Introduction
Хотя есть много широко используемых методов для генерации умеренной до тяжелой черепно-мозговой травмы (ЧМТ), очень немногие методы были разработаны, чтобы побудить мягкий, закрыты травмы головы у грызунов. В связи с тем, что легкой черепно-мозговая травма (mTBI) в три раза чаще, чем умеренной и тяжелой черепно-мозговой травмой в сочетании 1, надежная модель из mTBI необходимое для содействия научным исследованиям в отношении патофизиологии, нейробиологические и поведенческих результатов, и терапевтических стратегий. Например, частично из-за ограничений текущих моделях животных 2, в последнее десятилетие произошло более 200 удалось клинические испытания лекарственных препаратов для лечения ЧМТ 3. При моделировании системы создаются для трансляционных исследований, применимости результатов зависят от применимости модели реализованы. Для изучения mTBI / сотрясением мозга, надежная модель животного не только имитировать биомеханических сил, которые responность за травмы этиологии, но и вызывают симптомы согласуются с данными по клинически значимых населения. Кроме того, поскольку дети находятся в особенно высоком риске для mTBI, оптимальные системы моделирования будут применяться к молодым и несовершеннолетних грызунов, в дополнение к их взрослых эквивалентов.
Биомеханические анализ обстоятельств, в которых спортсмены понесли mTBIs или Шокирующий травмы головного мозга показывают, что наиболее критические прогностических факторов травмы являются быстрое ускорение головы и воздействия высокой скоростью 4. Большинство моделях грызунов, используемых в настоящее время для индукции TBI позволяют мало или вообще не движение головки 5 (для обзора см 2). Модель описанный здесь обеспечивает воздействие высокой скорости в голову физически безудержного несовершеннолетних крыса, которая сопровождается разворотом на 180 ° и свободного падения, которое применяется ускорения / замедления силы тела и головы пациента. Tвот два основных преимущества, связанные с этой модифицированной методики падение веса для индукции mTBI. Во-первых, модель производит клинически значимых Шокирующий как симптоматики, не вызывая каких-либо явных повреждений мозга (для полного описания поведенческих результатов см 6). Также в соответствии с клиническими докладов после Шокирующий синдром, этот модифицированный метод веса падение производит неоднородные результаты. Хотя эффект от mTBI значительны, есть существенные различия между грызунов, которые испытали mTBI при рассмотрении на нескольких мер результата. Во-вторых, метод позволяет изучать повторяющихся mTBI 7. Поскольку большинство существующих моделей ТПМ нанести такие серьезные повреждения, часто бывает трудно, чтобы вызвать вторую травму, и почти невозможно исследовать повторяющихся TBI без значительного ущерба для всего мозга.
Таким образом, основной Обоснованием для использования в модифицированной методики падение веса для промышлеие из mTBI является создание травмы, которые более тесно представляет патофизиологии и симптоматику сотрясения мозга и повторных ЧМТ в отношении несовершеннолетних населения. С ростом заболеваемости mTBI связанных со спортом, падает, и автомобильных аварий, особенно в детском возрасте, эта уникальная модель грызун mTBI предоставляет исследователям ценным инструментом для изучения Шокирующий-как-мозговой травмы, которые могут быть легко применена к нескольким хита парадигмы.
Protocol
Примечание: Все эксперименты проводились в соответствии с Канадским советом ухода за животными и были одобрены Университета Калгари, Комитета по уходу за животными этике.
1. Разведение и подготовка животных
- Заказать беременных крыс из стандартных поставщиков лабораторных животных, порода щенков в доме в соответствии со стандартными протоколами селекции.
- Дом все животные с свободном доступе к пище и воде, в контролируемой температурой крысы жилья комнаты (21 ° C), что хранится на 12:12 ч свет: темнота цикла.
- Когда щенки достигают послеродовой день 21 (P21), отучить щенка от своих матерей и дома в однополых группах 3 или 4.
2. Настройка легкой черепно-мозговой травмы (mTBI) Аппараты
- До начала процедуры, мельница веса на нужную массы (например, 150 г). Надежно закрепите металлическую петлю к верхнему концу веса позволяет леска быть фантастическиефиксировано к весу.
- Результат оловянной фольги с острым лезвием бритвы. Убедитесь, что забил фольга поддерживает вес тела крыс, но не будет вмешиваться с ускорением крыс после удара головой с весом.
- Лента забил фольга для U-образной этапе из прозрачного пластика (38 х 27 х 27 см 3), который содержит набор губку (38 х 25 х 15 см 3) (рис 1), так что он не будет натянута.
- Поместите U-образный пластиковый этап в правильном положении под направляющей трубы, изготовленной из прозрачного пластика.
- Держите пластиковую направляющую трубку (2,2 см диаметр х 1,5 м) на месте с помощью зажима стенде и установите направляющую трубку так, чтобы она 3,5 см выше забил оловянной фольги.
- Приложить леску через металлическую петлю с весом, обеспечивающим, что в нижней части массы свободно висит 2,5 см выше надреза фольги.
- Надежно закрепите леску в зажим стенда.
ПРИМЕЧАНИЕ: Tethering вес на моллюскар стенд на высоте 2,5 см выше оловянной фольги предотвращает повторное хитов, крыса падает от удара к коллекции губкой). - Потяните вес через пластиковую направляющую трубку с леской и удерживать его на месте с ключевого штифта Ален на 1,0 м.
3. Индукция mTBI
- Когда крысы достигают Р30 перемещения клетки в процедурной комнате.
- Поместите крыс в ИФ камеры и слегка обезболить крысы, пока он не не реагируют на лапу или хвост щепотку.
- Быстро разместить крысы груди вниз на забитый фольгу с ног на голову прямо в пути падающего груза. Смотрите Рисунок 2. Если крыса начинает двигаться или пробуждения, прежде чем он может быть помещен на забитый фольгу, не вернуться к ИФ камеры до не отвечающих на лапу или хвост шнура и начать снова.
- Потяните ключевой штифт Аллен, позволяя вес падать вертикально через пластиковую направляющую трубку и ударить крысу на голове. Thе крыса быстро пройти 180 ° вращение и землю в положении лежа на спине.
- Немедленно снять крысу из коллекции губки и применять актуальные лидокаин к голове крысы ватным наконечником аппликатором.
- Поместите крысу в положении лежа на спине в чистой клетке, которая нагревается путем установки ее на коммерчески доступного грелку.
- Использование секундомера или цифровой таймер приобрести "время-направо". Время-направо будет время, затраченное на крыс, чтобы разбудить от наркоза и флип из лежачем положении в положении лежа или начать ходить.
- Вернуться крысу в исходное клетку после того, как восстановился нормальное поведение (ухаживание, Прогулки, исследуя и т.д.).
- Повторите шаги 3,2-3,8 для каждого дополнительного крысы, требующей mTBI.
- Повторите процедуру на той же крысы в различные моменты времени для повторяющихся экспериментов mTBI.
4. Индукция Шам травмы
- Слегка ANESThetize крысу с ИФ, пока он не не реагируют на лапу или хвост щепотку.
- Быстро разместить крысы груди вниз на забитый фольгу с ног на голову прямо в пути падающего груза.
- Удалить крысу из оловянной фольги, не вытаскивая ключевой штифт Аллен из пластиковой направляющей трубки и применить местное лидокаин в голову крысы ватным наконечником аппликатором.
- Поместите крысу в положении лежа на спине в чистой клетке, которая нагревается путем установки ее на коммерчески доступного грелку.
- Используйте секундомер или цифровой таймер, чтобы приобрести "время-направо".
- Вернуться крысу в исходное клетку после того, как восстановился нормальное поведение (ухаживание, Прогулки, исследуя и т.д.).
5. Проверка mTBI с прогулочный тест Beam 8
- 24 ч после индукции mTBI или фиктивных возврата травмы животных процедурных комнаты.
- Передача крыс чистой холдинговой клеткеи поместить дом-клетки крысы в узком конце 165 см конической луч таким образом, что открытый участок дома-клетки обращена к узкий конец пучка.
ПРИМЕЧАНИЕ: коническая балка длиной 165 см. Центр платформы пучка имеет ширину 6 см на широком конце и 1,75 см на узком конце. Центр пучок имеет выступы (2 см в ширину и 2 см ниже центрального луча), которые обеспечивают безопасность, когда скользит нога крысы. Поместите прокладка пены ниже луча, чтобы снизить риск получения травмы крыс, которые могут выпасть пучка в процессе испытания. - Поместите видеокамеру в широком конце конического пучка и положение / увеличить видеокамеру, чтобы убедиться, что следователь при просмотре видео отчетливо видны движения крыс по всей длине конического пучка.
- Поместите крысу в широком конце конического пучка и поощрять его ходить поперек пучка в исходное клетку. После того, как крыса пересекает коническую луч, оставьте крысу в своем родном клетку, по крайней мере, 60 сек РейNFORCE целевое местоположение. Это Испытание # 1, а не включены в анализ.
- Включите видеокамеру и подождите, крыса, чтобы завершить пучка, идущих Задача 4 дополнительных раз (с сохранением 60 сек периоды подкрепление в вольере). После того, как крыса завершил все испытания, вернуть крысу в исходное клетку.
- Отметить, запишите номер задних ног фут-квитанции, которые происходят и / длительность пересечь луч, для каждого отдельного судебного разбирательства. Использовать эти данные, чтобы вычислить среднее количество задних ног фут-квитанции и времени, чтобы пересечь луч для каждой крысы.
Representative Results
Методика модифицирована веса капли, описанный выше, надежным методом индукции легкой черепно-мозговой травмы (mTBI) в ювенильных крыс. Используя ударный вес 150 г, этот метод был успешно применен для несовершеннолетних крыс, которые варьируются от 50-120 г. Кроме того, процедура может быть легко повторен в тех же животных для изучения повторяющихся mTBI. Хотя животные, которые испытывают выделить, обнаруживают mTBI увеличение времени-направо (рис 3) и появляются ошеломлен после пробуждения, они быстро возобновить нормальную деятельность и визуально неотличимы от ложной ранения животных. Учитывая, что травма легкой, местного лидокаина, который исключает любую боль, связанную с скользящим ударом, является единственным болеутоляющим требуется. Это важно для исследования, как обезболивающие, как известно, мешают типичных воспалительных и восстановительных процессов. Из-за отсутствия явной симптоматики, луч ходьба задачей является надежным, чтобыол, который можно использовать для проверки индукцию mTBI. Важно отметить, что не все животные, которые испытывают mTBI будет демонстрировать дефицит на луч минутах задачей, но как группа, несовершеннолетних крыс с mTBI продемонстрировать значительно более заднюю ногу фут-слипы по сравнению с несовершеннолетними крыс с травмой мнимого (Рисунок 4).
Другой ключевой характеристикой этого модифицированного метода вес-капли несдержанность применяется в колонию для несовершеннолетних крысы во время индукции повреждения. Предоставляя скользящий удар в голову с последующим быстрым вращения ускорения и замедления, эта модель более точно отражает биомеханические силы, приписываемые mTBI и сотрясением мозга. Когда эта процедура применяется к несовершеннолетним крыс или взрослых мышей, смертность очень низкая (7/202 несовершеннолетних животные ~ смертность 3,4%), а перелом черепа и внутричерепного кровотечения исключительно редки 6,7. Кроме того, модель дает клинически значимых SYmptomology. Несовершеннолетние грызуны, которые испытали одну mTBI продемонстрировал дефицит в балансе и моторных поведения, наряду с дефицитом в исполнительной функции, увеличилось депрессивно-как поведение, и изменили социальных взаимодействий 6,9. Точно так же, взрослые мыши также отображать мягкие дефицит баланса и координации, которые восстановить со временем 7. Наконец, индукция mTBI с использованием этой модели требует минимального анестезии и не предполагает хирургического подготовки или закапывания в черепе. Поэтому результаты не искаженных смешанных воспалительных или иммунологических эффектов, вызванных операцией или наркозом. Кроме того, быстрое время восстановления и отсутствие открытых ран позволяет начало дополнительных парадигм тестирования происходит вскоре после грызуны испытывают mTBI.
Рисунок 1: > C Artoon представление U-образный пластиковый этап и сбор губка со всеми соответствующими размерами. Расстояние 10 см должно поддерживаться между губкой сбора и верхней части пластиковой стадии обеспечения несовершеннолетних крыса имеет достаточно времени, чтобы завершить 180 ° вращение.
Рисунок 2: (А) Фотографические представление индукционной травмы платформы. Ювенильный крысу помещают в груди вниз на забитый фольгу так, чтобы голова находится непосредственно под падающим грузом. (B) Вид сбоку индукционной травмы платформы. (С) Фотографические демонстрация веса, используемого в индукции mTBI ,
загрузить / 51820 / 51820fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 3: Графическое представление средние различия во времени-направо между несовершеннолетними крыс, которые испытали одну mTBI и несовершеннолетних крыс, которые испытали травмы фиктивный (* р <0,01) крыс, которые получили, обнаруживают mTBI значительное увеличение. Продолжительность времени, необходимого, чтобы исправить себя от лежачем положении.
Рисунок 4: Графическое представление среднего числа задних ног фут-квитанции выставляются на движущейся задачи пучка несовершеннолетних крыс, которые испытали одну mTBI и несовершеннолетних крыс, которые испытали травмы фиктивный (* р <0,05).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Brass Weights | Ginsberg Scientific | 7-2500-2 | Need to have metal loop attached to base |
| Alluminum Foil | Alcan | Available at most grocery stores | |
| Masking Tape | Commercially available | ||
| U-Shaped Plastic Stand | Constructed by Laboratory | ||
| Clamp Stand | Sigma-Aldrich | Z190357 | |
| Plastic Guide Tube | Could be constructed or purchased at a hardware store | ||
| Fishing Line | Angler 10lb | Purchased from a sporting goods retailer | |
| Isoflurane | Pharmaceutical Partners of Canada | DIN 02237518 | Inhalation Anesthetic |
| Topical Lidocaine (30ml) | Astra Zeneca | DIN 0001694 | Xylocaine Jelly 2% |
| Cotton Swabs | Commercially available | ||
| Heating Pad - 3 heat setting | Commercially available | ||
| Stop Watch | Sportline | L303 | Purchased from a sporting goods retailer |
| Video Camera | Sony | HDR-CX260V | |
| Sprague Dawley Rats | Charles River Laboratories | SAS SD 40 | Male and females ordered from Charles River Laboratories and pups bred in-house |
| Balance Beam | Constructed by Laboratory |
References
- DeWitt, D., Perez-Polo, R., Hulsebosch, C., Dash, P., Robertson, C. Challenges in the development of rodent models of mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 30, 688-701 (2013).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Zhang, Z., Lerner, S., Kobiessy, F., Hayes, R., Wang, K. Systems biology and the anostic approach to drug discovery and development to treat traumatic brain injury. Systems Biology in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Yan, Q. , Springer Science. Forthcoming.
- Viano, D., Casson, I., Pellmen, E. Concussion in profession football: Biomechanics of the struck player - Part 14. Neurosurgery. 61, 313-327 (2007).
- Marmarou, A., et al. A new model of diffuse brain injury in rats: Part 1 - Pathophysiology and biomechanics. Journal of Neurosurgery. 80, 291-300 (1994).
- Mychasiuk, R., Farran, A., Esser, M. J. Assessment of an experimental rodent model of pediatric mild traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 31 (8), (2014).
- Kane, M., et al. A mouse model of human repetitive mild traumatic brain injury. Journal of Neuroscience Methods. 203, 41-49 (2012).
- Schallert, T., Woodlee, M., Fleming, S. Disentangling multiple types of recovery from brain injury. Pharmacology of Cerebral Ischemia. Krieglstein, J., Klumpp, S. , Medpharm Scientific Publishers. Stuttgart. (2002).
- Mychasiuk, R., Hehar, H., Farran, A., Esser, M. J. Mean Girls: Sex differences in the effects of mild traumatic brain injury on the social dynamics of juvenile rat play behaviour. Behavioural Brain Research. 259, (2014).
- Centers for Disease Control and Prevention. Report to congress on mild traumatic brain injury in the United States: Steps to prevent a serious public health problem. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA. 1-47 (2003).
