Summary
توضح هذه المقالة حقن مكروي و electroporation الماوس الخصية في الجسم الحي كأسلوب ترنسفكأيشن لخلايا الخصية الماوس لدراسة عمليات فريدة من الحيوانات المنوية. يتضمن بروتوكول المعروضة خطوات إعداد الزجاج الشعرية، حقن مكروي عبر القناة ناقل، وترنسفكأيشن بواسطة Electroporation لل.
Abstract
هذه المساهمة الفيديو والمادة تعطي وصفا شاملا لحقن مكروي و electroporation من الخصية الماوس في الجسم الحي. هذه التقنية ترنسفكأيشن معينة للخلايا الخصية الماوس تسمح دراسة العمليات الفريدة في تكوين الحيوانات المنوية.
يركز البروتوكول التالية على ترنسفكأيشن من خلايا فأر الخصية مع بنيات بلازميد. على وجه التحديد، استخدمنا مراسل ناقلات pEGFP-C1، الذي يعبر تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) وكذلك ناقلات pDsRed2-N1 التعبير عن بروتين فلوري الأحمر (DsRed2). وكان كل من الجينات مراسل المشفرة تحت سيطرة المروج المضخم للخلايا البشرية فوري المبكر (CMV).
لأداء نقل الجينات إلى الخصيتين الماوس، يتم حقن يبني مراسل البلازميد في الخصيتين من الفئران الحية. لهذا الغرض، يتعرض الخصية حيوان مخدرة وأعدت موقع حقن مكروي. مكاننا المفضل للالحقن القناة ناقل، مع الشبكه الخصويه يرتبط في النهاية كطريق النقل التشريحية للحيوانات المنوية بين الخصية والبربخ. في هذه الطريقة، وملء الأنابيب المنوية بعد حقن مكروي يدار بشكل ممتاز والتحكم بسبب استخدام الحلول DNA الملون. بعد مراقبة ملء كاف من الخصية بواسطة أنبوب صغير بلون هيكلها، وelectroporated الجهاز. وهذا يتيح نقل الحل DNA في خلايا الخصية. بعد 3 أيام من الحضانة، يتم إزالة الخصية والتحقيق تحت المجهر لمضان أخضر أو أحمر، توضح نجاح ترنسفكأيشن.
بشكل عام، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقديم DNA- أو RNA المرتبط يبني في المعيشة الماوس الخصية من أجل (أكثر) صريحة أو هدم الجينات، وتسهيل تحليل الجسم الحي في وظيفة الجين. وعلاوة على ذلك، وهي مناسبة لدراسة البنى مراسل أو المفترضة العاديه الجينعناصر االختبارات. وهكذا، فإن المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي Electroporation للأداء سريع في تركيبة مع جهد منخفض وكذلك المعدات التقنية المعتدلة والمهارات المطلوبة مقارنة مع تقنيات بديلة.
Introduction
تعتبر الثدييات الحيوانات المنوية أن يكون عملية معقدة من الخلايا الجذعية تجديد الذات تمر تباعا الانقسام، الانقسام المنصف والتمايز من أجل تتطور إلى فرداني الحيوانات المنوية الناضجة. ودبرت هذه التغيرات المورفولوجية من أنواع مختلفة من الخلايا وعلى الرغم من المحاولات عميقة، فإنه لا يزال من المستحيل لمحاكاة هذه العمليات في زراعة الخلايا 1،2. وبالتالي، والبحث عن الحيوانات المنوية حتى الآن يعتمد على الكائنات الحية كنماذج في الجسم الحي. بشكل عام، يتم عادة على أساس دراسات وظائف الجينات في الحيوانات المعدلة وراثيا. ومع ذلك، وتوليد وإدامة هذا النوع من نموذج حيواني تستغرق وقتا طويلا، كثيفة التكاليف، ومعقد جدا. ويعزى ذلك إلى عملية تربية الطويلة اللازمة لتوليد والحفاظ على التحوير على مدى أجيال. بالإضافة إلى ذلك، التلاعب الجيني للكائن الحي بأكمله من قبل النهج المعدلة وراثيا أو خروج المغلوب هو عرضة للتسبب العاهات الفسيولوجية عندما تستهدف زأنيس مع الوظائف الأساسية في مناطق متعددة، على سبيل المثال، خارج الخصية أو جهازيا.
وعلاوة على ذلك، ترتبط بعض الأساليب ترنسفكأيشن عابرة مع بعض العيوب حاسمة. على سبيل المثال، عيوب نموذجية من الفيروس بوساطة نقل الجينات هي استفزاز محتمل من immunoreactions وأنظمة سلامة إضافية، في حين lipofection 3 و 4 microparticle القصف قد تلف الأنسجة وتقتصر على عمق خلية معينة لكفاءة ترنسفكأيشن كافية.
في المقابل، Electroporation لل(EP) كوسيلة أخرى شائعة من ترنسفكأيشن عابرة، ويبدو أن تشكل تقنية واعدة لتمكين ترنسفكأيشن في الجسم الحي وثابت في الجسم الحي التحليل الجيني. بشكل عام، ويشار إلى EP كظاهرة الديناميكية التي تعتمد على الجهد عبر الغشاء المحلي مع المسام بالتالي بوساطة ضمن نانو ثانية. يمكن الحفاظ على هذه الثغرات لميلي ثانية، ر كافيةس منح حق الوصول إلى DNA، RNA أو جزيئات صغيرة 5. عندما الجهد تطبيقها مرتفع جدا، وتصدى الطابع عادة عابر EP بسبب إنتاج الحرارة وتحريض permeabilization شامل جدا مع ضرر لا رجعة فيه يترتب على ذلك من الخلية 5.
هنا، وتبين لنا أن Electroporation للهو نظام فعال واقتصادي ترنسفكأيشن التي هي قادرة على يجري استخدامها للتحول الوراثي الخصية من أجل توضيح خصائص الجينات الخصية في الجسم الحي. تتناول هذه المقالة إعداد البلازميد، حقن مكروي عبر القناة ناقل وElectroporation لللاحق من الماوس الخصية. يمكن أن يكون هذا الإجراء الوسيلة المختارة لتحقيق ترنسفكأيشن سريعة ومحددة وفعالة من الأنابيب المنوية من الخصية الماوس في الجسم الحي من أجل التحقيق في عمليات تكوين الحيوانات المنوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات التي تقوم بها لجنة الأخلاق المحلية (Landesamt FÜR Landwirtschaft، Lebensmittelsicherheit اوند Fischerei، مكلنبورغ فوربومرن، ألمانيا).
1. البلازميد التحضير
- لإعداد البلازميد، واستخدام مجموعات تنقية البلازميد (انظر الجدول المواد) أو أساليب مماثلة مع إزالة الذيفان الداخلي عازلة بحيث التفاعلات المناعية للحيوان يمكن تجنبها. اتبع الإرشادات من الدليل. توظيف DDH 2 O لتمييع الحل البلازميد.
- إزالة الحطام من خلال الدوران الحل DNA في أقصى سرعة (20،000 x ج). ثم جمع طاف.
- تحديد تركيز البلازميد مع طيفي (انظر المواد).
- ضبط تركيز البلازميد مع DDH 2 O إلى 1-3 ميكروغرام (DNA) / ميكرولتر. ملاحظة: سوف تقلل من تركيزات أقل كفاءة ترنسفكأيشن، في حين أن تركيزات أعلى قد يسبب حقن محلول لزج جدا. الى جانب ذلك،كفاءة ترنسفكأيشن تعتمد على حجم البلازميد والتي سيتم اختبارها بشكل فردي.
- قبل الحقن، وإعداد مزيج حل مع على سبيل المثال 40 ميكرولتر بلازميد مع 5 ميكرولتر PBS (10X) و 5 الأخضر سريع ميكرولتر (0.5٪). وهناك حاجة سريع الأخضر لتتبع عملية الحقن. يفضل استخدام PCR رقيقة الجدار أنابيب أو Parafilm. ملاحظة: اعتمادا على حجم الخصية، سوف تكون هناك حاجة إلى حجم 20-50 ميكرولتر لكل الخصية.
2. إعداد ماصة حقن مكروي
- استخدام البورسليكات الشعيرات الدموية (انظر الجدول المواد) لإعداد ماصات حقن مكروي.
- سحب الزجاج الشعيرات الدموية الشعرية مع مجتذب العمودي (انظر الجدول المواد).
- كسر غيض شعري بالملقط من النطاقات بهدوء. غيض هو عادة 50-80 ميكرومتر في القطر وحوالي 1 سم طويلة. في محاولة لتجنب النصائح التي هي فترة طويلة جدا وهذه ليست قاسية بما فيه الكفاية لاختراق الأنسجة.
- في الماضي، شاءrpen طرف في 30 ° إلى 45 ° زاوية باستخدام beveler micropipette (انظر الجدول المواد).
- تحميل ماصة حقن مكروي مع مزيج حل حقن (انظر إعداد البلازميد). تطبيق الحل في الجزء الخلفي من الزجاج الشعرية مع حقنة صغيرة. ملاحظة: في محاولة لتجنب فقاعات الهواء أثناء التحميل، وإلا سوف يتم حقنه في هذه الأنابيب المنوية مع الحل البلازميد وبالتالي سيقلل الموصلية وكذلك ربما تسبب تلف الأنسجة.
3. التخدير وجراحة
- تنفيذ العملية تحت ظروف معقمة باستخدام مواد معقمة (أي الحقنة، الإبرة، الأدوات الجراحية، الخ). وهذا سوف يقلل من العدوى الحيوان وضمان بقاء معدلات جيدة.
- استخدام الفئران الذكور ل electroporation في سن 6-8 أسابيع.
- تهيئة مسكن العلاج بعد الجراحة، وتوفير أضاف الفأر مع المسكنات مياه الشرب في اليوم قبل الجراحة. هذا الحمارتدابري لتسكين وقائية في حالة نقص العطش بعد الجراحة المحتمل جدا (كمية المياه تقلصت). لهذه الغاية، مع فضح مياه الشرب على سبيل المثال تعليق ايبوبروفين للأطفال (20 ملغ / مل). وينبغي أيضا أن يتم توفير مياه الشرب العلاج في يوم واحد واثنين من الانتعاش في تركيز متطابقة. هذا يعني جرعة يومية من 7.5 ملغ / كغ، صالحة لمدة 5 مل / د مياه الشرب والجسم وزن 25G لمدة 8 أسابيع في سن C57BL / 6J. هذا النظام مسكن يضمن تخفيف الألم الأساسية والانتعاش المتسارع جنبا إلى جنب مع الرعاية العالية 26.
- لإعداد التخدير حل في يوم الجراحة العمل، وخلط 10٪ و 2٪ Ketamin Xylazin في نسبة 1: 1 (انظر الجدول المواد).
- لتخدير الحيوانات، وتطبيق 0.25 مل / 100 ملغ من وزن الجسم تحت الجلد الحل مخدر (Ketamin = 0.125 غرام / كيلوغرام؛ Xylazin = 0.025 جم / كجم). استخدام الحقن بين الحوض والأطراف من أجل منع تلف الجهاز وإصابة الفئران. عادة، هناك حاجة إلى 10 دقيقةحتى يتم تخدير عميق الماوس.
- تغطية عيون الماوس مع الطبيب البيطري مرهم لمنع جفاف أثناء التخدير.
- اختبار اعتقال مخدر العميق، وهو ملاحظته من انعدام تام للاستجابة. لهذه الغاية، فقط قرصة اصبع القدم من الحيوان.
- لبدء الجراحة، إزالة الشعر في البطن مع ماكينة حلاقة كهربائية أو ما شابه وتطهير المنطقة بالتعاون مع sterilium أو ما شابه ذلك.
- وجعل شق بطني مباشرة فوق الغدد القلفة في وسط منطقة البطن. في ذلك المكان، وسحب أول الجلد بعيدا وإجراء خفض الجلدي مستعرضة صغيرة من حوالي 8-14 ملم. ثم، مواصلة السير في طبقة العضلات البطنية.
ملاحظة: يجب أن تكون الآفة صغيرة قدر الإمكان للحد من الضرر للحيوان. - سحب ما يصل منصات الدهون في البطن بعناية لفضح الخصية المرفقة وضعه على استعداد للماء المتاح ثنى الورقة السابقة فقط بجانب موقع شق (الشكل 2A).
- استخدام مناظير لودائرة الهجرة والجنسية القناة ناقل كهدف الحقن. يتم التعرف على ناقل القناة كما تقاطع سفينة رفيع بين الخصية والبربخ. وهي تقع متاخمة لشريان الخصية البارزين. وتدير القناة تقريبا في زاوية من 45 درجة الى الشريان وتدخل البربخ الفرد واضح. ملاحظة: اعتمادا على عمر الفأر، وعادة ما يتم دفن القناة في الأنسجة الدهنية.
- استخدام ملقط غرامة لمسح القناة ناقل من هذه الأنسجة الدهنية. بعد ذلك، ضع صدر القناة على شريط ورق معقم لضمان رؤية واضحة للقناة دون المساس المناطق المحيطة بها.
4. حقن مكروي وتطبيق DNA
- ربط ماصة حقن مكروي، والتي يتم تحميلها مع الحل البلازميد إلى وحدة مياداة مجهرية / حاقن.
- وضع إبرة لحقن مكروي بموازاة القناة ناقل مع طرف تشير نحو الخصية الشبكة (الشكل 2B).
- استخدام ملاقط غرامة وتجريد القناة خلال ماصة حقن مكروي. تأكد من أن يتم الاحتفاظ الشعرية موازية للقناة في حين سحب أكثر من ذلك.
ملاحظة: هذا الإجراء هو أكثر ملاءمة من اختراق السفينة عن طريق تحريك الإبرة مع مياداة مجهرية. - توجيه الإبرة بعناية نحو الخصية ووقف تماما كما يخترق الشبكه الخصويه مباشرة تحت الغلالة البيضاء الغلالة (الشكل 2C).
ملاحظة: في حالة بتجاوز الخصية RETE، فإن الحل البلازميد تسرب في الفضاء الخلالي. وهذا يؤدي عادة إلى فشل transfecting في الأنابيب المنوية. - للحقن من الحل البلازميد الاستفادة من microinjector مع الإعدادات التالية: PI: 100 HPA، منظمة الشفافية الدولية: 0.2 ثانية، وجهاز كمبيوتر: 0 HPA (الشكل 2D).
- مراقبة عملية الحقن برمتها من خلال مراقبة الخصية وضع ملء مع مساعدة من اللون الأخضر. الحرص على أن الخصية يتم تعبئة فقط ما يصل الى 2/3 من حجمه مع ررحل asmid (الشكل 2E).
ملاحظة: إذا تم تجاوز حجم الحقن، يمكن أن تتضرر أنسجة الخصية.
5. Electroporation للمن الخصية
- لتمكين Electroporation للفعالية، ونقع الأقطاب منتاش في برنامج تلفزيوني (1X). وهذا يضمن تصرف الملائم.
- ضغط بسلاسة الخصية بين الأقطاب الرطب (الشكل 2F). قياس المقاومة الكهربائية مع electroporator.
- تطبيق الحالي إلى الخصية. أداء ثمانية نبضات مربع من 40 V في 4 مواقع مختلفة الخصية مع مدة ثابتة من 50 مللي ثانية الوقت النبض والوقت الفاصل 950 مللي ثانية.
6. إغلاق الجرح وبعد الجراحة
- عندما يتم الانتهاء من Electroporation لل، ضع الخصية مرة أخرى في الموقع الأصلي.
- خياطة الطبقة الداخلية العضلات مع خياطة الجراحية (انظر المواد).
- إغلاق الجلد عن طريق استخدام مقاطع خياطة (انظر الجدول المواد). سحب الجلد حتى الطرافةح ملاقط. تأكد استبعاد الطبقة العضلية. وضع مقاطع، كل على مسافة لا تزيد عن 5 مم.
ملاحظة: لأن خياطة الجراحية يمكن ابتلاعها عن طريق الماوس، ويفضل مقاطع خياطة لإغلاق الآفة الجلدية. - السماح الماوس للتعافي من التخدير على مناشف ورقية معقمة وضعت في قفص الماوس فارغة عقيمة، والذي خفف على وسادة 37 ° C الدافئة. يجب أن لوحة ضمان احترار نصف القفص خلق التدرج الحرارة. للحيوان هذا يجعل من الممكن للبحث عن الفردية، منطقة مريحة أكثر نظرا لتنوع درجة الحرارة في القفص. بالإضافة إلى ذلك، تغطية الماوس مع ورقة من منشفة ورقية معقمة بحيث يمكن تخفيض الإجهاد أبعد من ذلك. ملاحظة: بما أن سطح الجسم الماوس مرتفع غير مألوف بالنسبة لكتلة الجسم، مقارنة مع الحيوانات الكبيرة، ودعم الحراري ذو أهمية خاصة للانتعاش الناجح من القوارض.
- عند الحيوان تعمل أيقظت بالكامل، ونقل طر لمزيد من الانتعاش إلى قفص الفأرة الجديدة مجهزة تماما. لا تضع الحيوان العودة إلى قفصه القديم أو لمجموعة من الفئران. تأكد من أن القفص كما نظيفة ومعقمة قدر الإمكان لمنع عدوى الجرح. مراقبة عملية التعافي بأكملها. لنقل الماوس مرة أخرى إلى مرفق رعاية الحيوانات، والانتظار حتى تعافى بشكل كامل ويبدو أن تتصرف بشكل طبيعي.
ملاحظة: يتم مناقشتها قفز إضافية واستراتيجيات ما بعد العمليات الجراحية بواسطة بريتشيت كورنينج-KR وآخرون 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويتضح الإعداد التجريبي لأداء حقن مكروي و electroporation الماوس الخصية في الجسم الحي كما يتم استخدامه وفقا للبروتوكول في الشكل 1. على الرغم من أنه من الممكن الحصول على بال micropipettes المصنعة صناعيا، فضلنا لتوليد ماصات الخاصة بنا عن طريق سحب (الشكل 1A ) والميلا (الشكل 1B) الشعيرات الدموية الزجاج بحيث تركيبها احتياجاتنا. ويتضح المعدات اللازمة لحقن مكروي و electroporation في الشكل 1C. لأسباب الكفاءة ترنسفكأيشن، فإنه من الأهمية للاستفادة من موجة electroporator مربع.
الشكل 2 يعرض الخطوات الرئيسية لعملية جراحية الفأر مع التركيز بشكل خاص على إعداد القناة ناقل. في هذا السياق تتعرض لها الخصية (الشكل 2A) والقناة صادر يتم التعرف عن طريق الملاحظة مجهر وأفرج عنه من الأنسجة الدهنية (شملت رقمالبريد 2B). بعد ذلك، تضرر القناة ناقل مع ماصة حقن مكروي ويدار الحل البلازميد (أرقام 2C-E). وأخيرا، تقلص الخصية تحميل بين قطبين وtransfected قبل تطبيق نبضات موجة مربعة (الشكل 2F).
هذا النهج في الجسم الحي ترنسفكأيشن يسمح استخدام البلازميدات مختلفة ترميز الجينات المختلفة المراسل. نحن هنا استخدام ناقلات مراسل pEGFP-C1 (الشكل 3A)، والذي يعبر تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) وكذلك pDsRed2-N1 (الشكل 3C) ناقلات تمكين transactivation من البروتين الفلوري الأحمر (DsRed2). في حالتنا، وكانت كل من الجينات مراسل تحت سيطرة المروج المضخم للخلايا البشرية فوري المبكر (CMV).
من أجل تقييم نجاح ترنسفكأيشن، كانت تحصد الخصيتين microinjected وelectroporated بعد 3 أيام الإجراء بأكمله ولاحظ تحت الفلوريةcence المجهري (الشكل 3). لتحقيق مفصل، كانت الخصيتين-الفورمالديهايد ثابت، جزءا لا يتجزأ من البارافين، شرائح (5 ميكرون)، وكذلك counterstained مع ل-PRO-3، مما أدى إلى نوى زرقاء اللون. في نهاية المطاف، تم فحص المقاطع بواسطة المجهر مضان. ويمكن رؤية مثالين من النتائج الممكنة ترنسفكأيشن في الشكل 4. يشار إلى التعبير عن EGFP مراسل الجين بواسطة مخضر، وعينت transactivation من DsRed2 من الانبعاثات الأحمر.
الرقم 1. معدات لحقن مكروي في الجسم الحي و electroporation الماوس الخصية. تتشكل الشعيرات الدموية الزجاج باستخدام مجتذب micropipette (A) في حين شحذ النصائح الاستفادة من micropipette beveler (
يتم منح الرقم 2. توضيحات من الجسم الحي في حقن مكروي الخصية وإجراء Electroporation للفي الماوس بما في ذلك التدخل الجراحي مسبق. الوصول إلى الخصية عبر فتح البطن الفأر الذي تم تخدير قبل. يتم قطع فقط فوق الغدد القلفة. بعد الكشف عن الخصية، يتم تحريرها سنويا من دهون البطن س (A). تحت مجهر المراقبة، يتم التعرف على القناة ناقل وتحرير الدهون. يتم وضع ماصة حقن مكروي بجانب القناة في حين نهاية حادة من الإبرة يشير نحو القناة ناقل (B). يتم إدخال الزجاج الشعرية في القناة ويتم نقل نحو الخصية إلى وضعه مباشرة داخل الخصية الشبكة (C). يتم مراقبة إجراءات تطبيق الحمض النووي وملء الأنابيب المنوية بمساعدة الأخضر السريع (D). فقط 2/3 من الخصية يحصل شغل من أجل منع وقوع ضرر للأنسجة (E). للخطوة النهائية Electroporation لل، محشورة بين الخصية منتاش من نوع أقطاب لتطبيق البقول مربع الكهربائية (F). يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3. جبل الجامع الخصية بعد 3 أيام في electroporation فيفو تحت المجهر مضان، الخصية transfected من C57BL / 6 الماوس المعرض تعبير عن تعزيز بروتين الفلورية الخضراء - EGFP (A) وبروتين أحمر فلوري - DsRed2 (C) على حد سواء المشفرة على pEGFP- وpDsRed2 C1-N1 البلازميد، على التوالي. كان التعبير عن كل من الجينات مراسل تحت سيطرة العنصر CMV-PROMOTOR نشط بتواجد مطلق. ويتجلى ترنسفكأيشن الفعال للالأنابيب المنوية التي تستهدفها كثافة مضان. وحات (B) و (D) وتوضح لصناعة السيارات في مضان من untransfected السيطرة الخصية. شريط النطاق = 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4. أقسام الماوس الخصية بعد 3 أيام من جانب واحد في electroporation فيفو مع مبينة pEGFP-C1 بلازميد. نتائج ترنسفكأيشن من أقسام الخصية الماوس ثابت (5 ميكرون) بعد 3 أيام Electroporation للمن جانب واحد مع pEGFP-C1 بلازميد. transfected بنجاح الخصية cellsare أنبوبي المشار إليها مخضر. TO-PRO-3 نوى counterstained يتم كشفها بواسطة الانبعاثات الأزرق (A و B). الهياكل المستديرة هي نموذجية لتنظيم الخلايا داخل الأنابيب المنوية. شريط النطاق = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
بحوث في مجال البيولوجيا الإنجابية، وبخاصة في مجال خصوبة الرجال والحيوانات المنوية حتما يعتمد على الكائنات الحية. من أجل دراسة وظيفة الخصية، لم تنشئ خلية ثقافة كافية / نظام في المختبر قادرة على تبيان كل التغيرات المورفولوجية حاسمة من spermatogonium مضاعفا إلى 1،2 الحيوان المنوي الناضج فرداني. وهكذا، فإن جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا وغالبا ما يكون ضروريا وعلى هذا النحو أداة قيمة في علم الأحياء التناسلي الذكري. ولهذه الغاية، فإن عددا كبيرا من المعدلة وراثيا، خروج المغلوب واضعا في تم إنشاؤها الفئران التي سلمت نظرة ثاقبة خصوبة الرجال. ومع ذلك، عادة ما يتم القيام به جيل من الفئران المعدلة وراثيا عن طريق حقن جينات يبني في طليعة النواة من البويضة الملقحة. ومع ذلك، هذا الأسلوب هو تستغرق وقتا طويلا ويفترض أن يتم ذلك بواسطة مختبرات متخصصة. الإجراء لتوليد الضربة القاضية، أو تدق في الحيواناتهو أكثر تطورا.
طريقة أخرى لدراسة وظيفة الجين من الكائنات الحية التي هي نموذج ترنسفكأيشن عابر. ومع ذلك، فإن التنبيغ مشترك مع ناقلات فيروسية قد يسبب ردود الفعل المناعية غير محددة أو أخرى ويتطلب أنظمة السلامة الخاصة. وضبط النفس Lipofection 3 و 4 microparticle القصف النهج للأسف إلى عمق خلية معينة بل قد تؤدي إلى آثار سلبية على الأنسجة.
ومع ذلك، من خلال وسائل تطبيقها مباشرة النبضات الكهربائية مربع على الأنسجة المستهدفة، ما يسمى Electroporation لل، فمن الممكن فعلا أن بالنقل الأنسجة الحية، على سبيل المثال، وهنا الخصية الماوس. وعلاوة على ذلك، هذا الأسلوب يتطلب سوى تكاليف منخفضة، والمعدات منخفضة والماهرة بشكل صحيح المختبر الشخصية.
وهناك فائدة أخرى جديرة بالملاحظة المرتبطة في الجسم الحي طرائق نقل بالمقارنة مع بإصرار وضع الحيوانات المعدلة وراثياليرة سورية هو إمكانية التعاون ترنسفكأيشن. في حين المعدلة وراثيا أو تدق الفئران عادة ما تحمل فقط بناء جين واحد، في الجسم الحي ترنسفكأيشن تمكن، تحليلات شاملة متزامنة من بنيات مختلفة الجينات داخل الخلية نفسها. ويمكن القيام بذلك عن طريق استخدام مختلف الجينات المراسل، على سبيل المثال، GFP YFP مقابل أو مقابل Gaussia- Renilla-luciferase المراسل، بحيث التحقيق المقارن من النوع البري وآثار الجينات الطافرة ممكن.
وعلاوة على ذلك، من تطبيق المروجين محدد نوع من الخلايا، والتعبير عن بنيات الجينات يمكن أن توجه بشكل رائع على خلايا معينة في الخصية. على سبيل المثال، قد تسمح لهذا التعبير الجيني في خلايا الخصية فقط سيرتولي أو الخلايا المنوية.
بروتوكول المعروضة في هذه المادة يغطي طريقتين مهمة في مجال علم الأحياء التناسلي الذكري. أول واحد هو حقن مكروي في الأنابيب المنوية مع إعداد الشعرية الحقن. هذه التكنولوجياوقد يت ضمن المتورطين عادة في الجرثومية / زرع الخلايا الجذعية إما من الحيوانات المعدلة وراثيا إلى المستلم 7 أو في سياق xenografting 8. الأسلوب الثاني هو Electroporation للترنسفكأيشن قادرة على إحداث مسام عابرة في غشاء البلازما وكذلك تدفق بالجملة موجهة من الجزيئات المشحونة مثل البلازميدات، وضمان مدخل إلى بعض الخلايا أو الأنسجة إلى حد ما. وكثيرا ما أعرب عن تقديره هذا اتجاه واضح من الجزيئات التي Electroporation للفي ترنسفكأيشن الخلية العصبية من جانب واحد في كثير من الأحيان القيام به في الرحم أو 9،10 في تطوير شبكية العين 11.
ويشمل البروتوكول طريقة مفصلة عن الخطوات السابقة الحاسمة الأولى التخدير من الفئران الذكور، المعرض من الخصية عبر الآفة في البطن، وإعداد القناة ناقل فضلا عن microinjection في القناة. وهذه الأعمال يطالبون جدا، ينصح بشدة الممارسة الأولى على الحيوانات النافقة قبل تنفيذ سperations على الفئران الحية. وعلاوة على ذلك، يتم توفير إرشادات حول كيفية حقن وملء الأنابيب المنوية مع بلازميد الحمض النووي وكيفية إجراء Electroporation للفي الخصية بشكل مناسب.
بسبب تطبيق الكهرباء خلال EP، إنتاج الحرارة قد يؤدي تلف الأنسجة وخصوصا في الجهد العالي. ويرافق هذه الزيادة في الكفاءة ترنسفكأيشن 12، 13، 15 بواسطة الجهد المرتفع من التأثير السلبي للانكماش الخصية 12-14. على مدى الجهد الأكثر ملاءمة يبدو أن بين 30-50 V، وضمان آثار صغيرة على سلامة الخصية والحيوانات المنوية 16 جودة عادية، سلوك التزاوج الطبيعي 17، والحفاظ على إنتاج ذرية قدرة 16-20 فضلا عن فعالية ترنسفكأيشن كافية.
بخصوص الجينات كثافة التعبير عن بنيات الجين المنقول، Yomogida آخرون 21 وقد كشفت أيضا انخفاض ملحوظ EXPRession ناقلات خطي بعد 3 أيام تنفيذ EP حين دائري بلازميد الحمض النووي من الواضح لا يزال يحافظ التعبير بعد 35 يوما وفقا لأعلى واحد في خلايا سيرتولي. هذا يشير إلى أن يتم الحصول على أفضل النتائج عند استخدام البلازميد بنيات ل electroporation كما فعلت هنا. في نهجنا، ونحن التحقيق الكفاءة ترنسفكأيشن بعد 3 أيام Electroporation للوذلك بسبب ملاحظة أن هذه الفترة الزمنية كافية لالتئام الجروح الكافي، جبر سلامة الخلية وكذلك التعبير الصحيح المطلوب من البروتينات مراسل EGFP وDsRed2. وهكذا، فإن فترة حضانة من 3 أيام بعد تدخل الجراحي وإجراء ترنسفكأيشن بأكمله يبدو ضروريا لضمان استعادة وظائف الخلية بشكل مناسب بما في ذلك التعبير الجيني بحيث إشارة مضان كما مكثفة ممكن يمكن الكشف عن ضمان نتيجة ترنسفكأيشن موثوقة. فيما كفاءة ترنسفكأيشن، كشفت Yomogida آخرون أن ال 21البريد خلايا سيرتولي الجسدية على ما يبدو أكثر استجابة لEP-ترنسفكأيشن من الخلايا الجرثومية. نوصي شارك ترنسفكأيشن من الخصية مع الهدف والسيطرة البلازميدات، كل الترميز لجين مراسل مختلفة.
النهج Electroporation للقدم ينطبق على طائفة واسعة من القضايا الممكنة في اشارة الى عمليات الخلية الجرثومية وخصوبة الرجال. على سبيل المثال، فإنه يمكن استخدامها لتحليل العناصر التنظيمية من جينات الحيوانات المنوية محددة 17،22. والأسلوب هو أيضا مناسبة لفقدان وظيفة، مع دراسات صغيرة بالتدخل RNA وكسب 23-وظيفة يدرس 24. بالإضافة إلى ذلك، هناك فرص واعدة لتحقيق EP حتى لتلقي العلاج العلاجية وجيل من نسل المعدلة وراثيا والمجموعات البحثية أظهرت بالفعل 18،20،25.
وبالتالي، فإن يتضح الأسلوب المنهجي رواية الماوس الخصية في electroporation فيفو بالتزامن مع القناة الصادرة microiسوف njection من بنيات بلازميد الارتفاع نأمل أن تقنية قيمة للكشف بنجاح طبيعة الحيوانات المنوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
مارتن ميكايليس، الكسندر Sobczak، ويواكيم M. Weitzel يعمل في معهد البيولوجيا الإنجابية، معهد ليبنيز لعلم الأحياء مزرعة الحيوانات (FBN)، Dummerstorf، ألمانيا، أن تعلن أنها لا تملك المصالح المالية المتنافسة.
Acknowledgments
نشكر بيرجيت Westernstroeer مركز الطب التناسلي وأمراض الذكورة في جامعة مونستر لتعليم حقن مكروي الخصية. الى جانب ذلك، نحن ممتنون لأورسولا Antkewitz والبتراء Reckling للمساعدة التقنية. نشكر مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) لدعم هذا العمل (WE2458 / 10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| Microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| Micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| Tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| Surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder | |
| Fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| Surgical suture | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| Syringe with 30 G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| Plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Urotamin | mix in a rate 1:1 with xylazine |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Xylazin | mix in a rate 1:1 with ketamine |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
References
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R.
- Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
- Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
- Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
- Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
- Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
- Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
- Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
- Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
- Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
- Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
- Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
- Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
- Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
- Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
- Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
- Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).
