Summary
Questo articolo descrive microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo come una tecnica di trasfezione per le cellule testicolari di topo per studiare processi unici di spermatogenesi. Il protocollo presentato prevede fasi di preparazione capillare di vetro, microiniezione attraverso il dotto efferente, e trasfezione mediante elettroporazione.
Abstract
Questo contributo video e articolo fornisce una descrizione completa di microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo. Questa particolare tecnica di trasfezione di cellule testicolari del mouse permette lo studio di processi unici in spermatogenesi.
Il seguente protocollo si concentra sulla trasfezione delle cellule testicolari del mouse con costrutti plasmidici. In particolare, abbiamo utilizzato il vettore giornalista pEGFP-C1, che esprime la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) e anche il vettore pDsRed2-N1 che esprimono la proteina fluorescente rossa (DsRed2). Entrambi i geni reporter codificati erano sotto il controllo del promotore del citomegalovirus umano immediato-precoce (CMV).
Per eseguire il trasferimento genico in testicoli di topo, i costrutti reporter di plasmide vengono iniettate in testicoli di topi viventi. A tal fine, il testicolo di un animale anestetizzato è esposto e il sito di microiniezione è preparato. Il nostro posto preferito diiniezione è il condotto efferente, con la rete testis in ultima analisi, collegato come via di trasporto anatomica degli spermatozoi tra il testicolo e dell'epididimo. In questo modo, il riempimento dei tubuli seminiferi dopo microiniezione è ottimamente gestito e controllato grazie all'utilizzo di soluzioni di DNA macchiati. Dopo aver osservato un ripieno sufficiente del testicolo dalla sua struttura tubulo colorata, l'organo è elettroporata. Questo consente il trasferimento della soluzione di DNA in cellule testicolari. Dopo 3 giorni di incubazione, il testicolo viene rimosso ed esaminato al microscopio per fluorescenza verde o rosso, illustrando il successo trasfezione.
Generalmente, questo protocollo può essere impiegato per la consegna DNA o RNA-costruisce in soggiorno topo testicolo per (sopra) esprimere o abbattere i geni, facilitando l'analisi della funzione genica in vivo. Inoltre, è adatto per studiare costrutti reporter o putativo regula geneElementi Tory. Così, i principali vantaggi della tecnica di elettroporazione sono prestazioni veloci in combinazione con il minimo sforzo, così come le attrezzature tecniche moderato e le competenze necessarie rispetto alle tecniche alternative.
Introduction
Spermatogenesi dei mammiferi è considerato un sofisticato processo di cellule staminali di auto-rinnovamento successivamente sottoposti a mitosi, meiosi e la differenziazione al fine di sviluppare in maturo spermatozoi aploidi. Questi cambiamenti morfologici sono orchestrati da diversi tipi di cellule e nonostante i profondi tentativi, è ancora impossibile imitare questi processi in coltura cellulare 1,2. Quindi, la ricerca sulla spermatogenesi fino ad ora si affida a organismi viventi come modelli in vivo. In generale, gli studi di funzione genica si basano generalmente su animali transgenici. Tuttavia, generare e sostenere questo tipo di modello animale è in termini di tempo, costi-intensive e molto elaborata. Questo è attribuito al processo di allevamento lungo necessario per generare e mantenere il transgene nel corso delle generazioni. Inoltre, la manipolazione genetica di tutto l'organismo dall'approccio transgenici o knockout è incline a causare alterazioni fisiologiche quando il targeting gEnes con funzioni essenziali in più regioni, ad esempio, al di fuori del testicolo o sistemica.
Inoltre, alcuni metodi di trasfezione transiente sono associati con alcuni svantaggi cruciali. Ad esempio, inconvenienti tipici di trasferimento genico virus-mediata sono la possibile provocazione di immunoreazioni e dei regolamenti di sicurezza supplementari, mentre lipofezione 3 e 4 microparticelle bombardamento potrebbe danneggiare il tessuto e sono limitate a una certa profondità cella di una sufficiente efficienza di trasfezione.
In contrasto, elettroporazione (EP) come un altro modo comune di trasfezione transiente, sembra costituire una tecnica promettente per consentire a trasfezione vivo e vivo analisi del gene coerente. In generale, EP viene indicato come un fenomeno dinamico che dipende dalla tensione transmembrana locale con pori di conseguenza mediate all'interno nanosecondi. Queste lacune possono essere mantenuti per i millisecondi, sufficienti to concedere l'accesso al DNA, RNA o piccole molecole 5. Quando la tensione applicata è troppo alta, il carattere di solito transitoria di EP è contrastata a causa della produzione di calore e di induzione di permeabilizzazione troppo globale con conseguente danno irreversibile della cellula 5.
Qui mostriamo che elettroporazione è un sistema trasfezione efficace ed economico che possa essere utilizzato per la trasformazione genetica testicolo per chiarire caratteristiche genetiche testicolari in vivo. Questo articolo affronta la preparazione plasmide, microiniezione attraverso il dotto efferente e la successiva elettroporazione del mouse del testicolo. Questa procedura può essere il mezzo di scelta per raggiungere velocemente, specifico ed efficiente trasfezione dei tubuli seminiferi del testicolo topo in vivo al fine di indagare i processi di spermatogenesi.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali effettuati sono stati approvati dal comitato etico locale (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, Mecklenburg-Vorpommern, Germania).
1 plasmidi Preparazione
- Per la preparazione plasmide, utilizzare i kit di purificazione del plasmide (vedi tabella materiali) o metodi simili con buffer di rimozione di endotossine in modo che le reazioni immunitarie dell'animale possono essere evitati. Seguire le istruzioni del manuale. Impiegare DDH 2 O per diluire la soluzione plasmide.
- Eliminare i detriti facendo girare la soluzione di DNA alla massima velocità (20.000 xg). Poi raccogliere il surnatante.
- Determinare la concentrazione plasmide con uno spettrofotometro (vedi materiali).
- Regolare la concentrazione plasmide con DDH 2 O a 1-3 mg (DNA) / ml. Nota: le concentrazioni più basse riducono l'efficienza di trasfezione, mentre concentrazioni più elevate possono provocare una soluzione iniettabile troppo viscoso. Inoltre, l'efficienza di trasfezione dipende dalle dimensioni del plasmide e deve essere testato singolarmente.
- Prima dell'iniezione preparare una miscela della soluzione con ad esempio 40 microlitri plasmide con 5 ml di PBS (10x) e 5 microlitri Verde veloce (0,5%). Veloce verde è necessaria per il monitoraggio del processo di iniezione. Preferibilmente, utilizzare parete PCR-tubi sottili o Parafilm. Nota: a seconda delle dimensioni del testicolo, sarà necessario un volume di 20-50 ml per ogni testicolo.
2 Preparazione di microiniezione pipetta
- Utilizzare capillari borosilicato (vedi tabella materiali) per la preparazione dei pipette microiniezione.
- Tirare capillari di vetro con un capillare estrattore verticale (vedi tabella Materials).
- Rompere la punta capillare con una pinza da dolcemente banding. La punta è di solito 50-80 micron di diametro e lunghezza di circa 1 cm. Cercate di evitare punte troppo lungo in quanto questi non sono sufficientemente rigido per penetrare il tessuto.
- Infine, shaRPEN la punta di un 30 ° a 45 ° utilizzando un beveler micropipetta (vedi tabella Materials).
- Caricare la pipetta microiniezione con il mix di soluzione iniettabile (vedere plasmidi Preparazione). Applicare la soluzione nel retro del capillare di vetro con una piccola siringa. Nota: Cercate di evitare bolle d'aria durante il caricamento, altrimenti questi saranno iniettati nei tubuli seminiferi con la soluzione di plasmide e quindi ridurre la conducibilità, nonché, eventualmente, causare danni ai tessuti.
3 Anestesia e Chirurgia
- Eseguire l'operazione in condizioni asettiche, utilizzando materiale sterile (ad esempio, siringa, ago, strumenti chirurgici, ecc). Ciò consentirà di ridurre le infezioni degli animali e garantire buoni tassi di sopravvivenza.
- Utilizzare topi maschi di elettroporazione ad un'età di 6-8 settimane.
- Per inizializzare il trattamento analgesico post-chirurgica, forniscono il mouse con analgesici aggiunto l'acqua potabile, il giorno prima dell'intervento. Questo culoUres una analgesia preventiva in caso di altamente probabile hypodipsia post-chirurgica (assunzione di acqua diminuita). A tal fine, esporre acqua potabile con ad esempio una sospensione ibuprofene pediatrico (20 mg / ml). L'acqua da bere medicata deve essere fornito anche il primo giorno e due di recupero in concentrazione identici. Ciò significa che una dose giornaliera di 7,5 mg / kg, valida per 5 ml / acqua potabile d e peso corporeo di 25 g per 8 settimane di età C57BL / 6J. Questo regime analgesico garantisce un sollievo dal dolore fondamentale e recupero accelerato con alto benessere 26.
- Per preparare l'anestesia soluzione sul giorno dell'intervento di lavoro, miscelare il 10% e il 2% Ketamin Xylazin in un rapporto 1: 1 (vedi tabella Materials).
- Per anestetizzare l'animale, diffusa 0,25 ml / 100 mg di peso corporeo di anestetico per via sottocutanea soluzione (Ketamin = 0,125 g / kg; Xylazin = 0,025 g / kg). Utilizzare un sito di iniezione tra bacino e degli arti, al fine di evitare danni d'organo e lesioni dei topi. Di solito, 10 min sono necessarifino a quando il mouse è profondamente anestetizzati.
- Coprire gli occhi del mouse con vet pomata per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Prova profonda arresto anestetico, che è evidente da una totale mancanza di risposta. A tal fine, basta pizzicare la punta dell'animale.
- Per avviare l'operazione, rimuovere i capelli addominale con un rasoio elettrico o simile e disinfettare la zona funzionamento con sterilium o simili.
- Fare una incisione ventrale direttamente sopra le ghiandole prepuziale nel centro della zona addominale. In quel luogo, prima tirare la pelle fuori e condurre un piccolo taglio trasversale cutanea di circa 8-14 mm. Quindi, proseguire lungo lo strato muscolare addominale.
Nota: La lesione deve essere il più piccolo possibile per ridurre i danni all'animale. - Sollevare i cuscinetti di grasso addominale con attenzione per esporre il testicolo collegato e posizionarlo su una precedente preparato impermeabile usa e getta di carta drappo proprio accanto al sito di incisione (Figura 2A).
- Utilizzare un binocolo per find il condotto efferente come destinazione di iniezione. Il dotto efferente è identificato come la multa di giunzione nave tra il testicolo e dell'epididimo. Si trova adiacente alla arteria testicolare prominente. Il dotto corre quasi con un angolo di 45 ° verso l'arteria e visibilmente entra nel epididymidis caput. Nota: A seconda dell'età del mouse, il dotto è di solito sepolto nel tessuto adiposo.
- Utilizzare una pinza sottile per cancellare il canale efferente di questo tessuto adiposo. Dopo di che, posizionare il dotto rilasciato su una striscia di carta sterile per garantire la chiara visibilità del condotto senza compromettere dintorni.
4. Microiniezione e applicazioni del DNA
- Collegare la pipetta microiniezione, che viene caricato con la soluzione plasmide all'unità micromanipolatore / iniettore.
- Inserire la microiniezione ago parallelo al condotto efferente con la punta verso rete testis (Figura 2B).
- Utilizzare pinzette sottili etogliere il condotto sopra la pipetta microiniezione. Assicurarsi che il capillare è mantenuta parallela al condotto mentre si tira su.
Nota: Questa procedura è più conveniente che penetra la nave spostando l'ago con il micromanipolatore. - Dirigere l'ago con attenzione verso il testicolo e fermarsi proprio come penetra la rete testis direttamente sotto la tunica albuginea (Figura 2C).
Nota: Nel caso che travalica la rete testis, la soluzione plasmide perderà nello spazio interstiziale. Questo generalmente porta al fallimento di transfezione tubuli seminiferi. - Per l'iniezione della soluzione plasmide utilizzare il microinjector con le seguenti impostazioni: pi: 100 hPa, ti: 0,2 sec, e pc: 0 hPa (Figura 2D).
- Monitorare l'intero processo di iniezione osservando testicolo stato di riempimento con l'aiuto del colore verde. Fare attenzione che il testicolo è riempito solo fino a 2/3 del suo volume con la plsoluzione asmid (Figura 2E).
Nota: Se il volume di iniezione viene superato, il tessuto testicolare potrebbe essere danneggiato.
5. Elettroporazione di Testicolo
- Per abilitare elettroporazione efficace, immergere gli elettrodi pinzetta in PBS (1x). Questo assicura un adeguato conduttanza.
- Uniformemente spremere il testicolo tra gli elettrodi bagnati (Figura 2F). Misurare la resistenza elettrica con il elettroporatore.
- Applicare corrente al testicolo. Eseguire otto impulsi quadrati di 40 V a 4 diversi siti testicolo con una durata costante di tempo di impulso 50 msec e 950 msec intervallo di tempo.
6. ferita chiusura e post-operatorio
- Quando elettroporazione è finito, posizionare il testicolo torna nella posizione originale.
- Cucire lo strato muscolare interno con sutura chirurgica (vedi materiali).
- Chiudere la pelle utilizzando spezzoni di sutura (vedi tabella materiali). Tirare la pelle fino with pinzette. Assicurati di escludere lo strato muscolare. Posizionare le clips, ciascuno ad una distanza di non più di 5 mm.
Nota: Poiché sutura chirurgica può essere inghiottito dal mouse, clip di sutura sono favoriti per la chiusura della lesione cutanea. - Lasciare il mouse per recuperare da anestesia su carta assorbente sterili collocati in una gabbia sterile topo vuoto, che è temperato su un 37 ° C pad caldo. Il tampone dovrebbe garantire il riscaldamento di una metà della gabbia creando un gradiente termico. Per l'animale questo rende possibile effettuare la ricerca per la singola area, più comodo per la varietà temperatura nella gabbia. Inoltre, coprire il mouse con un foglio di carta assorbente sterile in modo che lo stress può essere ulteriormente ridotto. Nota: Dal momento che la superficie del corpo del mouse è insolitamente alta in relazione alla massa corporea, se confrontato con gli animali più grandi, il supporto termico è di particolare importanza per il successo il recupero dei roditori.
- Quando l'animale operato si è completamente risvegliato, trasferire it per un ulteriore recupero di una nuova gabbia del mouse completamente attrezzata. Non mettere l'animale torna alla sua vecchia gabbia o ad un gruppo di topi. Assicurarsi che la gabbia è pulita e sterile possibile per prevenire l'infezione della ferita. Monitorare l'intero processo di recupero. Per trasferire il mouse torna alla struttura di cura degli animali, attendere fino a che non ha pienamente recuperato e sembra comportarsi normalmente.
Nota: persona aggiuntiva e strategie post-chirurgici sono discusse da Pritchett-Corning KR et al 6.
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Representative Results
L'impostazione sperimentale per l'esecuzione di microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo in quanto è utilizzato in base al protocollo è illustrato in Figura 1. Anche se è possibile acquisire micropipette industrialmente, abbiamo preferito di generare le nostre pipette tirando (Figura 1A ) e smussatura (Figura 1B) capillari di vetro in modo che essi montati nostre esigenze. L'attrezzatura per microiniezione ed elettroporazione è illustrato nella Figura 1C. Per ragioni di efficienza di trasfezione, è di importanza di utilizzare un elettroporatore un'onda quadra.
La Figura 2 mostra i passaggi chiave della chirurgia mouse con particolare attenzione alla preparazione del condotto efferente. In questo contesto il testicolo è esposto (Figura 2A) e il condotto efferente è identificato con l'osservazione binoculare e rilasciato dal tessuto adiposo (Figure 2B). Successivamente, il dotto efferente è perforato con una pipetta microiniezione e la soluzione plasmide è somministrato (Figure 2C-E). Infine, il testicolo caricata viene schiacciato tra due elettrodi e trasfettate da impulsi ad onda quadra applicata (Figura 2F).
Questo approccio trasfezione in vivo permette l'utilizzo di diversi plasmidi codificanti vari geni reporter. Qui abbiamo usato il vettore giornalista pEGFP-C1 (figura 3A), che esprime la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) e anche il pDsRed2-N1 (Figura 3C) vettore che consente transattivazione di proteina fluorescente rossa (DsRed2). Nel nostro caso, entrambi i geni reporter sono sotto il controllo del promotore del citomegalovirus umano immediato-precoce (CMV).
Al fine di valutare il successo trasfezione, i testicoli microiniettati e elettroporate sono state raccolte 3 giorni dopo l'intera procedura e osservati sotto fluoresmicroscopia scenza (Figura 3). Per un'indagine approfondita, testicoli erano formaldeide-fisso, inclusi in paraffina, affettato (5 micron) e contrastate con A-Pro-3, con conseguente nuclei di colore blu. Infine, le sezioni sono state esaminate al microscopio a fluorescenza. Due esempi di possibili risultati trasfezione può essere visto in Figura 4. L'espressione del gene reporter EGFP è indicato da fluorescenza verde, la transattivazione di DsRed2 è indicato con emissione rossa.
Figura 1 Apparecchiatura per microiniezione ed elettroporazione di topo testicolo in vivo. Capillari di vetro sono formati utilizzando micropipetta estrattore (A), mentre le punte vengono affilati utilizzando la micropipetta beveler (
Figura 2 Illustrazione del testicolo in vivo microiniezione ed elettroporazione procedere nel topo tra cui l'intervento chirurgico prima. L'accesso al testicolo è concesso mediante apertura dell'addome del topo che è stato anestetizzato prima. Il taglio è fatto appena sopra le ghiandole prepuziale. Dopo aver rivelato il testicolo, che viene rilasciato dal grasso addominale pa ds (A). Sotto osservazione binoculare, il condotto efferente viene identificato e liberato grasso. La pipetta microiniezione è posizionato accanto al ductus, mentre la punta dell'ago sia rivolta verso il condotto efferente (B). Il capillare di vetro viene inserito nel dotto e si sposta verso il testicolo a trovarsi direttamente all'interno della rete testis (C). La procedura di applicazione DNA e riempimento dei tubuli seminiferi è monitorato con l'aiuto di Green veloce (D). Solo due terzi del testicolo si riempie per prevenire danni del tessuto (E). Per la fase di elettroporazione finale, il testicolo viene schiacciato tra gli elettrodi pinzetta tipo per applicare impulsi quadri elettrici (F). Cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: tutto il monte testicolo 3 giorni dopo l'elettroporazione in vivo al microscopio a fluorescenza, testicolo trasfettate di C57BL / 6 del mouse mostra espressione della proteina fluorescente verde -. EGFP (A) e proteina fluorescente rossa - DsRed2 (C) sia codificato in pEGFP- C1 e pDsRed2-N1 plasmide, rispettivamente. L'espressione di entrambi i geni reporter era sotto il controllo del promotore CMV elemento ubiquitariamente attiva. La trasfezione efficace dei tubuli seminiferi mirati è dimostrato da intensità di fluorescenza. Pannelli (B) e (D) illustrano auto-fluorescenza di untransfected testicolo controllo. Barra di scala = 1 mm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Sezioni di topo testicolo 3 giorni dopo l'elettroporazione in vivo unilaterale con pEGFP-C1 plasmide. Esito trasfezione di sezioni di testicolo di topo fisso (5 micron) sono mostrati i 3 giorni dopo l'elettroporazione unilaterale con pEGFP-C1 plasmide. Transfettate con successo testicolare cellsare tubolare indicato dalla fluorescenza verde. TO-PRO-3 nuclei controcolorate sono rilevabili mediante emissione blu (A e B). Le strutture circolari sono tipici per l'organizzazione delle cellule nei tubuli seminiferi. Barra della scala = 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La ricerca nel campo della biologia riproduttiva, in particolare nel settore della fertilità maschile e la spermatogenesi inevitabilmente si basa su organismi viventi. Al fine di esaminare la funzione testicolare, no / sistema di coltura cellulare adeguata in vitro è stata stabilita in grado di riflettere tutti i cambiamenti morfologici cruciali da un spermatogonio diploide ad aploide un maturo 1,2 spermatozoo. Così, la generazione di animali geneticamente modificati è spesso necessario e come uno strumento prezioso nella biologia riproduttiva maschile. A tal fine, un numero considerevole di transgenici, knock-out e knock-in topi sono stati creati che hanno espresso intuizioni fertilità maschile. Tuttavia, la generazione di topi transgenici di solito è fatto iniettando costrutti genici nel pronucleo di uova fecondate. Tuttavia, questa tecnica è in termini di tempo e dovrebbe essere fatto da laboratori specializzati. La procedura per generare knock-out o knock-in animaliè ancora più sofisticato.
Un altro modo di studiare la funzione dei geni di organismi viventi modello è di trasfezione transiente. Tuttavia, la trasduzione comune con vettori virali possono causare reazioni aspecifiche immunogenicità o altri e richiede norme speciali di sicurezza. Lipofezione 3 e microparticelle bombardamento 4 approcci sono, purtroppo, trattenuti per una profondità cella specifica e anche potrebbe innescare effetti negativi sul tessuto.
Tuttavia, per mezzo di impulsi applicati direttamente quadrati elettrica sul tessuto bersaglio, così chiamato elettroporazione, in realtà è possibile transfettare tessuti viventi, ad esempio, qui il mouse testicolo. Inoltre, questo metodo richiede solo bassi costi, bassi attrezzature e adeguatamente qualificato personale di laboratorio.
Un ulteriore vantaggio degno di nota associata a metodi di trasfezione in vivo rispetto alla persistente modalità di animale gene alteratols è la possibilità di co-trasfezione. Mentre transgenici o knock-topi di solito portano solo un costrutto genico, in vivo trasfezione consente completi, analisi simultanee di diversi costrutti genici all'interno della stessa cella. Questo può essere fatto con l'uso di vari geni reporter, per esempio, contro GFP o YFP Gaussia- contro Renilla-luciferasi, in modo che una indagine comparativa di tipo selvatico e gli effetti del gene mutante è possibile.
Inoltre, mediante l'applicazione di promotori specifici di tipo cellulare, l'espressione di costrutti genici può essere squisitamente convogliata sulla cellule specifiche all'interno del testicolo. Ad esempio, questo potrebbe consentire una espressione genica testicolare solo in cellule di Sertoli o spermatociti.
Il protocollo presentato in questo articolo riguarda due metodi importanti nel campo della biologia riproduttiva maschile. Il primo è la microiniezione in tubuli seminiferi con la preparazione del capillare di iniezione. Questa tecnologianique è stato comunemente implicato in germe / trapianto di cellule staminali da animali transgenici al destinatario 7 o nel contesto di xenotrapianto 8. Il secondo metodo è la transfezione elettroporazione in grado di indurre transitori pori nella membrana plasmatica, nonché un flusso di massa diretta di molecole cariche come plasmidi, assicurando ingresso in determinate cellule o tessuti piuttosto. Questa specifica direzione di macromolecole di elettroporazione è spesso apprezzato in trasfezione delle cellule neurali unilateralmente spesso fatto in utero 9,10 o nello sviluppo di retina 11.
Il protocollo dettagliato metodo precedente contiene i primi passi cruciali anestesia di topi maschi, l'esposizione del testicolo con lesione addominale, la preparazione del dotto efferente, nonche la microiniezione nel dotto. Poiché queste azioni sono molto esigenti, è fortemente consigliato di prima pratica su animali morti prima di eseguire oda operazioni sui topi viventi. Inoltre, vengono fornite istruzioni su come iniettare e riempire i tubuli seminiferi con plasmide-DNA e come condurre l'elettroporazione del testicolo in modo appropriato.
A causa della domanda di energia elettrica durante EP, produzione di calore potrebbe provocare danni tissutali soprattutto ad alta tensione. Questo aumento di efficienza di trasfezione 12, 13, 15, da elevata tensione si accompagna l'effetto negativo della contrazione testicolare 12-14. Il range di tensione più favorevole sembra essere tra 30-50 V, garantendo piccoli effetti su integrità testicolare, una normale qualità dello sperma 16, un normale comportamento di accoppiamento 17, il mantenimento della prole capacità di produzione 16-20, nonché una efficacia di trasfezione sufficiente.
Per quanto riguarda l'intensità di espressione genica dei costrutti genici trasferiti, Yomogida et al. 21 hanno inoltre rivelato una expr marcatamente ridottaESSIONE di vettori linearizzate 3 giorni dopo l'attuazione EP considerando circolare plasmide-DNA, ovviamente, sostiene ancora l'espressione dopo 35 giorni con la più alta in cellule di Sertoli. Questo suggerisce che i migliori risultati si ottengono quando si utilizza costrutti plasmidici per elettroporazione come fatto qui. Nel nostro approccio, abbiamo studiato l'efficienza di trasfezione 3 giorni dopo l'elettroporazione dovuto alla constatazione che questo periodo di tempo è sufficiente per una adeguata cicatrizzazione, riparazione di integrità delle cellule così come la corretta espressione desiderata delle proteine reporter eGFP e DsRed2. Così, un tempo di incubazione di 3 giorni dopo l'intervento chirurgico e l'intera procedura di trasfezione sembra essere necessaria per garantire funzioni cellulari opportunamente restaurati tra cui espressione genica in modo che un segnale di fluorescenza intensiva come possibile può essere rilevato garantendo un risultato trasfezione affidabile. Per quanto riguarda l'efficienza di trasfezione, Yomogida et al. Ha rivelato che il 21 °E cellule di Sertoli somatiche sono apparentemente più sensibili alle EP-trasfezione di cellule germinali. Si consiglia di co-trasfezione di testicolo con bersaglio e di controllo plasmidi, ogni codifica per un diverso gene reporter.
L'approccio elettroporazione presentato è applicabile ad un ampio spettro di possibili problemi relativi ai processi delle cellule germinali e fertilità maschile. Ad esempio, può essere utilizzato per analizzare elementi regolatori di geni specifici spermatogenesi 17,22. Il metodo è adatto anche per la perdita di funzione studi con piccolo RNA interferente 23 e guadagnare di funzione studi 24. Inoltre, ci sono possibilità promettenti per realizzare anche EP per il trattamento terapeutico e la generazione della prole transgenica come gruppi di ricerca hanno già dimostrato 18,20,25.
Quindi, l'approccio metodologico romanzo di topo testicolo elettroporazione in vivo illustrato in collaborazione con canale efferente microinjection di costrutti plasmidici, si spera, salirà a una tecnica preziosa per svelare con successo la natura della spermatogenesi.
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Disclosures
Marten Michaelis, Alexander Sobczak, e Joachim M. Weitzel impiegati presso l'Istituto di Biologia della Riproduzione, Leibniz Institute for Biologia Animal Farm (FBN), Dummerstorf, Germania, dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Birgit Westernstroeer del Centro di Medicina della Riproduzione e Andrologia presso l'Università di Muenster per l'insegnamento della microiniezione testicolare. Inoltre, siamo grati a Ursula Antkewitz e Petra Reckling per l'assistenza tecnica. Ringraziamo la Fondazione tedesca per la ricerca (DFG) per sostenere questo lavoro (WE2458 / 10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| Microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| Micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| Tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| Surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder | |
| Fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| Surgical suture | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| Syringe with 30 G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| Plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Urotamin | mix in a rate 1:1 with xylazine |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Xylazin | mix in a rate 1:1 with ketamine |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
References
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R.
- Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
- Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
- Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
- Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
- Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
- Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
- Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
- Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
- Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
- Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
- Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
- Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
- Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
- Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
- Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
- Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).
