Summary
Acinos pancreáticos aislados conservan su morfología y actividad in vivo y ofrecen maneras de gran alcance para el seguimiento y la manipulación de la secreción. Este trabajo demuestra cómo acinos se pueden aislar a partir del páncreas de ratón, y cómo se pueden evaluar sus capacidades secretoras.
Abstract
Células acinares pancreáticas producen y secretan las enzimas digestivas. Estas células están organizadas como un grupo que forma un lumen y acciones conjuntas. Este trabajo demuestra cómo la capacidad secretora de estas células puede evaluarse por cultivo de acinos aislados. La configuración es ventajosa, ya aislado acinos, que conservan muchas de las características del páncreas exocrino intacta puede ser manipulado y controlado más fácilmente que en el animal entero. Aislamiento adecuado de los acinos pancreáticos es un requisito clave para que el cultivo ex vivo representará a la naturaleza in vivo de los acinos. El protocolo demuestra cómo aislar acinos intacta desde el páncreas de ratón. Posteriormente, se presentan dos métodos complementarios para la evaluación de la secreción pancreática. El ensayo de secreción de amilasa sirve como una medida global, mientras que la imagen directa de la secreción pancreática permite la caracterización de la secreción a una resolución subcelular. Colectivamente, las técnicas PresenTed aquí, permite un amplio espectro de experimentos para estudiar la secreción exocrina.
Introduction
El páncreas exocrino constituye la mayor parte de la masa del páncreas de mamíferos y está dedicada a la producción y secreción de enzimas digestivas 1. La unidad funcional del páncreas exocrino, el acino, es un grupo de células epiteliales que forman y comparte un lumen conjunta. Tras la estimulación hormonal o neuronal, vesículas llenas de enzimas son transportados a la superficie celular apical, fusible con ella y expulsan su contenido en el lumen 1-3. Las enzimas secretadas se escurrieron entonces por un conjunto de coalescencia de los conductos en el intestino delgado, donde se catalizan la descomposición de los alimentos en nutrientes.
Este video muestra cómo acinos intacta se aisló de todo el páncreas y cómo su capacidad secretora se puede evaluar. Utilizando esta configuración, la secreción pancreática se cuantifica midiendo la cantidad relativa de amilasa que se publicó después de la estimulación. Alternativamente, la secreción se pueden obtener imágenes en vivo por el uso de diferentessensores y colorantes.
La configuración ex vivo de acinos pancreáticos es ventajoso ya aislado acinos, que conservan muchas de las características del páncreas intactos, puede ser manipulado y controlado más fácilmente que en el animal entero 4-6. Esta configuración fue desarrollado originalmente en la década de 1970 y fue puesto prorrogado por el estudio de varios tejidos exocrinas, como las glándulas salivales y mamarias 3-7. En particular, permite el estudio de la secreción con un mínimo de interferencia a las complejas organizaciones celulares de estos epitelios polarizados.
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Protocol
NOTA: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo Comisión Institucional (IACUC) en el Instituto Weizmann de Ciencias.
1. Preparación de muestras
- Aislamiento de acinos pancreáticos
- Preparar 300 ml de bicarbonato fresco Krebs-Ringer HEPES (KRBH) medio antes de empezar. Mezclar NaCl 140 mM, KCl 4,7 mM, 1,16 mM MgCl2, CaCl2 1 mM, 11 mM de glucosa, 10 mM HEPES. Añadir albúmina de suero bovino (BSA) y el inhibidor de 0,1 mg / ml de tripsina de soja (STI) (medio de resuspensión). Preparar de 5 - 10 ml de la resuspensión medio suplementado con colagenasa (~ 0,75 mg / ml) (medio de digestión).
- Oxigenar el medio KRB durante ~ 30 min. Añadir BSA después de la oxigenación para prevenir el burbujeo. Traiga resuspensión y digestión medios a 37 ° C. NOTA: oxigenar el medio reduce la mortalidad celular y mejora la respuesta a secretagogos. El efecto de la oxigenación es evidente por lo menos durante 6 horas.
NOTA: Con el fin de evitar la contaminación, autoclave las herramientas de disección y el agua utilizada para el medio KRBH antes de su uso. Filtra medio KRBH a través de un filtro de 0,2 micras. Antes de la escisión del páncreas enjuagar las herramientas de disección con 70% de etanol y llevar a cabo la disección en un banco limpio. Realizar las infecciones virales en un gabinete de bioseguridad de nivel 3. Añadir antibióticos a la / medio de cultivo N O (ver sección 4).
- Incisión ampliamente la piel abdominal y la capa subcutánea. Identificar el hígado, el estómago, el intestino, el páncreas y el bazo (Figura 1). NOTA: En los siguientes pasos, manejar el tejido pancreático con cuidado y no aplique excesiva forc mecánicaE para prevenir auto-digestión del tejido y la muerte celular.
- Mediante el uso de dos pinzas romas, sacar el intestino delgado. Comienza en el extremo proximal del intestino pequeño, cerca de la salida del estómago. Separar el páncreas a partir del intestino y retener dentro de la cavidad corporal. Una vez que llega al intestino grueso, notar un tejido conectivo de color rosa / blanco. No lo confunda con el páncreas.
- Desactive mayor cantidad de tejido pancreático posible sin recoger el tejido graso o conectivo. Retire el páncreas separándolo del bazo y el estómago y el corte de los vasos sanguíneos abdominales debajo de ella (Figura 1A-C).
NOTA: Debido a que el rendimiento de los acinos pancreáticos de un solo animal es alta, uno puede abstenerse de recolectar todo el tejido pancreático para evitar que la recolección de otros tejidos.
- Enjuague el páncreas un par de veces en medio de resuspensión calentado a 37 ° C y retirar el resto de partes de no pancreáticatejidos. Sumerja el páncreas en ~ 5 ml de medio de digestión precalentado en un vial de centelleo de 20 ml. Picar el páncreas para piezas de 1-3 mm. Colóquelo en un baño de agua caliente (de manera óptima con agitación de ~ 100 rpm). Para acelerar la digestión, la pipeta hasta el tejido digerido y abajo una vez cada pocos minutos.
NOTA: La duración de la digestión con colagenasa depende principalmente de la concentración de colagenasa y de la cantidad de fuerza mecánica aplicada sobre el tejido. El uso de 0,75 mg / ml de colagenasa durante aproximadamente 15 min y pipeteando el tejido con una pipeta de 5 ml de poliestireno con un orificio de 2 mm cada 3 - 5 min, resultando en acinos de 10 - 30 células. Después de la digestión, la suspensión aparece turbia que contiene fragmentos visibles de tejido. Desde colagenasas eficiencia varía entre los diferentes tipos comerciales y lotes, determinar el momento de la digestión empíricamente. - Lavado y filtrado
- Transferir el tejido digerido en un tubo de 50 ml y terminar excavaciónestion añadiendo 45 ml de medio de resuspensión. Se filtra la suspensión a través de una gruesa (~ 1 mm) de malla metálica en un tubo nuevo. Centrifugar el flujo a través a 100 × g durante 3 min.
- Descartar el sobrenadante y se resuspendió el páncreas digeridos en 50 ml de medio de resuspensión. Se filtra la suspensión a través de una malla de nylon 70 o 100 micras. Centrifugar como antes.
- Con el fin de eliminar flotante, acinos dañado, descartar el sobrenadante y resuspender el tejido pancreático en 3 - 5 ml de medio de resuspensión. Aplicar 1 ml de la acinos pancreáticos en 15 ml tubos cónicos llenos de 7 ml de medio de resuspensión. Permita que los acinos se asiente durante 2 - 3 min. Recoger los acinos que se han asentado en la parte inferior del tubo con una pipeta de 1 ml, y repetir este paso 2 - 3 veces.
- Ver el acinos pancreáticos bajo un microscopio de luz o de disección para comprobar su estado. En la Figura 2, observar la pureza de aislamiento y daños infligidos a las células duriaislamiento ng. Utilice estos acinos inmediata o la cultura para un máximo de 20 horas.
2. amilasa Secreción Ensayo
NOTA: El ensayo de secreción de amilasa sirve como una medida global de la capacidad secretora de acinos pancreáticos. Esto se consigue recogiendo el medio en el que se incubaron los acinos pancreáticos, y la determinación de la actividad de la amilasa del medio, por lo general mediante el uso de un kit comercial.
- Determinar el número de condiciones experimentales que deben examinarse (frente a por ejemplo no estimulado-estimulado). Use al menos tres réplicas para cada condición. Además, añadir un conjunto de réplicas para determinar el contenido celular total amilasa (muestra "total") y un conjunto para la actividad de la amilasa del medio ("cero" de la muestra). Etiquetar una placa de múltiples pocillos en la que se llevará a cabo el ensayo, y dos juegos de microtubos para cada una de las repeticiones que se utilizará.
NOTA: de 12 ó 24 pocillos placas se puede utilizar para controlar 1 y 0,5 ml de suspensiones acinares, respectivamente. - Lave los acinos dos veces en 30 ml de medio de resuspensión KRBH e incubar en medio de resuspensión durante 30 minutos a 37 ° C. Para la placa de múltiples pocillos añadir una gota de 10μl secretagogo para alcanzar la concentración final apropiada.
- Acinos pancreáticos responden a un gradiente de secretagogo de una manera bifásica. Las concentraciones con valores óptimos de secreción son 50 - 100 pM de colecistoquinina (CCK) y 1μM de carbacol (Figura 3A) 5.
- Lavar y volver a suspender los acinos en medio de resuspensión. Asegúrese de que los acinos se distribuyen homogéneamente en suspensión y las alícuotas iguales cantidades de suspensión en la placa de múltiples pocillos y en los "microtubos total' marcado. Incubar la placa durante 30 minutos a 37 ° C. (Preferiblemente en un baño de agua bajo agitación suave (~ 50 rpm)).
NOTA: El número exacto de los acinos puede variar entre experiments, pero deben ser similares en las réplicas en cada experimento. Por lo tanto, precisa alícuotas de la suspensión acinos es crítico para la comparación entre las diferentes repeticiones y condiciones. - Durante la incubación, producir el "total" y "cero" muestras. Centrifugar los microtubos 'integrales' para unos segundos a 5000 × g y eliminar 50 l del sobrenadante en "microtubos-etiquetados zero' y colocarlos a 4 ° C. Lyse los acinos en las muestras "total" mediante la adición de Triton X-100 a los microtubos para llegar a una concentración final de 1%. Vortex los microtubos vigorosamente.
NOTA: aliquote el "total" replica similar a las réplicas del experimento. Lisis de los acinos, conduce a la liberación del contenido total de amilasa. Alternativamente, recoger los acinos en cada condición y se lisan al final del experimento, para determinar el contenido celular de cada réplica. - Recoger la mayor parte de la suspensión i acinarnto el primer conjunto de los microtubos pre-etiquetados. Centrifugar los microtubos durante unos segundos a 5000 × g. Transferir el sobrenadante en el segundo conjunto de los microtubos pre-etiquetados.
- Ensayar el sobrenadante para la actividad de la amilasa con un kit comercial. Calcular el porcentaje de la amilasa secretada.
NOTA: Es muy importante leer la actividad de la amilasa en su rango lineal. Presentar el porcentaje de la amilasa secretada como el porcentaje de la amilasa liberada de contenido total inicial. Reste el nivel de fondo de la amilasa del medio de cada uno por triplicado y se divide por el contenido total inicial similar normalizado.
3. imágenes en vivo de la secreción pancreática
La secreción de acinos pancreáticos se puede controlar directamente por imágenes en vivo. Utilizando varios colorantes fluorescentes y sensores, imágenes en directo permite la caracterización de la secreción a una resolución subcelular.
- Preparar medio de resuspensión oxigenada como in paso 1.1 y llevarlo a 37 º C. Ajuste el microscopio, y si está equipado con un controlador de temperatura, ajuste a 37 ° C.
- Lavar las células acinares en 30 ml de medio de resuspensión y colocarlos en un vaso de plástico o diapositiva. Nota: Si colorantes lipófilos se van a utilizar para etiquetar Para membrana plasmática marcada con colorantes lipófilos, manchar los acinos por no más de 5 minutos para evitar el etiquetado de las membranas internas por endocitosis. A lo largo de la obra, manejar los acinos con suavidad y evitar pipeteo excesiva.
- Una vez en el microscopio, acinos imagen cuya morfología es clara, y evitar la proyección de imagen de acinos que muestran ampollas basolateral o vacuolas intracelulares. Añadir gota secretagogo de sabia o mediante el uso de una cámara de perfusión, ya sea durante o inmediatamente antes de la iniciación de la formación de imágenes.
NOTA: A altas lentes de aumento con altas aperturas numéricas (por ejemplo × 63 / 1.4 o × 100 / 1,4) se recomienda para observar estructuras subcelulares.
4. O / N de Cultura pancreático Acinos (Cell alternativo Técnica Cultura)
NOTA: O / N de cultivo se utiliza a menudo para la infección por virus adeno. La infección se llevó a cabo a 10 6 -10 7 pfu / ml para 9 - 16 horas antes del examen.
- Cultura acinos pancreáticos para un máximo de 20 horas. Acinos resuspendidas obtenidos a partir de un único páncreas en 25 ml de medio de cultivo (DMEM complementado con suero de ternero fetal (FCS) (5%), piruvato de sodio (1%), antibióticos (1%), L-glutamina (0,5%), BSA (10 mg / ml) y STI (0,2 mg / ml), y se divide a cinco placas de 10 cm. infectan los acinos con el virus en un gabinete de seguridad biológica de nivel 3.
- Se incubó acinos pancreáticos a 37 ° C en un aire humidificado 5% de CO 2. Permitir acinos se recuperen en medio de resuspensión oxigenada durante 30 minutos antes de su examen ulterior 3,8.
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Representative Results
Acinos pancreáticos que fueron aisladas adecuadamente mostrar una morfología estereotipado cuando se observa con luz transmitida. Sus dominios basolateral deben aparecer redonda y carente de ampollas. El dominio apical está rodeado de cientos de vesículas secretoras y aparece de color más oscuro (Figura 2A, B). Los núcleos se encuentran basal a la zona vesicular. Escombros y componentes del sistema ductal pancreático y del páncreas endocrino, que se puede detectar en las primeras etapas de aislamiento acinos (Figura 2C, D) de la célula, deben estar ausentes de la suspensión acinar final (Figura 2A, B). Aislamiento inadecuado puede resultar en la generación de ampollas basolateral y la rotura de las células que vierten su digestivo enzimas en el medio (Figura 2 E, F).
La liberación de amilasa de acinos pancreáticos representa una curva bifásica cuando se representa frente a la concentración de secretagogos (Figura 3A). Without estimulación aproximadamente el 5% del contenido inicial se libera durante 30 min de incubación. Después de la estimulación, este número es elevado por hasta 5 veces. Acinos que se cultivaron O / N, mostrar una disminución de la relación estimulada contra la liberación de amilasa basal en comparación con los recién aisladas acinos. Es importante destacar que, acinos cultivadas que fueron infectados por virus adeno mostrar una alta secreción de amilasa basal y estimulada la secreción de una sensibilizados (Figura 3B, C). Por tanto, es fundamental para infectar acinos de control con una dosis similar de virus control.
Imágenes en vivo de acinos debe permitir una clara identificación de los dominios basolateral y apical de las células acinares. Colorantes lipófilos pueden ser instrumentales para distinguir entre el dominio apical estrecho y los aspectos laterales y basolateral de las células (Figura 4). Bajo estimulación fisiológica, la secreción se dirige exclusivamente a la superficie apical 1,9. Uso de la sonda de F-actina Lifeact-GFPpermite la visualización en vivo de vesículas secretoras, desde vesículas de zimógeno pancreático se someten a recubrimiento de actina poco antes de la exocitosis (Figura 4).
Figura 1. Localización del páncreas y los órganos adyacentes. (AC) El páncreas y órganos adyacentes después de la incisión de la piel abdominal y la capa subcutánea (A), antes y después de la separación de páncreas de órganos vecinos, (B) y (C), respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 Aislamiento de acinos pancreáticos. (A) y (B) de páncreas acinos aislados mostrar correctamente una morfología estereotipado; sus dominios basolateral aparecen redonda y carente de ampollas, mientras que su dominio apical están rodeados por cientos de vesículas secretoras y aparece de color más oscuro (flecha). (C) y (D) de los desechos y componentes celulares s del sistema ductal pancreático se pueden detectar en las primeras etapas de aislamiento acinos (flecha apunta a un conducto de exocrina). (E) y (F) de aislamiento resultados incorrectos en la generación de ampollas basolateral (E, flecha), y la rotura de las células, que vierten su digestivo enzimas en el medio ( F, flecha). Las barras de escala representan 100 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 
Figura 3. Medición de la liberación de amilasa desde acinar aislada. (A) la liberación de amilasa de acinos pancreáticos representa una curva bifásica cuando se representa frente a la concentración de un secretagogo. Acinos se aislaron y se dejó que se recuperaran durante 30 min antes de la estimulación con las concentraciones indicadas de colecistoquinina (CCK). Los resultados representan la media y SEM de tres experimentos independientes. (B) acinos que eran cultivadas O / N, mostrar una disminución de la relación estimulado frente a la liberación de amilasa basal en comparación con recién aisladas acinos. Acinos cultivadas que fueron infectados por el virus adeno mostrar una alta secreción de amilasa basal y una secreción estimulada sensibilizado. (C) para no oxigenar condiciones de cultivo conducen a un exceso de discharge de la amilasa, que enmascara el efecto estimulante del secretagogo.
Figura 4. de imágenes en vivo de la secreción pancreática. Live estimuló las células acinares, expresando Lifeact-GFP (LA, verde, gris) y se tiñeron con el colorante lipófilo FM4-64 (rojo). El uso de la sonda Lifeact permite la visualización en vivo de eventos de fusión de vesículas individuales recubiertos de actina (flechas). Las células se infectaron O / N con adenovirus-Lifeact-GFP (Ad-Lifeact-GFP), se tiñeron y se estimularon brevemente con CCK 100 pM antes de la iniciación de la formación de imágenes. La barra de escala representa el 5 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Además del cultivo ex vivo, configuraciones alternativas para el estudio de la secreción exocrina incluyen microscopía intravital y medición de fluidos desde el conducto pancreático. Microscopía intravital se demostró que operar bien en el ratón glándulas salivales 10. Este método puede grabar la secreción en tiempo real en el animal intacto, pero está limitado en su resolución y por los medios para manipular el tejido exocrino. La evaluación de la secreción mediante la recopilación de los fluidos del conducto pancreático se logró en ratas anestesiadas 11. Sin embargo, desde la canulación del conducto pancreático es extremadamente difícil, este método se utiliza raramente.
En comparación con estas configuraciones, el cultivo ex vivo de acinos pancreáticos es simple, rápida y permite medios accesibles para el seguimiento y la manipulación de las células, sin interferir con la organización del tejido intacto 4,5. Sin embargo, esta configuración tiene sus defectos. Pancreáticocélulas acinares son delicados en la naturaleza y muy sensible a las variaciones en las condiciones de cultivo. Dado que las células se cargan con enzimas proteolíticas, que son propensos a la lisis y muerte celular. Como consecuencia, esta cultura es de corta duración y por lo general no dura más de 20 horas.
Es siempre mejor es identificar y solucionar los problemas que puedan surgir. El paso metodológico fundamental es aislar acinos pancreáticos intacto sin signos significativos de daño celular y la mortalidad. Tales signos son evidentes, e incluyen restos celulares excesiva y acinos con ampollas basolateral o vacuolas intracelulares. En el ensayo de secreción de amilasa, daño celular dará lugar a una baja relación estimulado / no estimulado la secreción. Con el fin de evitar tales daños, se recomienda para manejar el tejido suavemente, añadir BSA y STI para el medio, y para enriquecer con oxígeno. Por ejemplo, sin oxigenación, secreción excesiva de células de máscaras de amilasa El efecto estimulador del secretagogo (Figura3C). Sin embargo, debido a la fragilidad del tejido exocrino, algunos daños en el tejido es casi inevitable - tales preparaciones deben ser desechados.
Para el ensayo de secreción de amilasa, el sobrenadante, que contiene la amilasa secretada pero está libre de células, puede mantenerse a 4 ° C durante 1 - 2 días. Este sobrenadante debe entonces ser ensayada por un kit comercial. Muchos kits disponibles se basan en una escisión de un sustrato artificial de la amilasa y la posterior liberación de un cromóforo. Así, las concentraciones más altas de amilasa conducen a un cambio más rápido en el color de la solución. Desde la amilasa secretada eventualmente liberar todo el cromóforo del sustrato, es esencial para seguir la reacción con el tiempo, y utilizar sólo los datos recogidos durante la fase lineal.
Imágenes en vivo de acinos pancreáticos puede ser una experiencia frustrante para el investigador. Algunas preparaciones de células, especialmente las de los acinos infectada, pueden no ser adecuados para vivirimágenes, debido a la morfología comprometida de los acinos o niveles insuficientes de los sensores fluorescentes. Incluso en los preparativos adecuados, puede tomar tiempo para localizar muestras apropiadas. Así formación de imágenes puede requerir un tiempo considerable. Lifeact-GFP, una sonda de actina F, es destacable 12. Esta herramienta nos permitió seguir la dinámica de F-actina durante la secreción pancreática de hasta 16 h después de la infección, a un nivel de resolución que no pudo ser alcanzado en muestras acinares fijos. Además, el uso de la sonda Lifeact seguimiento habilitado de eventos exocitosis individuales, como vesículas de zimógeno pancreático se someten a recubrimiento de actina poco antes de la exocitosis 3,13.
Colectivamente, cuando se domina, las técnicas descritas aquí ofrecen el investigador significa evaluar la secreción pancreática, y por arnés para identificar nuevos participantes en este proceso de múltiples pasos. Además, en vista de las similitudes estructurales y funcionales entre el páncreas y otros órganos exocrinas,estas técnicas se pueden aplicar a otros tejidos, así exocrinas 3.
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Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una beca de la BSF Estados Unidos e Israel a BS y EDSBS es un titular de la cátedra Hilda y Cecil Lewis en Genética Molecular.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | Harlan | Any strain will do | |
| HBSS | Sigma Aldrich | H8264 | Can substitude for KRB |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Fraction V |
| Trypsin inhibitor | Sigma Aldrich | T9003 | |
| Collagenase XI | Sigma Aldrich | C0130 | |
| Nylon mesh | BD Falcon | 352360 | 70-100µm |
| Amylase infinity reagent | Thermo | TR25421 | |
| CCK | Sigma Aldrich | C2175 | |
| FM4-64 | Lifetechnologies | F34653 | Diluted to 16µM |
| 20mL scintillation vial | Sigma Aldrich | Z190527 | |
| DeltaVision system | Applied Precision | Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus) | |
| Zeiss 510 or 710 confocal microscope | Zeiss | 60x/1.4 or 100x/1.4 objectives | |
| Ultra Microplate reader | BioTek | ELx808 |
References
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