Summary
מאמר זה מתאר microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כטכניקת transfection לתאי עכבר אשכים ללמוד תהליכים ייחודיים של יצירת תאי זרע. הפרוטוקול המובא כרוך בצעדים של הכנת זכוכית נימים, microinjection באמצעות צינור efferent, וtransfection ידי electroporation.
Abstract
תרומת וידאו ומאמר זה נותנת תיאור מקיף של microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo. טכניקת transfection המסוימת הזה לתאי עכבר אשכים מאפשרת המחקר של תהליכים ייחודיים ביצירת תאי זרע.
הפרוטוקול הבא מתמקד בtransfection של תאי עכבר אשכים עם בונה פלסמיד. באופן ספציפי, אנו משמשים וקטור הכתב pEGFP-C1, המבטא משופר חלבון ירוק ניאון (eGFP) וגם וקטור pDsRed2-N1 לבטא חלבון אדום ניאון (DsRed2). שני גני הכתב המקודדים היו תחת שליטתו של אמרגן ציטומגלווירוס האנושי מיידי מוקדם (CMV).
לביצוע העברת גנים לתוך אשכים עכבר, בונה פלסמיד הכתב מוזרקות לתוך אשכים של עכברים חיים. לשם כך, האשכים של בעלי חיים מורדמים חשופים והאתר של microinjection מוכן. המקום המועדף שלנו שלהזרקה היא צינור efferent, עם אשך ךטה" מחובר סופו של דבר כדרך תחבורה האנטומי של תאי הזרע בין האשך ויותרת האשך. בדרך זו, המילוי של אבוביות הזרע לאחר microinjection מנוהל מצוין ומבוקר בשל השימוש בפתרוני DNA מוכתם. לאחר התבוננות מילוי מספק של האשך על ידי מבנה אבובית הצבעוני שלה, האיבר electroporated. זה מאפשר ההעברה של פתרון דנ"א לתוך תאי האשכים. בעקבות 3 ימים של דגירה, האשכים מוסרים ונחקרים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק או אדום, הממחישים את ההצלחה transfection.
באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות מועסק להעברת דנ"א או RNA- בונה לאשך עכבר חיים כדי (מעל) להביע או להפיל את הגנים, להקל בניתוח תפקוד גן vivo. יתר על כן, הוא מתאים ללימוד מושגי כתב או regula גן המשועראלמנטי טורים. לפיכך, היתרונות העיקריים של טכניקת electroporation הם ביצועים מהירים בשילוב עם מאמץ נמוך, כמו גם הציוד הטכני המתון וכישורים הנדרשים בהשוואה לטכניקות חלופיות.
Introduction
יצירת תאי זרע של יונקים נחשב לתהליך מתוחכם של תאי גזע עצמי חידוש ברציפות עוברים מיטוזה, מיוזה ובידול על מנת להתפתח לתאי זרע הפלואידים בוגרים. שינויים מורפולוגיים אלה בניצוחו של תאים מסוגים שונים ולמרות ניסיונות עמוקים, זה עדיין בלתי אפשרי לחקות את התהליכים הללו בתא התרבות 1,2. לפיכך, מחקר על יצירת תאי זרע עד עכשיו מסתמך על אורגניזמים חיים כמודלים in vivo. באופן כללי, מחקרי תפקוד הגן מבוססים בדרך כלל על בעלי חיים מהונדסים. עם זאת, יצירה והשמירה של מודל חיה מסוג זה היא זמן רב, עלות אינטנסיבית ומורכבת למדי. זה מיוחס לתהליך הרבייה הארוך הנדרש ליצירת ושמירה על transgene לאורך הדורות. בנוסף, המניפולציה הגנטית של האורגניזם כולו על ידי הגישה המהונדס או נוק אאוט הוא נוטה לגרום לליקויים פיסיולוגיים כאשר מיקוד גרםenes עם פונקציות חיוניות באזורים רבים, למשל, מחוץ לאשך או מערכתי.
יתר על כן, כמה שיטות transfection חולפות קשורות עם כמה חסרונות קריטיים. לדוגמא, חסרונות אופייניים להעברת גנים בתיווך וירוס הם הפרובוקציה האפשרית של immunoreactions ותקנות בטיחות נוספות, ואילו lipofection 3 וmicroparticle הפגזה 4 עלולה לגרום נזק לרקמות ומוגבלות לעומק תא מסוים ליעילות transfection מספיק.
בניגוד לכך, electroporation (EP) כדרך נוספת נפוצה של transfection החולף נראה, להוות טכניקה מבטיחה למאפשר בtransfection vivo וin vivo ניתוח גנטי עולה בקנה אחד. באופן כללי, EP נקרא תופעה דינמית שתלוי במתח הטרנסממברני מקומי עם נקבוביות בתיווך כתוצאה מכך בתוך ננו שניות. t פערים אלה יכולים להישמר במשך אלפיות השניה, מספיקo להעניק גישה לDNA, RNA או מולקולות קטנות 5. כאשר המתח שיושם הוא גבוה מדי, האופי בדרך כלל החולף של EP הוא נוטרל עקב ייצור חום ואינדוקציה של permeabilization המקיף מדי עם נזק בלתי הפיך הסוגר של התא 5.
כאן, אנו מראים כי electroporation הוא מערכת transfection יעילה וחסכונית שהוא מסוגל להיות מנוצל לשינוי אשך גנטי כדי להבהיר מאפיינים גנטיים אשכי in vivo. מאמר זה עוסק הכנת פלסמיד, microinjection באמצעות צינור efferent וelectroporation הבא של אשך עכבר. הליך זה יכול להיות האמצעי של בחירה כדי להשיג transfection מהיר, ספציפי והיעיל של אבוביות זרע של אשך עכבר in vivo כדי לחקור תהליכים של יצירת תאי זרע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים בבעלי החיים שבוצעו אושרו על ידי הוועדה המקומית האתיקה (Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei, מקלנבורג מערב פומרניה-, גרמניה).
.1 פלסמיד הכנה
- להכנת פלסמיד, שימוש ערכות פלסמיד טיהור (ראה טבלת חומרים) או בשיטות דומות עם חיץ הסרת רעלן הפנימי כדי שניתן תהיה להימנע מתגובות חיסוניות של בעלי החיים. בצע את ההוראות של המדריך. להעסיק DDH 2 O כדי לדלל את פתרון פלסמיד.
- לחסל את הפסולת על ידי ספינינג פתרון DNA במהירות המרבית (20,000 XG). ואז לאסוף את supernatant.
- לקבוע את ריכוז פלסמיד עם ספקטרופוטומטר (ראה חומרים).
- התאם את ריכוז פלסמיד עם DDH 2 O ל 1-3 מיקרוגרם (DNA) / μl. הערה: ריכוזים נמוכים יפחיתו את יעילות transfection, ואילו ריכוזים גבוהים יותר עלולים לגרום לפתרון הזרקה צמיג מדי. חוץ מזה,יעילות transfection תלוי בגודל של פלסמיד ולהיבדק בנפרד.
- לפני הזריקה, להכין תערובת פתרון עם לפלסמיד μl דוגמא 40 יחד עם 5 μl PBS (10x) ו -5 ירוקים μl מהיר (0.5%). גרין המהיר נחוץ למעקב אחר תהליך ההזרקה. רצוי, להשתמש PCR-צינורות קיר דקים או Parafilm. הערה: בהתאם לגודל של האשך, בהיקף של 20-50 μl יהיה צורך לכל אשך.
2 הכנת Microinjection פיפטה
- השתמש בנימי ורוסיליקט (ראה טבלת חומרים) להכנת טפטפות microinjection.
- משוך נימי זכוכית עם חולץ נימים אנכי (ראה טבלת חומרים).
- לשבור את קצה נימים עם מלקחיים על ידי ברכות פסים. טיפ הוא בדרך כלל 50-80 מיקרומטר בקוטר ואורכו כ 1 סנטימטר. נסה להימנע מטיפים שהם ארוכים מדי כמו אלה הם לא נוקשה מספיק כדי לחדור את הרקמה.
- לבסוף, sharpen הקצה ב30 מעלות ל45 ° זווית באמצעות beveler micropipette (ראה טבלת חומרים).
- טען את פיפטה microinjection עם לערבב פתרון הזרקה (ראה פלסמיד הכנה). ליישם את הפתרון לחלק האחורי של נימי הזכוכית עם מזרק קטן. הערה: נסה להימנע מבועות אוויר בעת טעינה, אחרת אלה יהיו להזריק לתוך אבוביות הזרע יחד עם פתרון פלסמיד, ולכן יפחית את המוליכות כמו גם ואולי לגרום נזק לרקמות.
.3 הרדמה וניתוח
- לבצע את הפעולה בתנאי ספטית על ידי שימוש בחומר סטרילי (כלומר, מזרק, מחט, מכשירי ניתוח, וכו '). זה יקטין זיהום של בעלי החיים ולהבטיח שיעורי הישרדות טובים.
- השתמש בעכברי זכרים לelectroporation בגיל 6-8 שבועות.
- כדי לאתחל טיפול משכך כאבים לאחר ניתוח, לספק את העכבר עם משככי כאבים הוסיף שתיית מים ביום לפני הניתוח. זה התחתures שיכוך כאבים מקדים במקרה של hypodipsia סבירות גבוהה שלאחר ניתוח (צריכת מים פחת). לשם כך, לחשוף את מי שתייה עם למשל השעיה איבופרופן ילדים (20 מ"ג / מ"ל). גם מי שתיית תרופות צריכים להיות מסופק ביום אחד ושתיים מהתאוששות בריכוז זהה. משמעות הדבר היא מנה יומית של 7.5 מ"ג / קילוגרם, תקף למשקל 5 מ"ל / מי שתיית ד וגוף של 25g במשך 8 שבועות בגילי C57BL / 6J. משטר משכך כאבים זה מבטיח הקלה על כאב בסיסית והתאוששות מואצת יחד עם גבוהה רווחה 26.
- להכנת ההרדמה עובדת פתרון ביום של ניתוח, לערבב 10% Ketamin ו2% Xylazin ב1: 1 (ראה טבלת חומרים).
- כדי להרדים את החיה, להחיל משקל גוף 0.25 מ"ל / 100 מ"ג תת עורי הרדמה (Ketamin = 0.125 גר '/ קילוגרם; Xylazin = 0.025 גר' / קילוגרם). השתמש באתר הזרקה בין האגן וגפיים על מנת למנוע נזק לאיברים ולפציעתם של העכברים. בדרך כלל, יש צורך ב10 דקותעד העכבר בהרדמה עמוקה.
- כסה את עיני עכבר עם משחה וטרינר כדי למנוע יובש במהלך הרדמה.
- בחן את מעצר הרדמה עמוק, שניכר על ידי היעדר מוחלט של תגובה. לשם כך, פשוט צובט את הבוהן של בעלי החיים.
- כדי להתחיל את הניתוח, להסיר שיער בבטן עם מכונת גילוח חשמלי או דומה ולחטא את אזור הפעולה עם sterilium או דומה.
- לעשות חתך הגחון ישירות מעל בלוטות preputial במרכז אזור הבטן. באותו מקום, למשוך ראשון עור משם ולערוך בו קיצוץ רוחבי עורית קטנה של כ 8-14 מ"מ. לאחר מכן, ימשיך לאורך שכבת שרירי הבטן.
הערה: הנגע צריך להיות קטן ככל האפשר כדי להפחית את הפגיעה בבעלי החיים. - משוך את רפידות שומן בבטן בזהירות כדי לחשוף את האשכים המצורפים והנח אותו על וילון לפני מוכן עמיד למים חד פעמי נייר ממש ליד אתר החתך (איור 2 א).
- להשתמש במשקפת לfind צינור efferent כמטרת ההזרקה. Efferent ductus מזוהה כצומת כלי דקה שבין האשכים ויותרת האשך. הוא ממוקם בסמוך לעורק אשכים הבולט. Ductus פועל כמעט בזווית של ° 45 לעורק ובעליל נכנס epididymidis Caput. הערה: בהתאם לגילו של העכבר, ductus בדרך כלל נקבר ברקמת שומן.
- השתמש במלקחיים עדינים כדי לנקות את צינור efferent של רקמת השומן הזה. אחרי זה, למקם את ductus שוחרר ברצועת נייר סטרילי כדי להבטיח את הנראות ברורות של הצינור מבלי לפגוע בסביבה.
.4 Microinjection וDNA Application
- חבר את פיפטה microinjection, אשר נטענה עם פתרון פלסמיד ליחידת micromanipulator / מזרק.
- מניחים את המחט המקבילה microinjection לצינור efferent עם הקצה והצביע לעבר אשך ךטה" (איור 2).
- השתמש בפינצטה בסדר ולהפשיט את הצינור מעל פיפטה microinjection. ודא שהנימים נשמרות במקביל לצינור תוך משיכתו מעל.
הערה: הליך זה הוא נוח יותר מאשר לחדור לספינה על ידי הזזת המחט עם micromanipulator. - כוון את המחט בזהירות לכיוון האשכים ולעצור בדיוק כפי שחודר אשך ךטה" ישירות מתחת לalbuginea Tunica (איור 2 ג).
הערה: במקרה של overreaching אשך ךטה", פתרון פלסמיד ידלוף למרחב הבין. זה מוביל בדרך כלל לכישלון של transfecting אבוביות זרע. - להזרקה של פתרון פלסמיד לנצל microinjector עם ההגדרות הבאות: pi: 100 hPa ti,: 0.2 שניות, ומחשב: 0 hPa (איור 2 ד).
- לפקח על כל תהליך ההזרקה על ידי התבוננות האשך מילוי מעמד בעזרת הצבע הירוק. תשמור על עצמך כי האשך מלא רק עד 2/3 שלה נפח עם plפתרון asmid (איור 2E).
הערה: אם נפח ההזרקה הוא חריגה, רקמת האשך עלולה להיפגע.
.5 Electroporation של אשך
- כדי לאפשר electroporation היעיל, לספוג את האלקטרודות פינצטה בPBS (1x). הדבר מבטיח מוליכות נאותות.
- בצורה חלקה לסחוט את האשך בין האלקטרודות הרטובות (איור 2F). מדוד את ההתנגדות החשמלית עם electroporator.
- החל נוכחי לאשך. לבצע שמונה פולסים מרובעים של 40 V ב 4 אתרי אשך שונים עם משך קבוע של 50 זמן דופק אלפיות שני ו950 מרווח זמן אלפיות שני.
.6 סגירת פצעים ולאחר ניתוח
- כאשר electroporation נגמר, הנח את האשכים בחזרה במיקום המקורי.
- לתפור את שכבת שרירים הפנימית עם תפר כירורגים (ראה חומרים).
- סגור את העור על ידי שימוש בקטעי תפר (ראה טבלת חומרים). משוך את שנינות העור עדפינצטה h. ודא שלא לכלול את השכבה השרירית. הנח את קטעים, כל אחד במרחק של לא יותר מ 5 מ"מ.
הערה: מאחר ותפר כירורגים יכול להיבלע על ידי העכבר, קליפים תפר הם העדיפו לסגירת הנגע בעור. - אפשר העכבר כדי להתאושש מהרדמה על מגבות נייר סטרילי להציב בכלוב סטרילי ריק עכבר, המזג על משטח חם 37 מעלות צלזיוס. הכרית צריכה להבטיח את ההתחממות של חצי אחד של כלוב יצירת שיפוע חום. לחיה זו מאפשרת לחפש את האזור הבודד, הכי הנוח בשל מגוון הטמפרטורה בכלוב. בנוסף, לכסות את העכבר עם גיליון של מגבת נייר סטרילי, כך שלחץ יכול להצטמצם עוד יותר. הערה: מאחר שמשטח גופו של העכבר הוא גבוה מרגיל ביחס למסת גוף, בהשוואה לבעלי חיים גדולים יותר, תמיכת התרמית היא בעלת חשיבות מיוחדת לשחזור מוצלח של מכרסמים.
- כאשר בעלי החיים המופעלים התעוררו באופן מלא, להעביר it להמשך התאוששות בכלוב עכבר חדש מצויד לחלוטין. אין לשים את החיה חזרה לכלוב שלה ישן או לקבוצה של עכברים. ודא שהכלוב הוא נקי וסטרילי ככל האפשר כדי למנוע זיהום פצע. לפקח על תהליך ההתאוששות כולו. כדי להעביר את העכבר בחזרה למתקן הטיפול בבעלי החיים, לחכות עד שהוא התאושש לחלוטין ונראה שהתנהג בצורה נורמלית.
הערה: per- נוסף ואסטרטגיות לאחר ניתוח נדונים על ידי אל פריצ'ט-Corning KR et 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההגדרה הניסיונית לביצוע microinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo כפי שהוא משמש על פי הפרוטוקול מתוארת באיור 1. למרות שזה אפשרי לרכוש micropipettes תעשייתי מיוצר, העדפנו ליצור טפטפות שלנו על ידי משיכת (איור 1 א ) וbeveling (איור 1 ב) נימי זכוכית, כך שהם מצוידים הצרכים שלנו. הציוד לmicroinjection וelectroporation מתואר באיור 1 ג. מסיבות של יעילות transfection, יש חשיבות לנצל electroporator גל מרובע.
איור 2 מציג את השלבים העיקריים של ניתוח העכבר עם דגש מיוחד על ההכנה של צינור efferent. בהקשר זה האשך חשוף (איור 2 א) ואת צינור efferent מזוהה על ידי תצפית משקפת ושוחרר מרקמת שומן (figurדואר 2B). בהמשך לכך, צינור efferent הוא ניקב עם טפטפת microinjection ופתרון פלסמיד מנוהל (איורים 2C-E). לבסוף, נטען האשך הוא נדחק בין שתי אלקטרודות וtransfected על ידי פולסים מיושמים כיכר גל (איור 2F).
in vivo גישת transfection זה מאפשרת שימוש בפלסמידים שונים קידוד גני כתב שונים. כאן השתמשנו בוקטור הכתב pEGFP-C1 (איור 3 א), המבטא את החלבון משופר ירוק ניאון (eGFP) וגם וקטור pDsRed2-N1 (איור 3 ג) המאפשר transactivation של חלבון אדום ניאון (DsRed2). במקרה שלנו, שני גני הכתב היו תחת שליטה של אמרגן ציטומגלווירוס האנושי מיידי מוקדם (CMV).
על מנת להעריך את ההצלחה transfection, האשכים microinjected וelectroporated נקצרו 3 ימים לאחר ההליך כולו ונצפו תחת fluoresמיקרוסקופיה דעך (איור 3). לחקירה מפורטת, אשכים היו פורמלדהיד-קבוע, משובץ בפרפין, (מיקרומטר 5) פרוס כמו גם counterstained עם To-Pro-3, וכתוצאה מכך גרעינים בצבע כחולים. סופו של דבר, החלקים נבדקו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. שתי דוגמאות לתוצאות transfection אפשריות ניתן לראות באיור 4. הביטוי של EGFP גן הכתב הוא הצביע על ידי הקרינה ירוקה, transactivation של DsRed2 מיועד על ידי פליטה אדומה.
איור 1 מכשור לmicroinjection וelectroporation של אשך עכבר in vivo. נימי זכוכית נוצרות באמצעות חולץ micropipette () ואילו הטיפים מתחדדים ניצול micropipette beveler (
איור 2 איור של in vivo microinjection אשך והליך electroporation בעכבר כוללים התערבות כירורגית מוקדמת. הגישה לאשך מוענק באמצעות פתיחת בטנו של העכבר שכבר הרדים לפני. הקיצוץ נעשה ממש מעל בלוטות preputial. לאחר שחשף האשך, שהוא משתחרר מרשות שומן בבטן ds (). תחת תצפית משקפת, צינור efferent מזוהה ושוחרר בשומן. פיפטה microinjection ממוקמת ליד ductus ואילו הקצה החד של המחט והצביע לעבר צינור efferent (B). נימי הזכוכית מוכנסת לתוך ductus והוא נע לעבר האשך להיות ממוקמים ישירות בתוך אשך ךטה" (C). ההליך של בקשת DNA ומילוי של אבוביות הזרע מנוטר בעזרת גרין המהיר (D). רק 2/3 של האשך מתמלא כדי למנוע פגיעה ברקמה (E). לצעד electroporation הסופי, האשך הוא נדחק בין אלקטרודות פינצטה הסוג ליישם פולסים חשמליים רבועים (F). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור אשך .3 הר שלם 3 ימים לאחר electroporation in vivo תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשך transfected של C57BL / 6 ביטוי מופע עכבר של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר -. EGFP () וחלבון פלואורסצנטי אדום - DsRed2 (C) שני מקודד על pEGFP- C1 וpDsRed2-N1 פלסמיד, בהתאמה. הביטוי של שני גני הכתב היה תחת שליטתו של יסוד CMV-promotor כל מקום בגוף הפעיל. Transfection היעיל של אבוביות הזרע הממוקדות בא לידי הביטוי בעוצמות הקרינה. פנלים (ב) ו (ד) ממחישים אוטומטי הקרינה של אשך שליטת untransfected. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4 סעיפים של אשך עכבר 3 ימים לאחר electroporation חד צדדי in vivo עם pEGFP-C1 פלסמיד. תוצאת Transfection סעיפים אשך עכבר קבוע (5 מיקרומטר) מוצג 3 ימים לאחר electroporation חד צדדי עם פלסמיד pEGFP-C1. בהצלחה transfected cellsare צינורי אשכים שצוין על ידי הקרינה ירוקה. -3 TO-PRO גרעיני counterstained הם לגילוי על ידי פליטה כחולה (A, B). המבנים העגולים אופייניים לארגון של תאים בתוך אבוביות זרע. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מחקר בתחום הביולוגיה של רבייה, במיוחד בתחום של פריון ויצירת תאי זרע באופן בלתי נמנע זכר מסתמך על אורגניזמים חיים. על מנת לבחון תפקוד אשכים, אין תרבית תאים מתאימה / מערכת במבחנה כבר נקבעה מסוגל משקף את כל השינויים מורפולוגיים המכריעים מspermatogonium דיפלואידי ל1,2 תא זרע הבשל הפלואידים. כך, הדור של בעלי חיים מהונדסים גנטי הוא לעתים קרובות הכרחי וככלי רב ערך, כגון בביולוגיה של רבייה גברית. לשם כך, מספר לא מבוטל של מהונדס, עקום החוצה ולדפוק בעכברים נוצרו שנמסרו תובנות פוריות גבר. אף על פי כן, הדור של עכברים הטרנסגניים נעשה בדרך כלל על ידי הזרקת מבני גן לpronucleus של ביציות מופרות. עם זאת, טכניקה זו היא זמן רב, והוא אמור להיעשות על ידי מעבדות מיוחדות. ההליך כדי ליצור עקום החוצה או לדפוק בבעלי חייםהוא אפילו יותר מתוחכם.
דרך נוספת של לימוד תפקוד גן של אורגניזמים חיים מודל היא על ידי transfection החולף. עם זאת, התמרה המשותפת עם וקטורים ויראליים עלולה לגרום לתופעות לא ספציפיות חיסוניות או אחרות ודורשת תקנות בטיחות מיוחדות. הפגזת Lipofection 3 וmicroparticle 4 גישות למרבה הצער מאופקים לעומק תא מסוים ואולי אפילו השפעות שליליות על הרקמה לעורר.
אף על פי כן, על ידי האמצעים של פולסים מיושמים ישירות כיכר חשמל ברקמת המטרה, electroporation מה שנקרא, הוא בעצם לאפשר לtransfect רקמת חיה, למשל, אשכי עכבר במסמך זה. יתר על כן, שיטה זו דורשת רק עלויות נמוכות, נמוך וציוד אישי ומעבדה מיומנת כראוי.
יתרון בולט נוסף הקשורים לשיטות transfection in vivo בהשוואה לבהתמדה מצב בעלי חיים שינו גןls הוא האפשרות של שיתוף transfection. בעוד מהונדס או לדפוק עכברים בדרך כלל לשאת רק לבנות גן אחד, transfection in vivo מאפשר ניתוחים מקיפים, בו זמניים של מבנים גנטיים שונים בתוך אותו התא. ניתן לעשות זאת על ידי השימוש בגני כתב שונים, למשל, GFP לעומת YFP או Gaussia- לעומת Renilla-לוציפראז-, כך שחקירה השוואתית של סוג בר ואפקטי גן המוטנטי הוא אפשרית.
יתר על כן, על ידי היישום של יזמי סוג תא מסוימים, הביטוי של מבני גן יכול להיות מופנה להפליא על תאים ספציפיים בתוך האשך. לדוגמא, זה עלול לאפשר ביטוי גני אשכים רק בתאים או spermatocytes Sertoli.
הפרוטוקול המובא במאמר זה מכסה שתי שיטות חשובות בתחום הביולוגיה של רבייה גברית. הראשון הוא microinjection לאבוביות זרע עם הכנת נימי ההזרקה. טק זוnique היה מעורב כלל בחיידק / השתלת תאי גזע או מבעלי חיים מהונדסים לנמען 7 או בהקשר של xenografting 8. השיטה השנייה היא transfection electroporation מסוגל גרימה נקבוביות חולפת בקרום הפלזמה, כמו גם זרימה מכוונת תפזורת של מולקולות טעונות כמו פלסמידים, להבטיח כניסה לתוך תאים מסוימים או לייתר דיוק רקמות. הכיוון הספציפי הזה של מקרומולקולות על ידי electroporation לעתים קרובות מוערך בtransfection התא באופן חד צדדי העצבי לעתים קרובות נעשה ברחם 9,10 או בפיתוח 11 רשתית.
פרוטוקול השיטה מפורט שקדמו כולל כצעדים חיוניים הראשונים ההרדמה של עכברי זכרים, האקספוזיציה של אשך באמצעות נגע בטן, ההכנה של צינור efferent כמו גם microinjection לductus. כפעולות אלה הן די תובעניות, זה מומלץ בחום לאימון ראשון על חיות מתות לפני ביצוע operations על עכברים חיים. יתר על כן, ניתנות הוראות כיצד להזריק ולמלא אבוביות זרע עם פלסמיד-DNA ואיך לנהל את electroporation של האשך כראוי.
בגלל היישום של חשמל בEP, ייצור חום עלול לגרום נזק לרקמות ובעיקר במתח גבוה. עלייה ביעילות transfection 12, 13, 15 על ידי מתח גבוה זו מלווה בהשפעה השלילית של אשכים מתכווצות 12-14. נראה טווח המתח החיובי ביותר להיות בין 30-50 V, המבטיח השפעות קטנות על שלמות אשכים, איכות רגילה זרע 16, התנהגות חיזור 17 רגילה, התחזוקה של יכולת ייצור צאצאי 16-20, כמו גם יעילות transfection מספיק.
עוצמת ביטוי גנים בעניין של מבני גן הועברו, Yomogida et al. 21 גם חשף expr מופחת במידה ניכרתession של וקטורים לינארית 3 ימים לאחר יישום EP ואילו פלסמיד-DNA המעגלי ברור עדיין מקיים ביטוי לאחר 35 ימים עם הגבוה ביותר אחד בתאי Sertoli. הדבר מצביע על כך את התוצאות הטובות ביותר מתקבלות כאשר משתמשים בבונת פלסמיד לelectroporation כפי שנעשה כאן. בגישה שלנו, אנחנו בדקנו את יעילות transfection 3 ימים לאחר electroporation בשל התצפית כי פרק זמן זה מספיק לריפוי פצע נאות, פיצוי של שלמות תא, כמו גם הביטוי ההולם הרצוי של חלבוני הכתב eGFP וDsRed2. לפיכך, נראה זמן דגירה של 3 ימים שלאחר ההתערבות כירורגית וההליך כולו transfection להיות הכרחי על מנת להבטיח פונקציות תא שוחזרו כראוי כוללים ביטוי גנים, כך שאותות הקרינה כאינטנסיביים ככל האפשר ניתן לאתרם להבטיח תוצאת transfection אמינה. בנוגע ליעילות transfection, Yomogida et al. 21 גילה כי התאי Sertoli סומטיים דואר הם כנראה מגיבים יותר לEP-transfection מאשר תאי נבט. אנו ממליצים שיתוף transfection של אשך עם פלסמידים יעד ושליטה, כל קידוד לגן כתב שונה.
גישת electroporation הציגה חלה על קשת רחבה של נושאים אפשריים המתייחסים לתהליכים בתא חיידק ופוריות גבר. לדוגמא, זה יכול להיות מנוצל לניתוח אלמנטי רגולציה של גני יצירת תאי זרע ספציפי 17,22. השיטה מתאימה גם ללימודי פסד של פונקציה עם קטנים RNA 23 להתערב ולהשיג של הפונקציה לומד 24. בנוסף, יש סיכוי מבטיח אפילו להשיג EP לטיפול ודור טיפוליים של צאצאים מהונדסים כקבוצות מחקר כבר הוכיחו 18,20,25.
לפיכך, מאויר גישה המתודולוגית רומן של אשך העכבר בelectroporation vivo בשיתוף עם microi צינור efferentnjection של בונה פלסמיד יהיה בתקווה לעלות לטכניקה חשובה להתרת הטבע של יצירת תאי זרע בהצלחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
מרטן מיכאליס, אלכסנדר Sobczak, ויואכים מ Weitzel מועסק במכון לביולוגיה של רבייה, לייבניץ המכון לביולוגיה חוות חיות (FBN), Dummerstorf, גרמניה, מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים בירגיט Westernstroeer של המרכז של רפואת הפוריות והאנדרולוגי באוניברסיטת מינסטר להוראת microinjection האשכים. חוץ מזה, אנחנו מודים לאורסולה Antkewitz ופטרה Reckling לקבלת סיוע טכני. אנו מודים לקרן המחקר הגרמנית (DFG) לתמיכה בעבודה זו (WE2458 / 10-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | Sigma | 1-15 PK | |
| Spectrophotometer | Nanodrop | ND-1000 | |
| Micropipette puller | Narishige | PC-10 | vertical capillary puller |
| Microinjection capillaries | Clark | GC100-10 | borosilicate standard wall |
| Micropipette beveler | Bachofer | Typ 462 | rotating disk beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | square wave electroporator |
| Tweezer electrodes | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø disk electrodes |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Cold light source | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | homemade | XYZ cross table | |
| Surgical instruments | FST | scissors, forceps, needle holder | |
| Fine forceps | FST | Dumont #5, #7 | efferent ducts preparation |
| Michel clip applying stapler | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel suture clips | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| Surgical suture | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| Syringe with 30 G needle | B. Braun | Omnican 40 | to load micropipette and for anesthesia |
| Plasmid isolation kit | Promega | Cat. # A2495 | plasmid Midiprep |
| Plasmid pEGFP-C1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + EGFP |
| Plasmid pDsRed2-N1 | Clontech | Cat. #6084-1 | CMV-promoter + DsRed2 |
| Fast Green dye | Sigma | F7258-25G | for dilution in ddH2O |
| 10% Ketamine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Urotamin | mix in a rate 1:1 with xylazine |
| 2% Xylazine | Serum Werk, Bernburg, Germany | Xylazin | mix in a rate 1:1 with ketamine |
| Sterilium | Bode Chemie | Sterillium | disinfection |
| Vet ointment | S&K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, Augensalbe | opthalmic ointment to prevent eye dryness |
| To-Pro-3 iodide | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| 1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| Ibuprofen, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | analgesic pediatric solution (NSAID) for postsurgery pain relief |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4·2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
References
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R.
- Zizzi, A., et al. fluorescent protein as indicator of nonviral transient transfection efficiency in endometrial and testicular biopsies. Microsc. Res. Tech. 73, 229-233 (2010).
- Williams, R. S., et al. Introduction of foreign genes into tissues of living mice by DNA-coated microprojectiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2726-2730 (1991).
- Bockmann, R. A., de Groot, B. L., Kakorin, S., Neumann, E., Grubmuller, H., Kinetics, statistics, and energetics of lipid membrane electroporation studied by molecular dynamics simulations. Biophys. J. 95, 1837-1850 (2008).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J. Vis. Exp. (47), (2011).
- Brinster, R. L., Avarbock, M. R. Germline transmission of donor haplotype following spermatogonial transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 11303-11307 (1994).
- Schlatt, S., Von, S. V., Schepers, A. G. Male germ cell transplantation: an experimental approach with a clinical perspective. Br. Med. Bull. 56, 824-836 (2000).
- Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos. J. Vis. Exp. (6), (2007).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), (2011).
- Blackshaw, S. In vivo electroporation of developing mouse retina. J. Vis. Exp. (52), (2011).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Nishimune, Y. Electroporated transgene-rescued spermatogenesis in infertile mutant mice with a sertoli cell defect. Biol. Reprod. 67, 712-717 (2002).
- Ryoki, S., Park, H., Ohmori, Y., Shoji-Tanaka, A., Muramatsu, T. An integrase facilitates long-lasting foreign gene expression in vivo in mouse spermatogenic cells. J. Biosci. Bioeng. 91, 363-367 (2001).
- Umemoto, Y., et al. Gene transfer to mouse testes by electroporation and its influence on spermatogenesis. J. Androl. 26, 264-271 (2005).
- Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 45-49 (1997).
- Hibbitt, O., et al. In vivo gene transfer by electroporation allows expression of a fluorescent transgene in hamster testis and epididymal sperm and has no adverse effects upon testicular integrity or sperm quality. Biol. Reprod. 74, 95-101 (2006).
- Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a. J. Exp. Zool. 286, 212-218 (2000).
- Dhup, S., Majumdar, S. S. Transgenesis via permanent integration of genes in repopulating spermatogonial cells in vivo. Nat. Methods. 5, 601-603 (2008).
- Huang, Z., et al. In vivo transfection of testicular germ cells and transgenesis by using the mitochondrially localized jellyfish fluorescent protein gene. FEBS Lett. 487, 248-251 (2000).
- Majumdar, S. S., et al. A method for rapid generation of transgenic animals to evaluate testis genes during sexual maturation. J. Reprod. Immunol. 83, 36-39 (2009).
- Yomogida, K., Yagura, Y., Tadokoro, Y., Nishimune, Y. Dramatic expansion of germinal stem cells by ectopically expressed human glial cell line-derived neurotrophic factor in mouse Sertoli cells. Biol. Reprod. 69, 1303-1307 (2003).
- Ike, A., et al. Transient expression analysis of the mouse ornithine decarboxylase antizyme haploid-specific promoter using in vivo electroporation. FEBS Lett. 559, 159-164 (2004).
- Gonzalez-Gonzalez, E., Lopez-Casas, P. P., Del, M. J. Gene silencing by RNAi in mouse Sertoli cells. Reprod. Biol. Endocrinol. 6, 29 (2008).
- Tang, H., Kung, A., Goldberg, E. Regulation of murine lactate dehydrogenase C (Ldhc) gene expression. Biol. Reprod. 78, 455-461 (2008).
- Yomgogida, K. Mammalian testis: a target of in vivo electroporation. Dev. Growth Differ. 50, 513-515 (2008).
- Hayes, K. E., et al. An Evaluation of Analgesic Regimens for Abdominal Surgery in Mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 6, 18-23 (2000).
