Summary
Isolados ácinos pancreáticos manter a sua morfologia in vivo e atividade e oferecer maneiras poderosas para a monitoração e manipulação de secreção. Este trabalho demonstra como ácinos pode ser isolada a partir do pâncreas do rato, e como as suas capacidades de secreção pode ser avaliada.
Abstract
Células acinares do pâncreas produzir e secretar enzimas digestivas. Estas células são organizadas como um conjunto que forma e partilha uma luz comum. Este trabalho demonstra como a capacidade de secreção dessas células pode ser avaliada por cultura de isolado ácinos. A configuração é vantajosa, uma vez ácinos isolado, que retêm muitas das características do pâncreas exócrino intacto pode ser manipulado e monitorizado mais facilmente do que em todo o animal. Isolamento adequado dos ácinos pancreáticos é um requisito essencial para que a cultura ex vivo irá representar a natureza in vivo dos ácinos. O protocolo demonstra como isolar intacta ácinos do pâncreas do rato. Posteriormente, dois métodos complementares para avaliar a secreção pancreática são apresentados. O ensaio de secreção de amilase serve como uma medida global, enquanto a imagem directa da secreção pancreática permite a caracterização de secreção com uma resolução sub-celular. Coletivamente, as técnicas presented aqui possibilitar um largo espectro de experiências para estudar a secreção exócrina.
Introduction
O pâncreas exócrino constitui a maior parte da massa do pâncreas dos mamíferos e é dedicado à produção e secreção de enzimas digestivas 1. A unidade funcional do pâncreas exócrino, o ácino, é um aglomerado de células epiteliais que formam partes e um lúmen conjunta. Após a estimulação hormonal ou neuronal, as vesículas cheias com enzimas são transportados para a superfície celular apical, fusível com ele e expelir o seu conteúdo para dentro do lúmen 1-3. As enzimas secretadas são, em seguida, drenada por um conjunto de condutas de coalescência para o intestino delgado, onde eles catalisam a quebra dos alimentos em nutrientes.
Este vídeo demonstra como ácinos intactos são isolados a partir de todo o pâncreas, e como a sua capacidade de secreção pode ser avaliada. Usando esta configuração, a secreção pancreática é quantificada através da medição da quantidade relativa de amilase que foi lançado após a estimulação. Alternativamente, a secreção pode ser trabalhada ao vivo através da utilização de diferentessensores e corantes.
A configuração ex vivo de ácinos pancreáticos é vantajoso uma vez que ácinos isolado, que retêm muitas das características dos pâncreas intacto, pode ser manipulado mais facilmente e monitorizados em que o animal inteiro 4-6. Esta configuração foi originalmente desenvolvido no final dos anos 1970 e foi estendido desde para o estudo de vários tecidos exócrinas, como a saliva e glândulas mamárias 3-7. Notavelmente, que permite o estudo da secreção com uma interferência mínima com as organizações celulares complexos destes epitélios polarizados.
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Protocol
NOTA: Os procedimentos que envolvem seres animais foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional (IACUC) no Instituto de Ciência Weizmann.
Preparação 1 Amostra
- Isolamento de ácinos pancreáticos
- Prepare 300 ml de doce de bicarbonato de Krebs-Ringer HEPES (KRBH) médio antes de começar. Misturar NaCl 140 mM, KCl 4,7 mM, 1,16 mM de MgCl2, 1 mM de CaCl2, 11 mM de glucose, 10 mM de HEPES. Adicionar a albumina de soro bovino (BSA) e 0,1 mg / ml de inibidor de tripsina de soja (STI) (meio de ressuspensão). Prepare 5-10 ml de meio de ressuspensão suplementados com colagenase (~ 0,75 mg / ml) (meio de digestão).
- Oxigenar o meio KRB para ~ 30 min. Adicionar BSA após oxigenação para evitar formação de bolhas. Traga a ressuspensão e digestão médiuns a 37 ° C. NOTA: Oxigenante a forma reduz a mortalidade celular e melhora a capacidade de resposta de secreção. O efeito de oxigenação é aparente pelo menos durante 6 horas.
NOTA: Para evitar a contaminação, autoclave os instrumentos de dissecação e da água utilizada para médias KRBH antes do uso. Filtre KRBH meio através de um filtro de 0,2 um. Antes da excisão do pâncreas lavar os instrumentos de dissecação, com 70% de etanol e realização da dissecção em uma bancada limpa. Realizar infecções virais em nível 3 gabinete bio-segurança. Adicione antibióticos para o O / N meio de cultura (ver secção 4).
- Incisão amplamente a pele abdominal e camada subcutânea. Identificar o fígado, estômago, intestino, pâncreas e baço (Figura 1). NOTA: Nas etapas seguintes, lidar com o tecido pancreático suavemente e evitar a aplicação de forc mecânico excessivoe para evitar a auto-digestão da morte de células e tecidos.
- Usando duas pinças sem corte, retire o intestino delgado. Iniciar a extremidade proximal do intestino pequeno, perto da saída do estômago. Separa-se do pâncreas a partir do intestino e retê-la no interior da cavidade do corpo. Depois de chegar ao intestino grosso, observe um tecido conjuntivo rosa / branco. Não confundir com o pâncreas.
- Limpe o máximo de tecido pancreático quanto possível, sem coleta de tecido adiposo ou conjuntivo. Remover o pâncreas destacando-o a partir do baço e do estômago e cortando os vasos sanguíneos abdominais por baixo dele (Figura 1A-C).
Observação: Uma vez que o rendimento de ácinos pancreáticos a partir de um único animal é elevada, pode abster-se da recolha de todo o tecido do pâncreas, a fim de evitar a recolha de outros tecidos.
- Lavar os pâncreas algumas vezes em meio de ressuspensão aquecidas a 37 ° C e remover as partes restantes do não-pancreáticatecidos. Imergir os pâncreas ~ 5 ml de meio de pré-digestão foi aquecida num frasco de cintilação de 20 ml. Picar o pâncreas a peças de 1-3mm. Coloque-o em um banho de água aquecida (de forma otimizada sob agitação de ~ 100 rpm). Para acelerar a digestão, pipetar o up tecido digerido e para baixo uma vez a cada poucos minutos.
NOTA: A duração da digestão da colagenase depende principalmente da concentração de colagenase e da quantidade de força mecânica aplicada no tecido. Utilização de 0,75 mg / ml de colagenase durante aproximadamente 15 minutos e a pipetagem do tecido com uma pipeta de 5 ml de poliestireno com um orifício de dois milímetros cada 3-5 minutos, resultando em ácinos de 10-30 células. Após a digestão, a suspensão se turvas, contendo pedaços visíveis de tecido. Desde colagenases eficiência varia entre os diferentes tipos comerciais e lotes, determinar o tempo de digestão empiricamente. - Lavagem e filtragem
- Transferir o tecido digerido para um tubo de 50 ml e encerrar escavaçãoestion pela adição de 45 ml de meio de ressuspensão. Filtra-se a suspensão através de um grosso (~ 1 mm), malha de metal para um novo tubo. Centrifuga-se o fluxo de passagem a 100 x g durante 3 min.
- Descartar o sobrenadante e ressuspenderam-se os pâncreas digeridos em 50 ml de meio de ressuspensão. Filtra-se a suspensão através de uma malha de nylon de 70 ou 100 mm. Centrífuga como antes.
- A fim de remover flutuante, ácinos danificado, descartar o sobrenadante e ressuspender o tecido pancreático em 3-5 ml de meio de ressuspensão. Aplicar um ml da ácinos pancreáticos em 15 ml de tubos cónicos contendo 7 ml de meio de ressuspensão. Permitir que os ácinos se contentar com 2-3 min. Recolhe-se o ácinos que se estabeleceram para o fundo do tubo com uma pipeta de 1 ml, e repetir este passo de 2 - 3 vezes.
- Ver o ácinos pancreáticos sob um microscópio de luz ou de dissecação para testar a sua condição. Na Figura 2, observar a pureza de isolamento e os danos infligidos sobre as células Duriisolamento ng. Use estas ácinos imediatamente ou cultura para até 20 horas.
2. Amylase Secreção Assay
NOTA: O ensaio de secreção de amilase serve como uma medida global para a capacidade de secreção de ácinos pancreáticos. Isto é conseguido através da recolha do meio no qual a ácinos pancreáticos foram incubados, e a determinação da actividade da amilase de o meio, geralmente, utilizando um kit comercial.
- Determinar o número de condições experimentais devem ser ouvidas (vs. por exemplo não estimulada estimulada). Use pelo menos três repetições para cada condição. Além disso, incluir um conjunto de réplicas para determinar o teor total celular amilase (amostra "total") e um conjunto para a actividade de amilase da média ("zero" da amostra). Rotular uma placa de multi-cavidades em que o ensaio será conduzido, e dois conjuntos de microtubos para cada uma das repetições, para ser usado.
NOTA: 12 ou 24 poçoss pode ser utilizado para monitorizar um e 0,5 ml de suspensões acinares, respectivamente. - Lava-se a ácinos duas vezes em 30 ml de meio de ressuspensão KRBH e incubar em meio de re-suspensão, durante 30 min a 37 ° C. Para a placa de multi-poços adicionar uma gota de 10 ul de secretagogo para atingir a concentração final adequada.
- Ácinos pancreáticos responder a um gradiente de secretagogo de uma forma bifásica. As concentrações com valores de secreção óptimas são 50 - 100 pM de colecistoquinina (CCK) e 1 uM de carbacol (Figura 3A) 5.
- Lave e ressuspender o ácinos em meio a ressuspensão. Certifique-se de que os ácinos são distribuídos de forma homogénea em suspensão e as alíquotas de quantidades iguais de suspensão na placa multi-poços e na dos microtubos marcado com total'. Incubar a placa durante 30 minutos a 37 ° C. (De preferência, em um banho de água sob agitação suave (~ 50 min)).
NOTA: O número exato de ácinos pode variar entre experiments, mas deve ser semelhante em repetições de cada experimento. Assim, precisa de alíquotas da suspensão ácinos é crítica para a comparação entre diferentes repetições e condições. - Durante a incubação, produzir o 'total' e amostras nulas. Centrifugar os microtubos "total" para alguns segundos a 5000 × g e remover 50 ul do sobrenadante para 'microtubos zero' rotulados e colocá-los a 4 ° C. Lise ácinos nas amostras "totais" pela adição de Triton X-100 para os microtubos para atingir uma concentração final de 1%. Vortex os microtubos vigorosamente.
NOTA: Aliquote o 'total' replica semelhante às repetições do experimento. Lise dos ácinos, leva à liberação do conteúdo total de amilase. Em alternativa, recolher os ácinos em cada condição e lise no fim da experiência, para determinar o conteúdo celular de cada replicado. - Recolha a maior parte da suspensão de i acinarnto do primeiro conjunto de microtubos pré-rotulados. Centrifugar os microtubos por alguns segundos a 5.000 × g. Transferir o sobrenadante para o segundo conjunto de microtubos pré-rotulados.
- Ensaiar o sobrenadante para a actividade de amilase com um kit comercial. Calcula-se a percentagem da amilase secretada.
NOTA: É fundamental ler a atividade da amilase na sua gama linear. Apresentar percentual de amilase secretada como o percentual da amilase liberado do conteúdo total inicial. Subtrair o nível de fundo amilase do meio de cada triplicado e dividi-lo pelo conteúdo total inicial semelhante normalizado.
3 Imagens ao vivo da secreção pancreática
Secreção de ácinos pancreáticos podem ser monitorados diretamente por imagens ao vivo. Usando vários corantes fluorescentes e sensores, imagens em tempo real permite caracterizar a secreção de uma resolução sub-celular.
- Prepare médio ressuspensão recém oxigenado como in passo 1.1 e trazê-lo a 37 ° C. Defina o microscópio, e se equipado com um controlador de temperatura, ajuste-a a 37 ° C.
- Lave as células acinares em 30 ml de meio de ressuspensão e colocá-los num vidro ou plástico deslizante. Nota: Se corantes lipofílicos estão a ser utilizados para rotular Para membrana plasmática marcada com corantes lipofílicos, manchar a ácinos por não mais de 5 min para evitar a rotulagem de membranas internas por endocitose. Ao longo do trabalho, lidar com os ácinos suavemente e evitar pipetagem excessiva.
- Uma vez no microscópio, imagem ácinos cuja morfologia é clara, e evitar a imagem de ácinos que apresentam bolhas basolateral ou vacúolos intracelulares. Adicionar gota secretagogo sensato ou usando uma câmara de perfusão, durante ou imediatamente antes do início da imagiologia.
Nota: Um lentes de alta ampliação com altas aberturas numéricas (por exemplo × 63 / 1.4 ou × 100 / 1,4) é recomendado para observar estruturas subcelulares.
4. O / N Cultura de pâncreas Acini (técnica de cultura celular Alternate)
NOTA: O / N cultura é muitas vezes usado para a infecção pelo vírus adeno. A infecção é realizada a 10 6 -10 7 pfu / ml durante 9-16 horas antes do exame.
- Cultura ácinos pancreáticos por até 20 horas. Ácinos ressuspensos obtidos a partir de um único pâncreas em 25 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com soro fetal de vitelo (FCS) (5%),-piruvato de sódio (1%), antibióticos (1%), L-glutamina (0,5%), BSA (10 mg / ml) e STI (0,2 mg / ml), e divididas em cinco placas de 10 centímetros. Infect ácinos com vírus no nível 3 do armário de bio-segurança.
- Incubadas ácinos pancreáticos a 37 ° C em um ar de 5% de CO 2 umidificado. Permitir ácinos se recuperar em meio a ressuspensão oxigenado para 30 min antes do exame posterior 3,8.
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Representative Results
Ácinos do pâncreas que foram isolados correctamente exibir uma morfologia estereotipado quando vistas pela luz transmitida. Seus domínios basolateral deve aparecer redonda e sem bolhas. O domínio apical é rodeado por centenas de vesículas secretoras e aparecer de cor mais escura (Figura 2A, B). Os núcleos estão localizados basal para a área vesicular. Detritos e componentes do sistema ductal pancreático e do pâncreas endócrino, que pode ser detectada nos primeiros estádios de isolamento ácinos (Figura 2C, D) celular, deveria estar ausente da suspensão acinar final (Figura 2A, B). Isolamento inadequado pode resultar em geração de bolhas basolateral e quebra das células que lançam as suas enzimas digestivas para o meio (Figura 2E, F).
A libertação da amilase de ácinos pancreáticos descreve uma curva bifásica, quando registada em função da concentração de secretagogos (Figura 3A). Without estimulação cerca de 5% do teor inicial é libertado durante 30 minutos de incubação. Após a estimulação, este número pode ser elevado até 5 vezes. Acini que foram cultivadas S / N, exibem uma relação mais baixa de libertação de amilase estimulada vs basal quando comparado a isolados de fresco ácinos. É importante ressaltar que ácinos culta que foram infectados por vírus adeno apresentar uma secreção basal alta amilase e sensibilizados secreção (Figura 3B, C) estimulado. É, portanto, crucial para infectar ácinos de controlo com a mesma dose de vírus de controlo.
Imagens ao vivo de ácinos deve permitir uma identificação clara dos domínios basolateral e apical das células acinares. Corantes lipofílicos pode ser instrumental para distinguir entre o domínio apical estreito e as faces laterais e basolateral das células (Figura 4). Sob estímulo fisiológico, a secreção é dirigido exclusivamente para a superfície apical 1,9. Utilização da sonda de actina F Lifeact-GFPpermite a visualização ao vivo das vesículas secretoras, uma vez que as vesículas de zimogênio pancreáticas sofrem de revestimento pouco antes da exocitose de actina (figura 4).
Figura 1 Localização do pâncreas e órgãos adjacentes. (AC) O pâncreas e órgãos adjacentes após a incisão da pele abdominal e camada subcutânea (A), antes e após a separação de pâncreas de órgãos vizinhos, (B) e (C), respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior esta figura.
Figura 2 Isolamento de ácinos pancreáticos. (A) e (B) pâncreas isolado ácinos exibir corretamente uma morfologia estereotipado; seus domínios basolaterais aparecem rodada e desprovida de bolhas, enquanto o seu domínio apical está rodeado por centenas de vesículas secretoras e aparecer de cor mais escura (seta). (C) e (D) de detritos e componentes celulares s do sistema ductal pancreático pode ser detectada nas fases iniciais de isolamento ácinos (seta aponta para um duto exócrina). (E) e (F) os resultados de isolamento impróprios na geração de bolhas basolateral (E, seta), e ruptura de células, que lançam as suas enzimas digestivas para o meio ( F, seta). Barras de escala representam 100 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3 Medição da libertação da amilase de ácinos isolado. (A) a libertação da amilase de ácinos pancreáticos descreve uma curva bifásica, quando registada em função da concentração de um secretagogo. Ácinos foram isoladas e deixadas em repouso durante 30 minutos antes do estímulo com as concentrações indicadas de colecistoquinina (CCK). Os resultados representam a média e SEM de três experiências independentes. (B), que foram cultivadas Acini S / N, exibem uma relação mais baixa de libertação de amilase estimulada vs basal quando comparado a isolados de fresco ácinos. Ácinos cultivadas que foram infectadas pelo vírus adeno exibir uma elevada secreção de amilase e uma secreção basal estimulada sensibilizados. (C) não oxigenar as condições de cultura para levar di excessivascharge de amilase, que mascara o efeito estimulante do secretagogue.
Figura 4 imagens ao vivo da secreção pancreática. Vivo estimulada células acinares, expressando Lifeact-GFP (LA, verde, cinza) e corados com o corante lipofílico FM4-64 (vermelho). Utilização da sonda Lifeact permite a visualização directa dos acontecimentos de fusão único de vesículas revestidas de actina (setas). As células foram infectadas S / N com adenovírus-Lifeact-GFP (Ad-Lifeact-GFP), coradas e estimuladas brevemente com 100 pM de CCK, antes do início de imagiologia. Barra de escala representa 5 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Além disso a cultura ex vivo, configurações alternativas para o estudo da secreção exócrina incluem microscopia intravital e medição de fluidos do ducto pancreático. Microscopia intravital foi mostrado para operar bem na rato glândulas salivares 10. Este método pode gravar a secreção em tempo real no animal intacto, mas é limitada na sua resolução e por os meios para a manipulação do tecido exócrino. Avaliando a secreção através da recolha de fluidos do ducto pancreático foi conseguida em 11 ratos anestesiados. No entanto, uma vez que a canulação do dueto pancreático é extremamente difícil, este método é raramente utilizado.
Em comparação com estas configurações, a cultura ex vivo de ácinos pancreáticos é simples, rápido e permite que os meios acessíveis para a monitorização e manipulação de células, sem interferir com a organização do tecido intacto 4,5. No entanto, esta configuração tem suas deficiências. Pâncreascélulas acinares são delicadas na natureza e muito sensível a variações nas condições de cultura. Uma vez que as células são carregadas com enzimas proteolíticas, que são propensos a lise e morte das células. Como conseqüência, esta cultura é de curta duração e, geralmente, não dura mais de 20 horas.
É sempre melhor para identificar e solucionar problemas que possam surgir. O passo metodológico fundamental é isolar ácinos pancreáticos intacta, sem sinais significativos de danos celulares e mortalidade. Tais sinais são prontamente aparente, e incluem os resíduos celulares excessiva e ácinos com bolhas ou vacúolos intracelulares basolateral. No ensaio de secreção de amilase, dano celular irá levar a um baixo rácio estimulada / não-estimulados de secreção. A fim de evitar tais danos, recomenda-se a tratar o tecido suavemente, adiciona-se BSA e IST para o meio, e ao enriquecimento em oxigénio. Por exemplo, sem oxigenação, descarga excessiva de células de máscaras de amilase, o efeito estimulador do secretagogo (Figura3C). No entanto, devido à fragilidade do tecido exócrino, algum dano tecidual é quase inevitável - tais preparações devem ser descartados.
Para o ensaio de secreção de amilase, o sobrenadante, que contém a amilase secretada, mas está livre de células, pode ser mantida a 4 ° C durante 1 - 2 dias. Este sobrenadante deve então ser testada por um kit comercial. Muitos kits disponíveis dependem de uma clivagem de um substrato amilase artificial ea subsequente libertação de um cromóforo. Assim, as concentrações mais elevadas de amilase levar a uma rápida mudança de cor da solução. Uma vez que a amilase secretada acabará por liberar todo o cromóforo do substrato, é essencial para acompanhar a reação ao longo do tempo, e utilizar apenas os dados recolhidos durante a fase linear.
Imagens ao vivo de ácinos pancreáticos pode ser uma experiência frustrante para o pesquisador. Algumas preparações de células, especialmente as de ácinos infectado, pode não ser adequado para viverimagiologia devido à morfologia dos ácinos comprometida ou para níveis insuficientes de os sensores fluorescentes. Mesmo em preparações adequadas, pode demorar algum tempo para localizar amostras apropriadas. Assim imagem pode exigir um tempo considerável. Lifeact-GFP, uma sonda de F-actina, é digno de nota 12. Esta ferramenta permitiu seguir a dinâmica de F-actina durante a secreção pancreática até 16 horas após a infecção, a um nível de resolução, que não poderia ser atingido em amostras acinares fixos. Além disso, o uso da sonda Lifeact rastreio activado de eventos exocitose individuais, como vesículas zimogênio pancreáticas sofrem de revestimento pouco antes da exocitose da actina 3,13.
Colectivamente, quando dominado, as técnicas descritas aqui oferecer o pesquisador meios para avaliar a secreção pancreática, e por isso arnês para identificar novos participantes neste processo multi-passo. Além disso, tendo em conta as semelhanças estruturais e funcionais entre os pâncreas e outros órgãos exócrinas,estas técnicas podem ser aplicadas a outros tecidos exócrinas assim 3.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação da BSF EUA-Israel para BS e EDSBS é um titular da cátedra Hilda e Cecil Lewis em Genética Molecular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | Harlan | Any strain will do | |
| HBSS | Sigma Aldrich | H8264 | Can substitude for KRB |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Fraction V |
| Trypsin inhibitor | Sigma Aldrich | T9003 | |
| Collagenase XI | Sigma Aldrich | C0130 | |
| Nylon mesh | BD Falcon | 352360 | 70-100µm |
| Amylase infinity reagent | Thermo | TR25421 | |
| CCK | Sigma Aldrich | C2175 | |
| FM4-64 | Lifetechnologies | F34653 | Diluted to 16µM |
| 20mL scintillation vial | Sigma Aldrich | Z190527 | |
| DeltaVision system | Applied Precision | Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus) | |
| Zeiss 510 or 710 confocal microscope | Zeiss | 60x/1.4 or 100x/1.4 objectives | |
| Ultra Microplate reader | BioTek | ELx808 |
References
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