Summary
泪腺（LG电子）是一家生产所必需的眼泪水成分对维持视力和眼睛健康的分支机关。在这里，我们描述了小鼠LG解剖和体外培养技术破译的信号参与了LG的发展道路。
Abstract
泪腺（LG）的分泌所必需的维持角膜的结构和功能，一个透明组织为视力必不可少水性眼泪。在人单LG驻留在上面的每个眼睛通过3输送泪到眼表面的侧端的轨道 - 5管道。该鼠标有三对大眼腺，研究得最多的，其中是exorbital泪腺（LG电子）位于前部和腹侧的耳朵。类似于其他腺体器官，LG的发展，通过上皮分支形态，其中内稠间质单个上皮芽经历多轮芽和管形成的，以形成分泌腺泡和导管的一个复杂的互连网络的过程。这个复杂的过程已经在文献中许多其它上皮器官如胰腺，唾液腺。不过，LG一直不太探索和形态控制的机制是不好下站了起来。我们怀疑这代表性不足作为一个模型系统是与发现，解剖和培养了LG的困难造成的。因此，在这里我们描述和解剖技术收获胚胎和产后LG为组织的体外培养方法。
Introduction
泪腺（LG）是负责水性泪液分泌为视力和健康，维护和保护眼睛表面的细胞是至关重要的。 LG的功能障碍的结果中最常见的和衰弱的眼部疾病之一：水缺乏干眼疾病，其特点是由眼部刺激，光敏感性和视力下降1。在人对LG驻留在轨道上方的眼睛的侧端，其中3 - 5排泄管道存款泪到眼表面。鼠标有三对大眼腺体，研究最多的，其中是泪腺（LG）位于前部和腹侧耳（exorbital）流着泪，通过一个单一的排泄管行驶到眼睛。类似于其他腺体器官，对LG通过上皮分支形态发生的过程，其中内稠间质单个上皮芽经历多轮芽和管道形成为开发米分泌腺泡和导管的复杂互连网络（ 图1）2。在开发过程中的上皮细胞成为血管化以及大量从颈上神经节3支配由翼腭神经节的副交感神经，并在较小程度上是由交感神经。这些细胞类型，即神经元细胞，上皮细胞，内皮细胞和间充质细胞之间的相互作用，是必不可少的功能和维持成人组织中。然而，协调LG的发育和再生以及如何小区间型通信引导这些过程的分子机制仍不清楚。
胚胎体外培养技术的出现，使发育和再生途径中的多个分支机关4鉴定。培养体外使研究人员操纵机构（我的能力械，遗传或化学的）所定义的条件下，以及表征实时器官发育和细胞 - 细胞相互作用。鼠标的exorbital LG非常适合于这种技术，最近的研究已经定义了信令规范其发展2.5系统。然而，尽管有必要了解分子线索支撑LG的发育和再生，但目前仍然是充分研究，很有可能是由于在分离的器官的技术困难。在本文中，我们将介绍如何隔离并进行胚胎小鼠LG的体外培养，以明确的发展计划。
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Protocol
在严格按照指南中的美国国立卫生研究院实验动物的护理和使用的建议进行的所有动物的工作。该协议被批准的机构动物护理和使用委员会加州大学（IACUC），旧金山。
1.小鼠胚胎泪腺（LG）：收获和显微切割
- 继批准的机构动物科学研究伦理委员会的程序，安乐死定时怀孕的CD-1（或转基因）的女性不断上升的二氧化碳吸入，然后确认颈椎脱位收获胚胎在适当的胚胎一天。指定阴道栓发现E0的一天。
注：泪腺（LG的），可以从E14单芽阶段开始有所收获。然而，E16（5 - 10芽）胚胎给出最一致的结果用于离体培养。 - 消毒V用70％乙醇鼠标entral侧。捏皮肤做一个切口处用无菌手术剪中线;切割穿过皮肤和腹膜，以暴露腹腔。通过在每个子宫角，并装在冷的PBS（磷酸盐缓冲盐水）或DMEM F12培养基的顶部添加有100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素沿系膜及切割除去2子宫角。
- 使用镊子（＃5）中，从羊膜囊取出胚，并放置到装有冷PBS的第二无菌培养皿。小心不要碰到眼睛或头部区域。
- 将胚胎到解剖显微镜与透射基地。如果胚胎是<E17，执行步骤1.5 - 1.7。如果胚胎> e17的，这些步骤可能是有益的，但不是必需的，因此继续执行步骤1.8。
- 从正下方的下颌骨的躯干（步骤1， 图2），使用设切断头GA无菌手术刀（＃10刀片）。转动头部，使下颌骨，现在在解剖板。使用镊子，以稳定磁头和解剖刀除去约脑（第2步，第1次切割， 图2）的背侧的四分之一-这是一次软骨周围E15变硬尤其重要。
- 定向的头部，使得所述手术刀可穿透两眼之间的鼻子。使一个切口穿过头部的中心，使眼睛现在是在单独的半部（第2步，第2切口， 图2）。
- 使用两个＃5镊子，取一半的头部和去除多余的组织（参见步骤3， 图2）。一定要定向的头部，以便对LG（位于眼球的下后角部）未在该去除过程中丢失。除去过量的脑，软骨和周围的鼻组织和眼睛下方。由于腺是勉强可见，在这一点上，确保眼睛后多余的组织去除t被适当地取向Ø避免丢失LG的位置。
- 认真抓住从后，眼睛既钳底角的皮肤。小心拉开与镊子，露出LG去除皮肤。使用上面和下面的组织额外的照明，以帮助可视化的LG。
注：LG，区分其外观上在一个黑暗的，浓缩的间充质管道芽，应该是可见的，在这一点上。 - 开始仔细剖析了LG和相关的间充质（参见图和图像）离周围组织使用镊子，小心不要抢LG或与其相关的管道。一旦腺是免费从周围组织中，轻轻握住眼睛周围对LG管道的基本上皮删除整个腺。小心维持周围的上皮，其中可以观察到作为稠间质成上皮invaginates间质。
注：某些附加的去除Tissu酒店的E（任意小骨碎片，肌肉和结缔组织）可能是必要的，以避免来自相邻组织的信令/生长因子。 - 对于文化，收获4 - 5腺体和每盘相关的间质（LG的立即解剖后镀）;收集至少每100微升用于RT-PCR 6的RNA裂解缓冲液14的腺体。
2.准备板的体外培养
这个过程是基于所采用的显影唾液腺7,8。
- 添加200μl的DMEM F12（补充有100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素）的培养基，用50微克/毫升抗坏血酸和50μg/ ml的全息转到玻璃底直径50mm的微孔盘7。
注：DMEM F12被选为我们以前发现它最大限度形态在胚胎唾液腺。 - 浮13毫米polycarb苷的膜滤器用0.1微米的孔上的媒体之上。
- 可选步骤：稀释的3-D层粘连蛋白的1：1的DMEM / F12，使为3mg / ml的终浓度（用200μl的移液管轻轻混匀;离心1分钟，如果出现气泡）。加入15微升的此稀释的3-D层粘连蛋白进行筛选。
注意：此稀释液被认为是最佳的用于保持LG在其三维状态而不影响上皮分支。然而，这不是对于LG的培养是必不可少的。 - 将4 - 5 LG到过滤器或成层粘连蛋白。培养LG的离体 24 - 48小时（ 图3）或用4％PFA中20分钟，以供进一步分析通过定量PCR或免疫染色（ 图4）固定。对于胚胎腺体组织的定量PCR分析，请参阅Rebustini 等人，2011。对于胚胎腺体组织的免疫荧光分析，请参考下面的引用：霍夫曼等人，（2002）和Steinberg 即吨人，（2005）。
3.鼠标产后和成人泪腺（LG）：解剖
- 根据适当的动物伦理委员会的标准安乐死产后鼠标。对于幼崽出生后第8天或以下，通过切割头，用无菌剪刀安乐死。对于8岁以上日龄，毛皮喷用70％乙醇。
- 要找到LG，奠定鼠标横向解剖显微镜下，一边与照明上面。注意：产后和成人的LG是由颈总动脉，咬肌和真皮（参见图5）接壤。
- 使用小解剖剪，使小切口在表皮横向从那里对LG应设。
- 使用镊子，拉开表皮朝耳朵暴露了LG。
- 使用镊子从周围组织中轻轻松开LG。
- 一旦LG从周围组织中释放出来，小心地取出LG的管道，通过抓握，其中所述管道和眼睛周围的上皮细胞连接（ 图1）。
- 放置连锁群中用于RT-PCR的RNA裂解缓冲液中，或用4％PFA中20分钟进行免疫染色确定。
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Representative Results
LG的发展，通过上皮分支形态发生的过程。解剖在E14，E15，E16，E17，和P2 LG的胚胎的明图片说明此事件。
图1. LG开发通过上皮分支形态的过程。胚胎LG的新鲜切开的E14，E15，E16，E17和P2的明场图像。 请点击这里查看该图的放大版本。
注意，作为上皮细胞的大小增加时，间充质的量减少。实验步骤对胚胎连锁群的显微描绘于图2中 。
图2.原理图，从小鼠胚胎参与LG显微切割的步骤。解剖，并从老鼠胚胎中去除LG的示意图。 请点击这里查看该图的放大版本。
对于LG的文化，我们经常使用，由于在体外生长的一致性E16胚胎。如示于图3中 ，LG在体外以类似的方式对体内腺培养条件培养（比较图1）。
图3. 防爆E16 LG的体内培养概括在体内的形态。E16 LG的来源于Pax6的-Cre重组酶，GFP的胚胎，其中绿色荧光蛋白是由上皮细胞表达的。连续的荧光图像拍摄这个单一腺体0，3，6，12，24，和48小时。 请点击这里查看该图的放大版本。
在这里，我们采用的Pax6-Cre重组酶，绿色荧光蛋白（也叫乐Cre重组5）胚胎突出上皮细胞，使我们能够采取的分支上皮细胞的连续荧光图像在48小时培养期。小鼠窝藏Pax6的Cre重组，GFP的转基因可以从JAX获得：Tg的（Pax6的Cre重组，GFP）的1Pgr但不是必需的腺解剖和培养。
培养或新鲜解剖LG就可以固定免疫荧光分析。 图4秒怎么样了4个细胞区室，间质，上皮细胞（EpCAM的），神经（TUBB3）和血管（PECAM），在E16 LG的从野生型（CD1）胚胎的可视化。
图4. LG是由多种细胞类型，包括上皮细胞，神经细胞和内皮细胞，LG E16是免疫染色上皮细胞（EpCAM的，绿），神经元（TUBB3，红色）和内皮细胞（PECAM，青色）， 请点击这里查看该图的放大版本。
对于新鲜解剖组织很容易第一嵌入LG在层粘连蛋白，如做了培养，以便固定所述压盖用于固定和随后的处理， 图5示出了示意对于产后/成人LG解剖。
图5.原理图涉及从产后和成年小鼠LG显微切割的步骤。解剖和去除的LG无论从产后或成年小鼠的示意图。一个Pax6的-Cre重组酶，GFP产后第30天小鼠用于可视化的LG和相关管道的位置。 请点击这里查看该图的放大版本。
产后/成人LG的地位已经显现利用Pax6的-Cre重组酶，GFP鼠标。
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Discussion
多功能性文化和操纵LG 体外为研究其发展显著的优势。这包括在哪个速度研究者能够验证假设和许多可被执行，以评估上皮细胞，神经细胞，内皮细胞和mesencyhmal细胞相互作用以形成器官扰动。但是，使用这种模式时，有一些需要注意的地方。首先，由于其隔离的腺不再连接到外围血管或神经系统，这可能会影响信号转导途径被测试，如果他们在协同工作与由神经或血管9,10-传递信号。二，周围的非LG的组织可以提供调节LG开发4个因素。为了避免这种情况的其他非间充质组织的组件之前必须培养除去。第三，目前我们无法提供必要条件完全cytodifferentiation成一个完全功能性组织。这是对所有器官离体培养的情况下，并可能是由于多种原因，包括缺乏功能性的血管和神经和/或机械力从周围组织。尽管有这些警告，发现在体外培养机制已证明是概括在随后的体内实验，使之成为一个强大的系统，用于测试新的假设8,11。
它已经显示，发育和再生途径显著重叠，表明体外培养系统也可以用于研究器官再生12。虽然我们还没有证实这方面这里我们和其他人先前已经显示了胚胎唾液腺可以被用来建模治疗辐射对器官损伤及再生13的影响。还需要进一步的研究，探索利用LG 体外系统作为一款型号为组织再生。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者要感谢由加州大学旧金山分校的资源分配计划提供了资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 without HEPES | SH3027101 | Thermo Scientific | |
| Penicillin-Streptomycin | P0781 | Sigma-Aldrich | |
| Albumin solution from bovine serum | A9576 | Sigma-Aldrich | |
| Paraformaldehyde 16% Solution | 15710 | Electron Microscopy Sciences | Diluted to 4% in 1x PBS |
| Phosphate Buffered Saline 10x | BP665-1 | Fisher Scientific | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Prepared from 10x stock | ||
| holo-Transferrin bovine | T1283 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| L-ascorbic acid (Vitamin C) | A4544 | Sigma-Aldrich | 25 mg/ml stock solution in water. Freeze single-use aliquots at -20 °C. Add to DMEM/F12 media to a final concentration of 50 μg/ml. |
| BioLite 100 mm Tissue Culture Treated Dishes | 130182 | Thermo Scientific | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| Stereo Microscope with substage iluminator | Stemi 2000 | Carl Zeiss | Any stereo dissecting microscope can be used that has a transmitted light base. |
| Substage Illuminator Base for Stereo Microscope | TLB 4000 | Diagnostics Instruments, Inc. | |
| Falcon 35 mm Tissue Culture Treated Dishes | 353001 | Corning | Non-tissue culture-treated plates can also be used. |
| 50 mm uncoated glass bottom dishes | P50G-1.5-14-F | MatTek Corporation | |
| Widefield fluorescence microscope | Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | Any fluorescence microscope (upright, inverted or stereo dissecting microscope) can be used to monitor GFP expression at low magnification with an attached digital camera. |
| Confocal Microscope | TCS SP5 | Leica Microsystems | Confocal microscopy is necessary to see detailed cell structures. Any confocal microscope can be used. |
| SWISS Micro-Fine Forceps, #5 (11.2 cm) | 17-305X | Integra LifeSciences Corporation | Fine tips are required for removing mesenchyme from epithelium. Tungsten needles can also be used. |
| Dumont Standard Tip Forceps, #5 (11 cm) | 91150-20 | Fine Science Tools (USA), Inc. | Ideal for harvesting glands from embryos. |
| Reusable Plastic Surgical Knife Handles, style no. 3. | 4-30 | Integra LifeSciences Corporation | |
| Stainless Steel Sterile Surgical Blades, no. 10 | 4-310 | Integra LifeSciences Corporation | |
| RNAqueous-Micro Total RNA Isolation Kit | AM1931 | Life Technologies | |
| Cultrex 3D Culture Matrix Laminin I | 3446-005-01 | Trevigen | 6 mg/ml stock diluted 1:1 with DMEM/F12 |
| Timed-pregnant Crl:CD1(ICR) mice | Charles River Labs | Embryos are harvested on day 14 (with day of plug discovery designated as day 0). | |
| Nucleopore Track-Etched Hydrophilic Membranes, 0.1 μm pore size, 13 mm | 110405 | Whatman | |
| Timed-pregnant Pax6-Cre, GFP mice | Tg(Pax-Cre, GFP)1Pgr | The Jackson Laboratory | Optional mice for learning how to locate the LG. |
References
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