Valutare la capacità secretoria delle cellule pancreatiche acinari

Summary

Isolato acini pancreatici mantengono la loro morfologia e l'attività in vivo ed offrono modi potenti per il controllo e la manipolazione della secrezione. Questo lavoro dimostra come acini possono essere isolate dal pancreas del mouse, e come le loro capacità di secrezione possono essere valutati.

Abstract

Cellule acinose pancreatiche producono e secernono enzimi digestivi. Queste cellule sono organizzate come un gruppo che forma e condivide un lume congiunta. Questo lavoro dimostra come la capacità secretoria di queste cellule può essere valutata mediante coltura di isolati acini. La configurazione è vantaggiosa in quanto acini isolato, che conservano molte caratteristiche del pancreas esocrino intatto può essere manipolata e controllata più facilmente che in tutta animali. Isolamento corretto di acini pancreas è un requisito chiave in modo che la cultura ex vivo rappresenterà la natura in vivo degli acini. Il protocollo dimostra come isolare acini intatti dal pancreas del mouse. Successivamente, due metodi complementari per la valutazione della secrezione pancreatica sono presentati. Il dosaggio secrezione dell'amilasi serve come misura globale, mentre l'imaging diretto della secrezione pancreatica permette la caratterizzazione della secrezione ad una risoluzione sub-cellulare. Collettivamente, le tecniche Presented qui consentono un ampio spettro di esperimenti per studiare la secrezione esocrina.

Introduction

Il pancreas esocrino costituisce la maggior parte della massa del pancreas mammiferi ed è dedicata alla produzione e secrezione di enzimi digestivi ^1. L'unità funzionale del pancreas esocrino, l'acino, è un ammasso di cellule epiteliali che formano e condivide un lume congiunta. Dopo stimolazione ormonale o neuronale, vescicole piene di enzimi vengono trasportati alla superficie della cellula apicale, si fondono con esso ed espellono il loro contenuto nel lume ^1-3. Gli enzimi secreti vengono poi svuotati da una serie coalescenza di condotti nel piccolo intestino, dove si catalizzano la ripartizione del cibo in sostanze nutritive.

Questo video dimostra come acini intatti sono isolate dal pancreas intero e come la loro capacità secretoria può essere valutata. Utilizzando questa impostazione, la secrezione pancreatica viene quantificato misurando la quantità relativa di amilasi che è stato rilasciato dopo stimolazione. In alternativa, la secrezione può essere realizzata live dall'uso di differentisensori e coloranti.

L'ex vivo installazione di acini pancreatici è vantaggiosa in quanto acini isolato, che conservano molte caratteristiche del pancreas intatti, può essere manipolata e controllata più facilmente che in tutta animali ^4-6. Questa configurazione è stato originariamente sviluppato alla fine degli anni 1970 ed è stato dato prorogato per lo studio di diversi tessuti esocrine, come salivari e ghiandole mammarie ^3-7. In particolare, consente lo studio della secrezione con la minima interferenza alle complesse organizzazioni cellulari di questi epiteli polarizzati.

Protocol

NOTA: Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati approvati dalla cura e uso degli animali Comitato Istituzionale (IACUC) presso il Weizmann Institute of Science.

Preparazione del campione 1

1. Isolamento di acini pancreatici
   1. Preparare 300 ml di fresca bicarbonato di Krebs-Ringer HEPES (KRBH) mezzo prima di iniziare. Mescolare 140 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.16 mM MgCl _2, 1 mM CaCl _2, 11 Glucosio mM, HEPES 10 mM. Aggiungi albumina sierica bovina (BSA) e / ml inibitore 0,1 mg di tripsina di soia (STI) (media risospensione). Preparare 5-10 ml di risospensione medie integrate con collagenasi (~ 0,75 mg / ml) (media digestione).
   2. Ossigenare il terreno KRB per ~ 30 min. Aggiungi BSA dopo ossigenazione per evitare di bubbling. Portare risospensione e digestione medium a 37 ° C. NOTA: ossigenante medio riduce la mortalità delle cellule e migliora la risposta ai secretagoghi. L'effetto di ossigenazione risulta almeno per 6 ore.
   2 asfissia, secondo le linee guida per la cura degli animali istituzionali. Posizionare l'animale sacrificato sulla sua schiena, allegarlo a un pad dissezione e pulire la superficie addominale con etanolo.
   NOTA: Per evitare contaminazioni, sterilizzare in autoclave gli strumenti di dissezione e l'acqua utilizzata per KRBH medio prima dell'uso. Filtrare KRBH mezzo attraverso un filtro da 0,2 micron. Prima di asportazione del pancreas sciacquare gli strumenti di dissezione con il 70% di etanolo e procedere dissezione su un banco pulito. Effettuare infezioni virali in un armadio livello 3 bio-sicurezza. Aggiungi antibiotici per l'/ N mezzo di coltura O (vedere paragrafo 4).
2. L'asportazione del pancreas murino
   1. Incisione ampiamente la cute addominale e lo strato sottocutaneo. Identificare il fegato, stomaco, intestino, pancreas e milza (Figura 1). NOTA: Nelle seguenti procedure, gestire il tessuto pancreatico delicatamente ed evitare l'applicazione di un eccessivo forc meccanicae per evitare l'auto-digestione della morte dei tessuti e delle cellule.
   2. Utilizzando due pinze smussate, tirare fuori il piccolo intestino. Inizia la piccola estremità prossimale dell'intestino, vicino all'uscita dallo stomaco. Separare il pancreas dall'intestino e conservarlo all'interno della cavità del corpo. Una volta raggiunto l'intestino crasso, notare un tessuto connettivo rosa / bianco. Da non confondere con il pancreas.
   3. Svuota il tessuto pancreatico quanto possibile senza la raccolta tessuto adiposo o connettivo. Rimuovere il pancreas staccando dalla milza e lo stomaco e il taglio dei vasi sanguigni addominali sotto di esso (Figura 1A-C).
      NOTA: Poiché il rendimento di acini pancreatici da un singolo animale è elevato, si può astenersi dal raccogliere tutto il tessuto pancreatico per impedire la raccolta di altri tessuti.
3. Collagenase digestione
   1. Sciacquare il pancreas un paio di volte in mezzo risospensione riscaldata a 37 ° C e rimuovere le rimanenti parti di non-pancreaticatessuti. Immergere il pancreas a ~ 5 ml di terreno digestione pre-riscaldato in un scintillazione flaconcino da 20 ml. Tritare il pancreas a pezzi di 1-3mm. Mettere in un bagno di acqua riscaldata (in modo ottimale sotto agitazione di ~ 100 rpm). Per accelerare la digestione, pipettare il tessuto digerito alto e verso il basso una volta ogni pochi minuti.
      NOTA: La durata della collagenasi digestione dipende principalmente dalla concentrazione collagenasi e dalla quantità di forza meccanica applicata sul tessuto. Uso di 0,75 mg / ml di collagenasi per circa 15 min e pipettaggio il tessuto con una pipetta da 5 ml in polistirolo con 2 mm foro di passaggio di ogni 3-5 minuti, con conseguente acini di 10-30 cellule. Dopo la digestione, la sospensione appare torbido, contenente frammenti visibili di tessuto. Dal Collagenasi efficienza varia tra i diversi tipi commerciali e lotti, determinare i tempi di digestione empiricamente.
   2. Lavaggio e filtraggio
      1. Trasferire il tessuto digerito in una provetta da 50 ml e terminare digestion aggiungendo 45 ml di mezzo di risospensione. Filtrare la sospensione attraverso una grossolana (~ 1 mm) rete metallica in una nuova provetta. Centrifugare la flow-through a 100 × g per 3 min.
      2. Eliminare il surnatante e risospeso il pancreas digeriti in 50 ml di mezzo di risospensione. Filtrare la sospensione attraverso una maglia di nylon 70 o 100 micron. Centrifugare come prima.
      3. Al fine di rimuovere galleggiante, acini danneggiati, scartare il surnatante e risospendere il tessuto pancreatico in 3 - 5 ml di mezzo di risospensione. Applicare 1 ml di acini pancreatici in 15 ml provette coniche riempiti con 7 ml di terreno risospensione. Lasciare che il acini di stabilirsi per 2 - 3 min. Raccogliere la acini che si sono stabiliti sul fondo della provetta con una pipetta 1 ml, e ripetere questo passaggio 2 - 3 volte.
      4. Visualizza il acini pancreas al microscopio ottico o dissezione per testare la loro condizione. Nella figura 2, osservare la purezza di isolamento e danni inflitti alle cellule Duriisolamento ng. Utilizzare questi acini immediatamente o cultura per un massimo di 20 ore.

2 Amilasi secrezione Assay

NOTA: Il test secrezione di amilasi serve come misura globale per la capacità secretoria di acini pancreatici. Ciò si ottiene raccogliendo il mezzo in cui gli acini pancreatici sono stati incubati, e determinando l'attività dell'amilasi del mezzo, in generale mediante un kit commerciale.

1. Determinare il numero di condizioni sperimentali da esaminare (ad esempio vs non-stimolata stimolato). Utilizzare almeno tre repliche per ogni condizione. Inoltre, aggiungere un set di repliche per determinare il contenuto totale cellulare amilasi (campione 'totale') e un set per l'attività amilasi del medium (campione di 'zero'). Etichettare una piastra multi-pozzetto in cui sarà condotta l'analisi, e due serie di microtubi per ciascuna delle repliche da utilizzare.
   NOTA: a 12 o 24 pozzettis può essere utilizzato per monitorare 1 e 0,5 ml di sospensioni acinose, rispettivamente.
2. Lavare la acini due volte in 30 ml di KRBH media di risospensione e incubare in mezzo risospensione per 30 minuti a 37 ° C. Per la piastra multi-bene aggiungere una goccia 10μl di secretagogue per raggiungere la concentrazione finale appropriato.
3. Acini pancreatici rispondono a un gradiente di secretagogo in maniera bi-fasica. Le concentrazioni con valori ottimali di secrezione sono 50 - 100 pM di colecistochinina (CCK) e 1μM di Carbachol (figura 3A) ^5.
4. Lavare e risospendere il acini in mezzo risospensione. Assicurarsi che le acini sono distribuiti in modo omogeneo nelle sospensioni e aliquote uguali quantità di sospensione nella piastra multi-bene e nei 'microtubi total' marcato. Incubare la piastra per 30 minuti a 37 ° C. (Preferibilmente in un bagno di acqua sotto agitazione lieve (~ 50 min)).
   NOTA: Il numero esatto di acini può variare tra sperits ma dovrebbero essere simili in replicati all'interno di ogni esperimento. Così, la suddivisione in aliquote precisa della sospensione acini è fondamentale per il confronto tra le diverse repliche e condizioni.
5. Durante l'incubazione, produrre il 'totale' e campioni "zero". Centrifugare le microprovette "totale" per pochi secondi a 5000 × g e rimuovere 50 microlitri dal surnatante in 'microtubi zero'-etichettati e metterli a 4 ° C. Lyse acini nei campioni "totale" con l'aggiunta di Triton X-100 per le microprovette per raggiungere una concentrazione finale di 1%. Agitare vigorosamente le microprovette.
   NOTA: Aliquote il 'totale' replica simile alle repliche dell'esperimento. Lisi delle acini, porta al rilascio del tenore totale di amilasi. In alternativa, raccogliere gli acini in ogni condizione e lisi, alla fine dell'esperimento, per determinare il contenuto cellulare di ogni replica.
6. Raccogliere la maggior parte della sospensione acinare into la prima serie di microtubi pre-etichettati. Centrifugare le microprovette per pochi secondi a 5.000 × g. Trasferire il surnatante nella seconda serie dei microtubi pre-etichettati.
7. Analizzare il surnatante per l'attività amilasica con un kit commerciale. Calcolare la percentuale di amilasi secreta.
   NOTA: E 'fondamentale leggere l'attività amilasica alla sua gamma lineare. Presentare la percentuale di amilasi secreta come la percentuale di amilasi liberato dal contenuto totale iniziale. Sottrarre il livello di fondo amilasi del mezzo da ogni triplice copia e dividerlo per il contenuto totale iniziale simile normalizzata.

3 Immagini dal vivo della secrezione pancreatica

La secrezione da acini pancreatici può essere monitorato direttamente da immagini dal vivo. Utilizzando vari coloranti fluorescenti e sensori, imaging dal vivo permette la caratterizzazione di secrezione ad una risoluzione sub-cellulare.

1. Preparare medio risospensione appena ossigenato come in punto 1.1 e portare a 37 ° C. Impostare il microscopio, e se dotato di un regolatore di temperatura, regolare a 37 ° C.
2. Lavare le cellule acinose in 30 ml di terreno di risospensione e metterli in un vetro o di plastica diapositiva. Nota: Se coloranti lipofili devono essere utilizzati per etichettare Per membrana plasmatica etichettati con coloranti lipofili, macchiare la acini per non più di 5 minuti per evitare l'etichettatura delle membrane interne per endocitosi. Durante il lavoro, gestire la acini dolcemente ed evitare un'eccessiva pipettaggio.
3. Una volta al microscopio, acini immagine la cui morfologia è chiara, ed evitare l'imaging di acini che visualizzano vesciche basolaterale o vacuoli intracellulari. Aggiungi secretagogue goccia a goccia o utilizzando una camera di perfusione, durante o immediatamente prima dell'inizio di imaging.
   NOTA: A lenti ad alto ingrandimento con alte aperture numeriche (ad esempio x 63 / 1,4 o × 100 / 1.4) si raccomanda di osservare le strutture subcellulari.

4. O / N Cultura del pancreas Acini (cellulare Alternate Cultura Tecnica)

NOTA: O / N coltura viene spesso utilizzato per l'infezione da virus adeno. L'infezione viene condotta a 10 ⁶ -10 ⁷ pfu / ml per 9 - 16 ore prima dell'esame.

1. Cultura acini pancreatici per un massimo di 20 ore. Acini risospese ottenuto da un unico pancreas in 25 ml di terreno di coltura (DMEM supplementato con siero fetale di vitello (FCS) (5%), sodio piruvato (1%), antibiotici (1%), L-glutammina (0,5%), BSA (10 mg / ml) e STI (0,2 mg / ml), e diviso per cinque piastre 10 centimetri. Infect acini con virus in un armadietto livello 3 biosicurezza.
2. Incubate acini pancreatici a 37 ° C in aria umidificata 5% di CO _2. Consenti acini di recuperare in media risospensione ossigenato per 30 minuti prima di successivo esame ^3,8.

Representative Results

Acini pancreas che sono stati isolati correttamente visualizzare una morfologia stereotipata se visti da luce trasmessa. I loro domini basolaterali dovrebbero apparire rotondo e privo di vesciche. Il dominio apicale è circondato da centinaia di vescicole secretorie e appare di colore più scuro (Figura 2A, B). I nuclei sono situati basale alla zona vescicolare. Detriti cellulari e componenti del sistema duttale del pancreas e del pancreas endocrino, che può essere rilevato nelle fasi iniziali di acini isolamento (Figura 2C, D), dovrebbero essere assenti dalla sospensione finale acinare (Figura 2A, B). Isolamento improprio può causare la generazione di vesciche basolaterale e la rottura delle cellule che scaricano il loro enzimi digestivi nel terreno (Figura 2E, F).

Rilascio Amilasi da acini pancreatici raffigura una curva bi-fasico quando tramato contro la concentrazione di secretagoghi (Figura 3A). Wenza stimolazione circa il 5% del contenuto iniziale viene rilasciato durante 30 minuti di incubazione. A seguito di stimolazione, questo numero è elevato fino a 5 volte. Acini che sono state coltivate O / N, visualizzare un rapporto più basso di stimolati vs rilascio amilasi basale rispetto al fresco isolato acini. È importante sottolineare che, colta acini che sono stati infettati da virus adeno- visualizzare una elevata secrezione di amilasi basale e stimolata la secrezione sensibilizzati (Figura 3B, C). E 'quindi fondamentale per infettare acini di controllo con una dose simile di virus controllo.

Immagini dal vivo di acini dovrebbe consentire una chiara identificazione dei domini basolaterale e apicali delle cellule acinose. Coloranti lipofili possono essere strumentali per distinguere tra il dominio apicale stretta e gli aspetti laterali e basolaterale delle cellule (Figura 4). Sotto stimolazione fisiologica, la secrezione è diretto esclusivamente alla superficie apicale ^1,9. L'uso della sonda F-actina Lifeact-GFPpermette la visualizzazione live di vescicole secretorie, dal momento che le vescicole zimogeno del pancreas sottoposti a rivestimento actina poco prima esocitosi (Figura 4).

Figura 1 Localizzazione del pancreas e degli organi adiacenti. (AC) Il pancreas e gli organi adiacenti dopo l'incisione della cute addominale e lo strato sottocutaneo (A), prima e dopo la separazione del pancreas da organi vicini, (B) e (C), rispettivamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 Isolamento di acini pancreatici. (A) e (B) del pancreas acini isolati visualizzare correttamente una morfologia stereotipato; loro domini basolaterali appaiono rotondo e privo di vesciche, mentre il loro dominio apicale sono circondati da centinaia di vescicole secretorie e appare di colore più scuro (freccia). (C) e (D), detriti cellulari e componenti s del sistema duttale del pancreas possono essere rilevati nelle fasi iniziali di isolamento acini (freccia indica un condotto esocrina). (E) e (F) risultati di isolamento impropri nella produzione di vesciche basolaterale (E, freccia), e la rottura delle cellule, che scaricano il loro enzimi digestivi nel mezzo ( F, freccia). Barre di scala rappresentano 100 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3 Misura del rilascio di amilasi da isolato acini. (A) rilascio Amilasi da acini pancreatici raffigura una curva bi-fasico quando tramato contro la concentrazione di un secretagogo. Acini sono stati isolati e lasciati a riposo per 30 minuti prima della stimolazione con le concentrazioni di colecistochinina (CCK) indicati. I risultati rappresentano la media e SEM di tre esperimenti indipendenti. (B) Acini che erano coltivate O / N, visualizzare un rapporto più basso di stimolati vs rilascio amilasi basale rispetto al fresco isolato acini. Colta acini che sono stati infettati da virus adeno- visualizzare una elevata secrezione di amilasi basale e stimolata la secrezione sensibilizzati. (C) non-ossigenazione condizioni di coltura portano alla eccessiva discharge di amilasi, che maschera l'effetto stimolante del secretagogue.

Figura 4 Immagini dal vivo della secrezione pancreatica. Vivete stimolato cellule acinose, esprimendo Lifeact-GFP (LA, verde, grigio) e colorati con il colorante lipofilo FM4-64 (rosso). L'uso della sonda Lifeact permette la visualizzazione in tempo reale degli eventi di fusione singoli di actina rivestite vescicole (frecce). Le cellule sono state infettate O / N con adenovirus-Lifeact-GFP (Ad-Lifeact-GFP), macchiati e stimolati brevemente con 100 pM CCK prima dell'inizio di imaging. Barra della scala rappresenta 5 micron. Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Oltre alla cultura ex vivo, configurazioni alternative per lo studio della secrezione esocrina includono la microscopia intravitale e la misurazione di fluidi dal dotto pancreatico. Microscopia intravitale ha dimostrato di operare bene nel topo ghiandole salivari ^10. Questo metodo può registrare la secrezione in tempo reale nel intatta di un animale, ma è limitato nella sua risoluzione e dai mezzi per manipolare il tessuto esocrino. Valutare la secrezione attraverso la raccolta di fluidi dal dotto pancreatico è stato raggiunto nei ratti anestetizzati ^11. Tuttavia, poiché incannulazione del dotto pancreatico è estremamente difficile, questo metodo viene usato raramente.

Rispetto a queste impostazioni, l'ex vivo cultura di acini pancreas è semplice, rapido e permette mezzo accessibile per il monitoraggio e la manipolazione delle cellule, senza interferire con l'organizzazione del tessuto intatto ^4,5. Tuttavia, questa configurazione ha i suoi difetti. Pancreaticocellule acinose sono delicati in natura e molto sensibile alle variazioni di condizioni di coltura. Poiché le cellule sono caricate con enzimi proteolitici, sono inclini a lisi e morte cellulare. Di conseguenza, questa cultura è di breve durata e di solito non dura più di 20 ore.

E 'sempre meglio identificare e risolvere i problemi che si presentano. Il passo metodologico fondamentale è quello di isolare acini pancreatici intatta senza segni significativi di danno cellulare e la mortalità. Tali segni sono evidenti, e includono eccessiva detriti cellulari e acini con vesciche basolaterale o vacuoli intracellulari. Nel saggio di secrezione di amilasi, danno cellulare porterà ad un basso stimolato / rapporto non-stimolata la secrezione. Per evitare tali danni, si consiglia di maneggiare il tessuto delicatamente, aggiungere BSA e STI al mezzo, e arricchirlo con l'ossigeno. Ad esempio, senza ossigenazione, eccessivo scarico cella di maschere amilasi l'effetto stimolante del secretagogue (Figura3C). Tuttavia, a causa della fragilità del tessuto esocrino, qualche danno tissutale è quasi inevitabile - tali preparazioni devono essere eliminati.

Per il saggio secrezione di amilasi, il surnatante, che contiene il amilasi secreta ma è privo di cellule, può essere conservato a 4 ° C per 1 - 2 giorni. Questo surnatante dovrebbe poi essere dosati con un kit commerciale. Molti kit disponibili si basano su una scissione di un substrato artificiale amilasi e il successivo rilascio di un cromoforo. Così, le concentrazioni di amilasi elevate portano ad un cambiamento rapido nel colore della soluzione. Dal momento che l'amilasi secreta alla fine rilascerà tutto il cromoforo dal substrato, è indispensabile seguire la reazione nel tempo, e utilizzare solo i dati raccolti durante la fase lineare.

Immagini dal vivo di acini pancreatici può essere un'esperienza frustrante per il ricercatore. Alcune preparazioni di cellule, in particolare quelli di acini infetti, non possono essere adatti per viveredi imaging a causa di morfologia compromessa degli acini o di livelli insufficienti di sensori fluorescenti. Anche in preparativi adeguati, può occorrere tempo per individuare campioni appropriati. Così l'imaging può richiedere molto tempo. Lifeact-GFP, una sonda F-actina, è degno di nota ^12. Questo strumento ci ha permesso di seguire le dinamiche di F-actina durante la secrezione pancreatica fino a 16 ore dopo l'infezione, a un livello di risoluzione che non poteva essere raggiunto in campioni acinar fisse. Inoltre, l'uso della sonda Lifeact tracciamento permesso di singoli eventi esocitosi, come vescicole zimogeno del pancreas sottoposti a rivestimento actina poco prima esocitosi ^3,13.

Collettivamente, quando padronanza, le tecniche qui descritte offrono il ricercatore mezzi per valutare la secrezione pancreatica, e imbracatura per identificare nuovi partecipanti in questo processo multi-step. Inoltre, in considerazione delle analogie strutturali e funzionali tra il pancreas e altri organi esocrine,queste tecniche possono essere applicate ad altri tessuti esocrine e ^3.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ICR mice	Harlan		Any strain will do
HBSS	Sigma Aldrich	H8264	Can substitude for KRB
BSA	Sigma Aldrich	A7906	Fraction V
Trypsin inhibitor	Sigma Aldrich	T9003
Collagenase XI	Sigma Aldrich	C0130
Nylon mesh	BD Falcon	352360	70-100µm
Amylase infinity reagent	Thermo	TR25421
CCK	Sigma Aldrich	C2175
FM4-64	Lifetechnologies	F34653	Diluted to 16µM
20mL scintillation vial	Sigma Aldrich	Z190527
DeltaVision system	Applied Precision		Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus)
Zeiss 510 or 710 confocal microscope	Zeiss		60x/1.4 or 100x/1.4 objectives
Ultra Microplate reader	BioTek	ELx808