Protocol
1. Preparación de muestras
- Obtener muestras que contienen luciferasa que expresa el virus (en el presente documento VSVΔ51-Fluc como ejemplo) para la titulación y la transferencia en placas de 96 pocillos. Alternativamente, realizar infecciones en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos y sobrenadantes de uso directamente.
- Deja dos columnas no tratados para la inclusión de las curvas de calibración. Para experimentos realizados directamente en placas de 96 pocillos, título al final del experimento (40 horas después de la infección) o almacenar a -80 ° C y el título en una fecha posterior.
2 Preparación de células permisivas para la titulación del virus
- 24 horas antes de la titulación, preparar una suspensión de células Vero a una concentración de 2,5 x 10 5 células / ml en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía 10% de suero fetal bovino (FBS), 30 mM HEPES, y 1% de penicilina / estreptomicina. NOTA: Aunque este protocolo utiliza células Vero, cualquier línea celular permisiva adecuado para la infección por VEV podría abe utiliza.
- Seed 2.5 x 10 4 células (100 l) en sólidas placas de fondo plano de 96 pocillos blancos usando un dispensador de microplacas.
- Preparar 12 ml de suspensión de células por placa, además de 5 ml para el cebado.
- Clean microplaca dispensador de casete mediante el lavado del tubo con 50 ml de agua estéril.
- Llenar las líneas dispensador de microplacas con suspensión de células y dejar 5 ml de suspensión de células fluyen a través.
- Seleccionar un programa que prescindir de 100 l en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de paredes blancas. Dispense, y repetir según sea necesario para las placas adicionales. También sembrar unos pozos en una placa de fondo plano de 96 pocillos claro si las placas de paredes blancas opacas inferior se utilizan para la verificación de la salud celular y la densidad.
- Cuando haya terminado, las células ras de espalda en el recipiente original. Limpiar el casete mediante la ejecución de 50 ml de etanol al 70% seguido de 50 ml de agua estéril caliente a través de la tubería.
- Asegúrese de cassette y tubo son apcuadamente limpiada entre usos.
- Se incuban las células durante 24 horas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora.
3. Preparación de la curva estándar Viral
- Preparar una curva estándar de VSVΔ51-Fluc en DMEM libre de suero tal que la concentración final de unidades formadoras de placa (pfu) por ml después de la transferencia en células Vero es la siguiente: 10 8 pfu / ml, 10 7 pfu / ml, 10 6 pfu / ml, 10 5 pfu / ml, 10 4 pfu / ml, 10 3 pfu / ml, 10 2 pfu / ml, y 10 1 pfu / ml. Preparar 50 l de cada concentración por placa de células Vero, más un 10% adicional.
NOTA: título del stock de virus luciferasa tendrá que ser evaluado de una manera clásica 10 con el fin de generar una curva estándar que permita una cuantificación absoluta. De lo contrario, la cuantificación relativa se puede lograr sin información precisa título estableciendo arbitrariamente título viral basaen pasos de dilución. Por ejemplo, la primera dilución de la curva estándar se puede establecer en 10 8 unidades virales y la dilución 1/10 a 10 7 siguiente y así sucesivamente. En este contexto, se debe expresar valores como el cambio veces en comparación con una muestra pre-determinado como la cuantificación absoluta no será exacta.
4. Transferencia de sobrenadantes de ejemplo en células permisivas
- Compruebe células Vero en placas en la placa de 96 pocillos de fondo claro con bajo un microscopio de luz para confirmar que las monocapas son al menos el 95% de confluencia.
- Transferir 25 l de muestra de sobrenadante sobre células Vero sembradas en placas de paredes blancas. No transfiera sobrenadantes en las 2 columnas designadas para las curvas de calibración. NOTA: Esto se puede hacer de forma simultánea para todos los pozos en una sola placa usando un manipulador de líquidos de 96 canales.
- Uso de una pipeta multicanal de 8 o 12 canales, añadir 25 l de cada dilución de la curva estándar preparada en la Etapa 3 a las células Vero enlas 2 columnas designadas.
- Centrifugar las placas durante 5 minutos a 430 xg a TA.
- Incubar durante 5 horas a 37 ° C en un humidificado 5% de CO 2 incubadora.
5. Evaluación de la viabilidad de la célula
- NOTA: Cuando a partir de los sobrenadantes obtenidos a partir de experimentos de infección realizados en placas de 96 pocillos claros, la viabilidad de la muestra se puede evaluar antes de la cuantificación con un colorante indicador de viabilidad celular, tales como resazurina.
- Añadir resazurina en una cantidad igual al 10% del volumen en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de muestras que contienen virus y células. Incluir celular sólo controla así como el control de sólo los medios de comunicación para determinar los valores de 100% y 0% de viabilidad, respectivamente.
- Después de 2-4 horas (tiempo de incubación variarán dependiendo del tipo celular y de la concentración de polvo del colorante disponible comercialmente o reconstituida), leer y grabar la señal usando un lector de placas de fluorescencia (530-560 de excitación, 590 de emisión). Informe viabili celularTy para una muestra de acuerdo a la fórmula relativa Actividad Metabólica = ((señal de muestra de prueba - señal de control negativo) / (célula única señal de control - señal de control negativo)) x 100%
6. Preparación del sustrato luciferina
- 30 min antes del final de la incubación de 5 h, preparar la luciferina para obtener una solución / ml 2 mg en solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS). Preparar 2,5 ml por placa, más un extra de 2 ml. Proteja la solución de la luz. NOTA: La luciferina también se puede preparar antes en el día y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
7. Reading bioluminiscencia
- Después del período de incubación de 5 h, se añaden 25 l de luciferina a cada pocillo de células Vero en las placas de sólido blanco. Añadir luciferina de forma manual o con un dispensador automático integrado en el luminómetro. NOTA: El uso de un instrumento con sólo un único punto y final lee puede requerir la adición de una luciferasa buf lisis compatiblefer antes de añadir el sustrato luciferina para mejorar la consistencia.
- Leer las placas con los siguientes parámetros:
- Agitar durante 5 seg.
- Espere 30 seg.
- Leer luminiscencia a un valor apropiado de sensibilidad / exposición fija. Si la opción está disponible en el instrumento, utilice múltiples puntos lee (por ejemplo, 3 x 3 de la matriz) para mejorar la precisión.
- Grabar y guardar la intensidad bioluminiscente cuantificado.
- Si se utilizó un dispensador automático para agregar luciferina purgar la luciferina y cebar las líneas con agua estéril tibia.
Análisis de datos 8.
- Para obtener resultados precisos, resolver la regresión no lineal para generar una ecuación de Hill partir de las curvas estándar. Aplicar esta ecuación para las muestras tituladas para calcular unidades de expresión virales. Algunos virus o situaciones pueden producir una curva estándar con una relación lineal; en este caso, para resolver una ecuación lineal.
Representative Results
Un resumen del flujo de trabajo que describe el método de alto rendimiento se ilustra en la Figura 1. Figura 2 muestra los resultados de una curva estándar típica ofVSVΔ51-Fluc. De cuatro parámetros análisis de regresión no lineal genera una parcela colina desde la que desconocido pfu de entrada (estimación de la titulación viral) se puede interpolar. Estos títulos estimados se denominan unidades de expresión virales (VEU). Figura 3A muestra Veus y los títulos obtenidos mediante la realización de un ensayo de placa estándar con las mismas muestras 10. Las muestras procedían de un experimento en el que se utilizaron diversos productos químicos para mejorar la replicación y propagación de VSVΔ51-Fluc en 786-0 células. Veus interpolados a partir de la curva estándar debe ser multiplicado por un factor que se basa en la dilución de los sobrenadantes de la muestra que se transfiere a las células Vero (en este caso, el factor de dilución es 5). La correlación lineal entre los títulos y VEU se muestra en la Figura 3B 2 de 0,8083 y la puntuación r de Pearson de 0,899 (p <0,0001). En la Figura 4, los datos de citotoxicidad celular típicos obtenidos a partir de un ensayo metabólico se muestra para 786-0 células tratadas con productos químicos antes de la infección con VSVΔ51-Fluc. Finalmente, la Figura 5 muestra curvas típicas estándar obtenidos con diversos virus (virus del herpes simple (HSV), virus vaccinia, y virus adeno-asociado (AAV), todos expresar luciferasa de luciérnaga) y describe tiempos de incubación y los ciclos de congelación-descongelación, según se requiera.
Figura 1 Flujo de trabajo de titulación de virus de alto rendimiento y ensayo de citotoxicidad usando VSV Δ 51-Fluc. (A) Seed 2,5 x 10 4 células Vero por pocillo (100 l) y se incuba a 37 ° C. (B) 24horas más tarde la transferencia de 25 l de curva estándar en que las células Vero (2 columnas por placa). (C) Transferencia de 25 l de muestras que se tituló a células Vero restantes. Placas de centrífuga y se incuban a 37 ° C. (D) en una cantidad igual al 10% del volumen en el pozo, añadir reactivo resazurina a la placa que contiene las muestras originales. Incubar las placas a 37 ° C. (E) Después de 3 horas, leer y registrar la fluorescencia y evaluar la citotoxicidad. (F) Después de 5 horas, se añaden 25 l de solución de 2 mg / ml de luciferina a cada pocillo de células Vero. Leer la luminiscencia y calcular unidades de expresión viral.
Figura 2. esperada curva estándar de VSV Δ 51-Fluc. Expresión de luciferasa era yoasured 5 hr post transferencia sobrenadante en cinco puntos diferentes dentro de un pocillo utilizando un luminómetro y la bioluminiscencia se expresó en unidades relativas de luz (RLU promedio). La media de RLU se representó frente de entrada conocida pfu / ml para resolver la regresión no lineal y generar una ecuación de Hill. El promedio de dos curvas en paralelo y barras de error estándar se muestra (r 2 = 0.9993).
Figura 3 Comparación de los títulos de ensayo de placa estándar con los obtenidos por el método de alto rendimiento. (A) Los títulos virales en pfu / ml obtenida por ensayo de placa estándar en células Vero se compararon con los títulos virales calculados (VEU / ml) de las mismas muestras tituladas utilizando el ensayo de luciferasa de alto rendimiento. (B) relación lineal entre VEU / ml y el título obtenerse a través de p estándarensayo laque. Se muestran curva de regresión lineal y el coeficiente de determinación (R 2).
Viabilidad de la muestra antes de la transferencia sobrenadante sobre células Vero se determinó mediante la evaluación de la actividad metabólica celular utilizando una solución de resazurina disponible comercialmente Figura 4 Muestra viabilidad.. Valores de fluorescencia primas se normalizaron a la de los pozos no tratados, no infectados.
Figura 5. esperado curvas estándar con HSV, vaccinia, y virus de AAV. La expresión de luciferasa se midió en cinco puntos diferentes dentro de un pocillo utilizando un luminómetro y la bioluminiscencia se expresó en rela mediastivas unidades de luz (RLU). (A) curva estándar HSV se añadió a las células Vero plateado 24 horas antes a una densidad de 2,5 x 10 4 células por pocillo (100 l) y la medición de la luciferasa se realizó 17 h después de la transferencia sobrenadante (R 2 = 0,9489, n = 1). Una ecuación de Hill fue generado mediante la resolución de la regresión no lineal. Curva estándar (B) Vaccinia se añadió a las células Vero chapado 24 hr antes una densidad de 2,5 x 10 4 células por pocillo (100 l) y se incubaron durante 2,5 horas a 37 ° C, después de lo cual se tomaron mediciones de luciferasa (R 2 = 0,9892). Una ecuación lineal fue generada por resolver para la regresión lineal. (C) de AAV curva estándar se añadió a las células de carcinoma de pulmón humano (A549) chapado en 24 horas antes a una densidad de 2,5 x 10 4 células por pocillo (100 l) y la medición de la luciferasa se hizo 24 horas después de la infección. Una ecuación de Hill fue generado mediante la resolución de la regresión no lineal. El promediode se muestran cinco curvas en paralelo y barras de error estándar (R 2 = 0.9926).
Discussion
El enfoque basado en la luciferasa descrito aquí ofrece un número de ventajas sobre otros métodos existentes incluyendo su facilidad, rapidez, mínima necesidad de equipo, y relativamente bajo costo. Un elemento clave para esto es la evitación de un paso de dilución en serie. Sin embargo, los derivados basados en dilución de serie de este protocolo son ciertamente factible y se usaron recientemente para evaluar los títulos de Ébola luciferase-expresando en una pantalla antiviral de alto rendimiento 11. Mientras inherentemente más lento y más caro, estas adaptaciones pueden proporcionar un mayor rango dinámico para la cuantificación viral cuando es necesario. Además de ser particularmente adecuado para la evaluación de los títulos virales en el contexto de las pantallas de alto rendimiento, nuestro método de cuantificación viral basado en un solo paso de la luciferasa genera estimaciones precisas de viriones infecciosos en el caso de la replicación de los virus. Además, las lecturas de luminiscencia junto con los datos de citotoxicidad del mismo experimento dan una másimagen completa del efecto de las condiciones experimentales en las células diana, que es particularmente útil en el contexto de los virus oncolíticos y pantallas de drogas.
El ejemplo ilustrado aquí utiliza un virus de ARN de una sola hebra negativa en replicación; Sin embargo, este protocolo se puede adaptar a un número de replicar y no replicante virus con unos pocos ajustes menores de protocolo. Esto incluye virus de ADN tales como vaccinia, HSV, y AAV (véase la Figura 5). Las muestras infectadas con virus intracelulares, tales como virus de la vacuna, por ejemplo, requieren un paso de liberación de virus antes de la cuantificación (por ejemplo, al menos un ciclo de congelación-descongelación). Cuando se aplica esta técnica a otros virus, es necesario para optimizar el tiempo de incubación de la transferencia del sobrenadante viral o lisado a la lectura de las placas por el luminómetro. Este parámetro dependerá principalmente en el ciclo de replicación del virus en la línea celular permisiva y la fuerza de la promoter conducir la expresión de luciferasa. Esto se hace mejor mediante el uso de la curva estándar completo en la etapa de optimización. Para hacer esto, uno debe infectar la línea celular permisiva apropiado con varios repeticiones de la curva estándar preparada y leer cada repetición en un momento en diferentes puntos después de la transferencia. Idealmente, se elige un punto de tiempo de incubación que conduce a una relación lineal entre log (RLU) y log (título) que abarca el rango de la muestra título esperado. Para VSVΔ51-Fluc, esto es típicamente de 10 4 pfu / ml -10 7 pfu / ml durante un tiempo de incubación de 5 h. Si se espera que los títulos más bajos o más altos a partir de muestras, uno puede simplemente aumentar o reducir el tiempo de incubación, respectivamente. Alternativamente, las muestras pueden ser diluidas a caer dentro de la gama mucho como se hace normalmente para ELISA.
Como se mencionó anteriormente, este método es muy adecuado para realizar pantallas de alto rendimiento de medicamentos utilizando bibliotecas de drogas como la mayoría de los pasos se pueden automatizar. Las células se pueden sembrar efficiently usando un dispensador de microplacas automatizado, la biblioteca de fármacos se puede añadir usando un manipulador de líquidos de 96 canales, el virus se puede añadir usando un dispensador de microplacas y placas de leer usando un luminómetro automatizado. En teoría, esto también se puede adaptar a 384 pocillos o formatos más pequeños; Sin embargo, la limitación a este fin es el número de células que pueden sembrarse, menos células dadas conduce a un rango más estrecho en la linealidad de la LOG (RLU) a LOG (título) relación. Finalmente, la evaluación de la viabilidad celular usando la resazurina o otros colorantes metabólicos se puede incorporar fácilmente en el flujo de trabajo, lo que permite la discriminación de compuestos citotóxicos en las pantallas de antivirales o la identificación de compuestos que conducen a la muerte sinérgica en combinación con virus 12. Sin embargo, las limitaciones de este método incluyen el requisito de un virus transgén que expresa luciferasa, que no siempre es posible, y la disponibilidad de una línea celular permisiva suficientemente. Sin embargo, es probable posible adaptarel método para su uso con otros genes informadores (por ejemplo, GFP) proporcionó el método de cuantificación reportero tiene una linealidad adecuado y relación señal a ruido. En general, el método de alto rendimiento descrito puede ser modificado para adaptarse a muchos virus diferentes y adaptarse a diversas aplicaciones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbeccos' Modified Eagle's Medium (DMEM) | Corning | SH30243.01 | |
| Fetal bovine serum | NorthBio Inc. | NBSF-701 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | Prepare a 1 mM solution, pH 7.3 |
| alamarBlue | AbD Serotec | BUF012B | |
| D-Luciferin potassium salt | Biotium | 10101-2 | |
| 96-well solid white flat bottom polystyrene TC-treated microplates | Corning | 3917 | 384-well plates can also be used for higher throughput |
| Synergy Mx | BioTek | SMTBL | Monochromator microplate reader |
| Liquidator96 | Mettler Toledo | LIQ-96-200 | 96 tip manual pipetting system |
| Liquidator96 LTS Tips sterilized with filters | Mettler Toledo | LQR-200F | Any sterile filtered tips compatible with pipettors of choice are appropriate |
| Microflo | BioTek | 111-206-21 | Used to plate cells in a 96-well plate |
| Fluoroskan Ascent FL | Thermo Scientific | 5210450 | Microplate fluorometer |
References
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