Summary
Isolerade pankreas acini behåller sin in vivo morfologi och aktivitet och erbjuder kraftfulla sätt för att övervaka och manipulera utsöndring. Detta arbete visar hur acini kan isoleras från mus bukspottkörteln, och hur deras sekretoriska kapacitet kan bedömas.
Abstract
Bukspottkörtel acinarceller producerar och utsöndrar matsmältningsenzymer. Dessa celler är organiserade som ett kluster som bildar och delar en gemensam lumen. Detta arbete visar hur den sekretoriska kapaciteten av dessa celler kan bedömas genom odling av isolerade acini. Installationen är fördelaktigt eftersom isolerat acini, som behåller många egenskaper intakta exokrin pankreas kan manipuleras och övervakas lättare än i hela djuret. Korrekt isolering av pankreasacini är ett nyckelkrav, så att ex vivo kultur kommer att representera vilken typ av acini in vivo. Protokollet visar hur du isolera intakt acini från musen bukspottkörteln. Därefter två kompletterande metoder för att utvärdera pankreassekre presenteras. Den amylas sekre analysen fungerar som en global åtgärd, medan direkt avbildning av pankreassekre möjliggör karakterisering av sekre vid en sub-cellulär upplösning. Kollektivt ger de tekniker presented här möjliggör ett brett spektrum av experiment för att studera exokrin sekretion.
Introduction
Den exokrina bukspottkörteln utgör det mesta av massan av däggdjurs pankreas och är dedikerad till produktion och utsöndring av matsmältningsenzymer 1. Den funktionella enhet av exokrin pankreas, den acinus är ett kluster av epitelceller som bildar och delar en gemensam lumen. Vid hormonell eller neuronal stimulering är blåsor fyllda med enzymer transporteras till apikala cellytan, säkring med den och utvisa innehållet i lumen 1-3. De utsöndrade enzymer sedan rinna av en sammanslagnings uppsättning ledningar till tunntarmen, där de katalyserar nedbrytningen av maten till näringsämnen.
Denna video visar hur intakt acini isoleras från hela bukspottkörteln och hur deras sekretoriska kapacitet kan bedömas. Med hjälp av denna inställning är pankreassekre kvantifieras genom att mäta den relativa mängden av amylas som släpptes efter stimulering. Alternativt kan sekre avbildas levande med hjälp av olikasensorer och färgämnen.
Den ex vivo installationen av bukspottskörteln acini är fördelaktigt eftersom isolerat acini, som behåller många egenskaper intakta bukspottkörteln, kan manipuleras och övervakas lättare än i hela djuret 4-6. Denna inställning utvecklades ursprungligen i slutet av 1970-talet och var sedan förlängdes för att studera flera exokrina vävnader såsom spott och bröstkörtlar 3-7. Särskilt tillåter studiet av sekre med minimal störning av de komplexa cellulära organisationerna i dessa polariserade epitel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Rutiner som involverar djurförsök har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Weizmann Institute of Science.
1 Provberedning
- Isolering av pankreasacini
- Bered 300 ml färsk Krebs-Ringer bikarbonat HEPES (KRBH) medium innan du startar. Blanda 140 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,16 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 11 mM glukos, 10 mM HEPES. Lägg bovint serumalbumin (BSA) och 0,1 mg / ml sojaböntrypsininhibitor (STI) (resuspension medium). Förbered 5-10 ml resuspension medium kompletterat med kollagenas (~ 0,75 mg / ml) (uppslutning medium).
- Syresätta KRB medium för ~ 30 min. Lägg BSA efter syresättning för att förhindra bubblande. Bring resuspension och uppslutnings medier till 37 ° C. OBS: syresätta mediet minskar celldödlighet och förbättrar lyhördhet för antidiabetika. Effekten av syresättningen framgår åtminstone under 6 timmar.
OBS: För att undvika kontaminering, autoklavera dissektion verktyg och det vatten som används för KRBH medium innan användning. Filtrera KRBH medium genom ett 0,2 pm filter. Före excision av bukspottkörteln skölj dissektion verktyg med 70% etanol och utföra dissekering på en ren bänk. Utför virusinfektioner i en nivå 3 biosäkerhet skåp. Lägg antibiotika till O / N odlingsmediet (se avsnitt 4).
- Incision allmänt buken hud och subkutana vävnaden. Identifiera lever, mage, tarm, pankreas och mjälte (fig 1). OBS: I följande steg, hantera pankreasvävnad försiktigt och undvika att använda överdrivet mekanisk FORCe för att förhindra autodigerering av vävnad och celldöd.
- Genom att använda två trubbiga pincett, dra ut i tunntarmen. Start vid tunntarmen proximala änden, nära avfarten från magen. Separera bukspottkörteln från tarmen och behålla den inom kroppshålan. När når tjocktarmen, märker en rosa / vit bindväv. Blanda inte ihop det med bukspottkörteln.
- Rensa så mycket pankreatisk vävnad som möjligt utan att samla upp fett eller bindväv. Ta bukspottkörteln genom att ta loss den från mjälten och magsäcken och skära buken blodkärl under den (figur 1 A-C).
OBS: Eftersom avkastningen av pankreas acini från ett enda djur är hög, kan man avstå från att samla alla pankreasvävnaden för att förhindra att samla andra vävnader.
- Skölj bukspottkörteln några gånger i resuspension mediet värms till 37 ° C och avlägsna kvarvarande delar av icke-bukspottskörtelnvävnader. Doppa bukspottkörteln i ~ 5 ml förvärmd matsmältningen medium i en 20 ml scintillationsflaska. Finhacka bukspottkörteln att bitar av 1-3 mm. Lägg den i ett uppvärmt vattenbad (optimalt under omröring på ~ 100 rpm). För att påskynda matsmältningen, pipett rötas vävnaden upp och ner en gång varje par minuter.
OBSERVERA: Varaktigheten av kollagenasdigestion beror huvudsakligen på kollagenas koncentration och på mängden av mekanisk kraft som anbringas på vävnaden. Användning av 0,75 mg / ml kollagenas under ca 15 min och pipettering av vävnad med en 5 ml polystyren pipett med en 2 mm genomlopp varje 3-5 min, vilket resulterar i acini av 10-30 celler. Efter matsmältningen, verkar suspensionen grumligt innehåller synliga bitar av vävnad. Eftersom koUagenaser effektivitet varierar mellan olika handelstyper och mycket, bestämma tidpunkten för matsmältningen empiriskt. - Tvättning och filtrering
- Överför rötas vävnaden i ett 50 ml rör och avsluta grävaestion genom tillsats av 45 ml av återsuspension medium. Filtrera suspensionen genom en grov (~ 1 mm) metallnät i ett nytt rör. Centrifugera genomströmning vid 100 x g under 3 min.
- Kasta bort supernatanten och suspenderades de spjälkade bukspottkörteln i 50 ml resuspension medium. Filtrera suspensionen genom en 70 eller 100 | im nylonnät. Centrifug som tidigare.
- För att avlägsna flytande, skadad acini, kassera supernatanten och suspendera bukspottkörtelns vävnad i 3 - 5 ml resuspension medium. Applicera 1 ml portioner av den pankreatiska körtelgångar i 15 ml koniska rör fyllda med 7 ml resuspension medium. Låt acini nöja sig med 2 - 3 min. Samla acini som har bosatt sig på botten av röret med en 1 ml pipett och upprepa detta steg 2 - 3 gånger.
- Visa pankreasacini under ett ljus eller dissekera mikroskop för att testa deras tillstånd. I fig 2, observera renhet av isolering och skador åsamkades cellerna During isolering. Använd dessa acini omedelbart eller kultur för upp till 20 timmar.
2. Amylas Secretion Assay
OBS: amylas sekre analysen fungerar som ett globalt mått på den sekretoriska kapacitet pankreasacini. Detta uppnås genom att samla mediet i vilket den pankreasacini inkuberades, och bestämning av amylasaktivitet av mediet, vanligen genom användning av ett kommersiellt kit.
- Bestäm antalet experimentella förhållanden som skall undersökas (t.ex. icke-stimulerade vs stimuleras). Använd minst tre replikat för varje tillstånd. Dessutom lägger en uppsättning replikat för att bestämma den totala cellulära amylas innehåll ("total" prov) och en uppsättning för amylasaktiviteten av mediet ("noll" prov). Märk en platta med flera brunnar i vilka analysen ska utföras, och två uppsättningar av mikrorör för varje replikat som skall användas.
OBS: 12 eller 24-brunnars kan användas för att övervaka en och 0,5 ml acinära suspensioner, respektive. - Tvätta acini två gånger i 30 ml KRBH resuspension medium och inkubera dem i resuspension medium under 30 minuter vid 37 ° C. Till den platta med flera brunnar lägga till en 10 pl droppe av sekretagog att nå den lämpliga slutkoncentrationen.
- Pankreas acini svarar på en gradient av secretagogue i en bifasisk sätt. Halterna med optimala sekre värden är 50-100 pM av Cholecystokinin (CCK) och 1 ^ M i Karbakol (Figur 3A) 5.
- Tvätta och resuspendera acini i resuspension medium. Se till att acini fördelas homogent i fjädring och alikvoter lika mycket suspensionen i flera brunnar och in i "total' märkta mikrorör. Inkubera plattan i 30 minuter vid 37 ° C. (Företrädesvis i ett vattenbad under mild omrörning (~ 50 rpm)).
OBS: Det exakta antalet acini kan variera mellan experiments men bör vara lika i replikat inom varje experiment. Således är exakt alikvotering av acini fjädring avgörande för jämförelse mellan olika replikat och villkor. - Under inkubation, producerar den "totala" och "noll" prover. Centrifugera totala "mikrorör för några sekunder vid 5000 x g och ta bort 50 l från supernatanten i" zero' märkta mikrorör och placera dem vid 4 ° C. Lyse acini i de "totala" prover genom att tillsätta Triton X-100 till mikrorören att nå en slutlig koncentration av 1%. Vortexa mikrorören kraftigt.
OBS: Aliquote den "totala" replikerar liknar replikat av experimentet. Lysera acini, leder till frisättning av den totala amylas innehåll. Alternativt samla acini vid varje tillstånd och lyserar vid slutet av försöket, för att bestämma det cellulära innehållet i varje replikat. - Samla de flesta av acinar fjädring into den första uppsättningen av pre-märkta mikrorör. Centrifugera mikrorören i några sekunder vid 5000 x g. Överför supernatanten i den andra uppsättningen av pre-märkta mikrorör.
- Analysera supernatanten för amylas aktivitet med ett kommersiellt kit. Beräkna andelen amylas utsöndras.
OBS: Det är viktigt att läsa amylasaktiviteten vid sitt linjära område. Presentera andelen amylas utsöndrat som procent av amylas frigörs från initiala totala innehållet. Subtrahera bakgrunds amylas nivån mediet från varje tre exemplar och dela det med den på samma sätt normaliserade initiala totala innehållet.
3 Live avbildning av bukspottkörtelSekre
Sekretion från pankreas acini kan övervakas direkt av levande avbildning. Med hjälp av olika fluorescerande färger och sensorer, möjliggör Bildproduktion karakteriseringen av sekre vid en sub-cellulär upplösning.
- Förbered nyligen syresatt resuspension mediet som jagn steg 1,1 och föra den till 37 ° C. Ställ mikroskopet, och om de är utrustade med en temperaturregulator, justera den till 37 ° C.
- Tvätta acinarceller i 30 ml resuspension medium och placera dem i ett glas eller plast slide. Obs: Om lipofila färgämnen ska användas för att märka för plasmamembranet märkt med lipofila färgämnen, färga acini i högst 5 minuter för att förhindra att märkning av inre membran genom endocytos. Under hela arbetet, hantera acini försiktigt och undvika överdriven pipettering.
- Väl framme vid mikroskopet, är bild acini vars morfologi klart, och undvika avbildning av acini som visar basolaterala blebs eller intracellulära vakuoler. Lägg secretagogue droppvis eller genom att använda en perfusionskammare, antingen under eller omedelbart före initieringen av avbildning.
OBS: hög förstoring linser med höga numeriska öppningar (t.ex. × 63 / 1.4 eller × 100 / 1.4) rekommenderas att iaktta subcellulära strukturer.
4. O / N kultur pankreasacini (Alternate Cell Culture Technique)
OBSERVERA: O / N odling används ofta för Adeno-virusinfektion. Infektion genomföres vid 10 6 -10 7 pfu / ml för 9-16 h före undersökning.
- Kultur pankreasacini i upp till 20 timmar. Resuspenderade acini erhållna från en enda pankreas i 25 ml odlingsmedium (DMEM kompletterat med fetalt kalvserum (FCS) (5%), natrium-pyruvat (1%), antibiotika (1%), L-glutamin (0,5%), BSA (10 mg / ml) och STI (0,2 mg / ml), och uppdelat på fem 10cm plattor. infektera acini med virus i en nivå 3 biosäkerhet skåp.
- Inkuberades pankreasacini vid 37 ° C i en 5% CO2 fuktad luft. Låt acini att återhämta sig i syresatt resuspension medium för 30 min före senare undersökning 3,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bukspottkörtel acini som var isolerade korrekt visa ett stereotypt morfologi när den betraktas i genomlysning. Deras basolaterala domäner ska visas runt och saknar blebs. Den apikala domänen är omgiven av hundratals sekretoriska vesiklar och verkar mörkare i färgen (figur 2A, B). Kärnorna ligger basal till vesikulär området. Cell skräp och komponenter i bukspottskörteln duktal systemet och i det endokrina bukspottkörteln, som kan detekteras vid tidiga stadier av acini isolering (Figur 2C, D), bör finnas i den slutliga acinar fjädring (Figur 2A, B). Felaktig isolering kan leda till generering av basolaterala blebs och brott på celler som släpper ut sitt matsmältningsenzymer i mediet (Figur 2E, F).
Amylasfrisättning från pankreasacini visar en bifasisk kurva när plottas mot koncentrationen av antidiabetika (figur 3A). Wtan att stimulering omkring 5% av det ursprungliga innehållet frigörs under 30 min av inkubation. Efter stimulering, är detta antal höjs med upp till 5 gånger. Acini som odlades O / N, visa ett lägre förhållande mellan stimulerad vs basal amylasfrisättning jämfört med nyligen isolerade acini. Viktigt är odlade acini som infekterades med adeno virus uppvisar en hög basal amylas utsöndring och en sensibiliserad stimulerad sekretion (figur 3B, C). Det är därför viktigt att infektera kontroll acini med en liknande dos av kontroll-virus.
Live avbildning av acini bör medge tydlig identifiering av de basolaterala och apikala domäner acinarceller. Lipofila färgämnen kan bidra för att skilja mellan den smala apikala domänen och de laterala och basolaterala aspekter av cellerna (Figur 4). Under fysiologisk stimulering, är utsöndringen riktad enbart till den apikala ytan 1,9. Användning av F-aktin sond Lifeact-GFPmöjliggör levande visualisering av sekretoriska vesiklar, eftersom pankreas zymogen vesiklar genomgår aktin beläggning strax före exocytos (Figur 4).
Figur 1 Lokalisering av bukspottkörteln och närliggande organ. (AC) Bukspottkörteln och närliggande organ efter snitt i buken hud och subcutis (A), före och efter pankreas separation från angränsande organ, (B) och (C), respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 Isolering av pankreas acini. (A) och (B) Pancreatic acini isolerad riktigt visa ett stereotypt morfologi; deras basolaterala domäner visas runt och saknar blebs, medan deras apikala domän är omgivna av hundratals sekretoriska vesiklar och verkar mörkare i färgen (pil). (C) och (D) Cell skräp och komponenter s för pankreasgångsystemet kan upptäckas vid tidiga stadier av acini isolering (pilen pekar på en exokrin kanal). (E) och (F) Felaktig isolering leder till generering av basolaterala blebs (E, pilen), och brott på celler, som släpper ut sitt matsmältningsenzymer i mediet ( F, pil). Skalstrecken representerar 100 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3 Mätning av amylasfrisättning från isolerade acini. (A) amylasfrisättning från pankreasacini visar en bifasisk kurva när plottas mot koncentrationen av ett antidiabetikum. Acini var isolerad och lämnades att återhämta sig under 30 min före stimulering med de angivna koncentrationerna av Cholecystokinin (CCK). Resultaten representerar genomsnittet och sem tre oberoende försök. (B) acini som odlades O / N, visa ett lägre förhållande mellan stimulerad vs basal amylasfrisättning jämfört med nyligen isolerade acini. Odlade acini som var infekterade med Adeno virus visar en hög basal amylas sekretion och en sensibiliserad stimulerad sekretion. (C) Icke-syreodlingsbetingelser leda till överdriven discharge av amylas, som maskerar den stimulerande effekten av antidiabetikum.
Figur 4 Live avbildning av pankreassekretion. Live stimulerade acinarceller, uttrycker Lifeact-GFP (LA, grön, grå) och färgades med det lipofila färgämnet FM4-64 (röd). Användning av Lifeact sonden möjliggör live-visualisering av enstaka fusions händelser av aktin belagda vesiklar (pilar). Celler infekterades O / N med adenovirus-Lifeact-GFP (Ad-Lifeact-GFP), färgade och stimulerade kort med 100 pM CCK före inledandet av undersökningen. Skala stapel representerar 5 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Förutom den ex vivo kultur, alternativa uppställningar för studiet av exokrin sekretion inkluderar intravital mikroskopi och mätning av fluider från den pankreatiska gången. Intravital mikroskopi visade sig fungera väl i musen spottkörtlarna 10. Denna metod kan spela utsöndring i realtid i det intakta djuret, men är begränsad i dess upplösning och genom anordningen för att manipulera den exokrina vävnaden. Bedöma utsöndring genom att samla vätskor från bukspottkörtelgången uppnåddes i sövda råttor 11. Men eftersom kanylering av den pankreatiska gången är extremt svårt, denna metod används sällan.
Jämfört med dessa inställningar är ex vivo kultur av pankreas acini enkel, snabb och gör tillgängliga medel för att övervaka och manipulera cellerna, utan att störa organisation intakt vävnad 4,5. Ändå har den inställningen sina brister. Pankreasacinarceller är känslig till sin natur och mycket känslig för variationer i odlingsbetingelserna. Eftersom cellerna är laddade med proteolytiska enzymer, de är benägna att lys och celldöd. Som en följd härav är denna kultur kortlivad och vanligtvis varar inte över 20 tim.
Det är alltid bäst att identifiera och lösa problem när de uppstår. Nyckeln metodologiska steg är att isolera intakt pankreas acini utan tydliga tecken på cellskada och mortalitet. Sådana tecken är uppenbara, och innehålla alltför cellrester och acini med basolaterala blebs eller intracellulära vakuoler. I amylas sekre analysen kommer cellskador leder till en låg stimulerad / icke-stimulerad sekreförhållande. För att undvika sådana skador, rekommenderas att hantera vävnaden försiktigt, till BSA och STI till mediet, och att berika den med syre. Till exempel, utan syresättning, överdriven urladdning cell av amylas maskerar den stimulerande effekten av sekretagogen (figur3C). Men på grund av hur skör den exokrina vävnaden, är en del vävnadsskada nästan oundvikligt - sådana preparat skall kasseras.
För amylas sekre assay, supernatanten, som innehåller det utsöndrade amylas men är fri från celler, kan hållas vid 4 ° C under 1-2 dagar. Denna supernatant bör sedan analyseras genom ett kommersiellt kit. Många tillgängliga kit förlita sig på en klyvning av ett artificiellt amylas substratet och den efterföljande frisättningen av en kromofor. Således högre amylas koncentrationer leda till en snabbare förändring av lösningens färg. Eftersom det utsöndrade amylas småningom kommer att släppa alla kromoforen från underlaget, är det viktigt att följa reaktionen över tid, och endast använda de uppgifter som samlats under den linjära fasen.
Live avbildning av pankreas acini kan vara en frustrerande upplevelse för forskaren. Vissa cellpreparat, särskilt de av infekterade acini, kanske inte passar för levandeavbildning på grund av nedsatt morfologi acini eller på otillräckliga nivåer av de fluorescerande sensorer. Även i lämpliga preparat, kan det ta tid att hitta lämpliga prover. Avbildning kan alltså ta lång tid. Lifeact-GFP, en F-aktin sond, är anmärkningsvärt 12. Detta verktyg tillät oss att följa dynamiken i F-aktin under pankreassekre i upp till 16 timmar efter infektion, på en nivå av upplösning som inte kunde uppnås i fasta acinära prover. Dessutom användning av Lifeact sonden aktiverat spårning av enstaka exocytos händelser, som bukspottkörteln zymogen blåsor genomgår aktin beläggning strax före exocytos 3,13.
Kollektivt när behärskar, de tekniker som beskrivs här erbjuder forskaren innebär att utvärdera pankreassekretion och med sele att identifiera nya deltagare i denna process i flera steg. Dessutom med tanke på de strukturella och funktionella likheter mellan bukspottkörteln och andra exokrina organ,Dessa tekniker kan tillämpas på andra exokrina vävnader samt 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats genom ett bidrag från USA och Israel BSF till BS och EDSBS är ett kyrkoherde i Hilda och Cecil Lewis professur i molekylär genetik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ICR mice | Harlan | Any strain will do | |
| HBSS | Sigma Aldrich | H8264 | Can substitude for KRB |
| BSA | Sigma Aldrich | A7906 | Fraction V |
| Trypsin inhibitor | Sigma Aldrich | T9003 | |
| Collagenase XI | Sigma Aldrich | C0130 | |
| Nylon mesh | BD Falcon | 352360 | 70-100µm |
| Amylase infinity reagent | Thermo | TR25421 | |
| CCK | Sigma Aldrich | C2175 | |
| FM4-64 | Lifetechnologies | F34653 | Diluted to 16µM |
| 20mL scintillation vial | Sigma Aldrich | Z190527 | |
| DeltaVision system | Applied Precision | Consisting of an inverted microscope IX71 equipped with 60x/1.4 or 100x/1.3 objectives (Olympus) | |
| Zeiss 510 or 710 confocal microscope | Zeiss | 60x/1.4 or 100x/1.4 objectives | |
| Ultra Microplate reader | BioTek | ELx808 |
References
- Williams, J. A. Regulation of pancreatic acinar cell function. Current Opinion in Gastroenterology. 22, 498-504 (2006).
- Schnekenburger, J., et al. The role of kinesin, dynein and microtubules in pancreatic secretion. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 66, 2525-2537 (2009).
- Geron, E., Schejter, E. D., Shilo, B. Z. Directing exocrine secretory vesicles to the apical membrane by actin cables generated by the formin mDia1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 10652-10657 (2013).
- Amsterdam, A., Jamieson, J. D. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 69, 3028-3032 (1972).
- Williams, J. A., Korc, M., Dormer, R. L. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini. The American journal of physiology. 235, 517-524 (1978).
- Jerdeva, G. V., et al. Actin and non-muscle myosin II facilitate apical exocytosis of tear proteins in rabbit lacrimal acinar epithelial cells. Journal of Cell Science. 118, 4797-4812 (2005).
- Menozzi, D., Jensen, R. T., Gardner, J. D. Dispersed pancreatic acinar cells and pancreatic acini. Methods in Enzymology. , 192-271 (1990).
- Bi, Y., Williams, J. A. A role for Rho and Rac in secretagogue-induced amylase release by pancreatic acini. Am J Physiol Cell Physiol. 289, C22-C32 (2005).
- Palade, G.
- Masedunskas, A., et al. Role for the actomyosin complex in regulated exocytosis revealed by intravital microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 13552-13557 (2011).
- Petersen, H., Grossman, M. I. Pancreatic exocrine secretion in anesthetized and conscious rats. The American Journal of Physiology. 233, E530-E536 (1977).
- Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5, 605-607 (2008).
- Porat-Shliom, N., Milberg, O., Masedunskas, A., Weigert, R. Multiple roles for the actin cytoskeleton during regulated exocytosis. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 70, 2099-2121 (2013).
