इसराइल बीएसएफ से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया और EDSBS आणविक आनुवंशिकी में हिल्डा और सेसिल लुईस प्राध्यापकीय कुर्सी के एक अवलंबी है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ICR mice Harlan Any strain will do
HBSS Sigma Aldrich H8264 Can substitude for KRB
BSA Sigma Aldrich A7906 Fraction V
Trypsin inhibitor Sigma Aldrich T9003
Collagenase XI  Sigma Aldrich C0130
Nylon mesh BD Falcon 352360 70-100µm
Amylase infinity reagent  Thermo TR25421
CCK Sigma Aldrich C2175
FM4-64 Lifetechnologies F34653 Diluted to 16µM
20mL scintillation vial Sigma Aldrich Z190527
DeltaVision system  Applied Precision Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope Zeiss 60x/1.4 or 100x/1.4 objectives 
Ultra Microplate reader BioTek ELx808

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References

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  3. Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).
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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 90 कोशिका जीव विज्ञान बहि: स्राव अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं प्राथमिक संस्कृति exocytosis actin Lifeact
अग्नाशय कोष्ठकी कोशिकाओं की स्रावी क्षमता का आकलन
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Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. Assessing the Secretory Capacity of Pancreatic Acinar Cells. J. Vis. Exp. (90), e51799, doi:10.3791/51799 (2014).

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