Introduction
そこにペアリングおよび組織ororganで病変が身体の自由を奪うことと、いくつかのケースでは、致命的なことができるので、医学のthemain目的のtissuesis 1の再生。コンテキストでは、医療従事者や研究者は常に損傷組織のそこペア再生プロセスを促進する新たな治療alternativestoを提供するために、技術、方法およびツールを探している。この細胞系統により、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉に分化するその潜在的に、組織再生プロセスを研究するための理想的なモデルを表しているので、したがって、生物医学科学は、間葉系幹細胞（MSC）、特に成体幹細胞の研究に集中している細胞系統は、しかし、MSCSを現実に治療を行うために、MSCのthetherapeutic可能性の特徴付けは生体材料と宿主組織にMSCの目的の動作を保証するものでは細胞の足場を使用して、新しい細胞培養技術の実装を添付しなければならない。
Protocol
本研究は、人間が関与する研究の倫理的な行動に関するヘルシンキの世界医師会の宣言に従って行われたとFacultadデ食事と、UNAM（プロジェクト番号101から2012）の研究倫理委員会によって承認された。
ヒト間葉系幹細胞の単離
- 試薬の調製
- リン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調製し、1％抗生物質 - 抗真菌溶液を補充する。
- ダルベッコ改変イーグル培地、高グルコース（HG-DMEM）を調製し、0.2μmのフィルターを通して濾過することにより、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質 - 抗真菌solution.Sterilizeこの培地を加える。
- FBSまたは抗生物質 - 抗真菌ソリューションなしでHG-DMEMで100 U / mlのコラゲナーゼII溶液を調製する。
- 標準はさみ：オートクレーブ滅菌による単離のために必要とされる以下の手術器具を、滅菌sの、単純な切開鉗子、細かい点と歯鉗子およびメスハンドル（＃4）。
- 人間の羊膜の間葉系幹細胞の単離
- 片手でへその緒を持ち、もう一方の手で、約5cm 2の断片を得るために、半透明のシートのように見える羊膜（AM）を、デタッチ。絨毛膜部が試料中に存在する場合には絨毛膜部が羊膜よりも厚いように、手動の切開によって、基礎となる絨毛膜を分離する。
- 5mlのPBSの3回の洗浄で残留血液を取り出し、簡単な鉗子で血栓を取り除く。約0.5cm 2の断片を生成するために、メスで午前中に小さなカットを行います。
- 羊膜の酵素消化
- 0.125％トリプシンを5ml / 5％CO 2雰囲気中で37℃で50mlの円錐管中で30分間37℃で0.5mMのEDTA溶液でAMをインキュベートする。 250での遠心機XGと25°Cで5分間、その後、上清を捨てることによってトリプシン溶液を除去。
- コラゲナーゼII型溶液15mlを加え、時折レイバらによると、振とうしながら、5％CO 2雰囲気中で37℃で2時間インキュベートする。9
- 直ちにコラゲナーゼIIで消化した後、10分間、250×gで25℃で15 mlのPBSと遠心を追加する。
- 上清を捨て、250×gでPBS溶液と遠心分離機の15ミリリットルと15分間、25℃で細胞のペレットを洗浄。上清を捨てる。
- 軽く振りHG-DMEM 10ml中の細胞のペレットを再懸濁。
- 間葉系幹細胞の増殖
- 培養フラスコ中の種子の細胞懸濁液2mlを（1×10 4細胞/ cm 2）、およびHG-DMEM 2 mlを追加し、5％CO 2雰囲気中37℃で細胞をインキュベートする。 5-7の後に培地を変更することにより、非接着細胞を除去する日。
- この時間の後、90％の細胞集密度を得るために、追加の7~10日間3日ごとに培地を変える。
- 細胞を回収し、0.125％トリプシン/ EDTA溶液（トリプシン処理）で5％CO 2雰囲気中で37℃で5分間、それらをインキュベートする。
- すぐにトリプシン処理した後、5分間250×gで15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機にピペットと転送で細胞を集める。
- 上清を捨て、HG-DMEM 10mlの細胞のペレットを再懸濁。
- 2 75cm 2の培養フラスコ（各フラスコ中の5ml）中の培養細胞懸濁液を、90％コンフルエンスになるまで培養を維持する。
- 繰り返します1.4.3を繰り返します。 1.4.6に、第9の通路またはサブカルチャーまで、。
- フローサイトメトリーや他の研究のために1.4.5に1.4.3のステップのように、トリプシン処理により細胞を回収する。
多孔質骨基質ディスク（NKB）の調製
- NKBディスクを濡らし（直径12mmで、厚さ2mm）を、Fassina らによると、37℃、5％CO 2の加湿雰囲気中FBSなしHG-DMEM 3mlの一晩各ディスクをインキュベートする5。
- 湿潤処理後、過剰の培地を除去し、5分間250×gで50mlの円錐管とスピンディスクを置く。 24ウェル細胞培養プレートにディスクを置きます。
- HG-DMEM500μlのを追加し、25℃で30分間インキュベートする。気泡が栄養素と細胞の正確な分布を優先するようにNKBのディスク上に存在していないことを確認してください。
- 気泡がディスク上に認められた場合には、振ると培地300μlを添加し、37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で15分間インキュベートする。この時間の後だけでなく、細胞培養の壁を通って吸引培養液300μlのを削除し、気泡が形成されないことを確認してください。
- シンプルな鉗子を使用して、新しい24ウェルプレートにディスクを置きます。
- 予め湿らせた生体材料ディスクの表面上の3つのサブカルチャーからの細胞懸濁液（5×10 5 AM-hMSCのHG-DMEM100μl中）に播種し、37℃で5％のCO 2の加湿雰囲気中で30分間インキュベートする°C。細胞はすべての足場の地形と対話できるように生体材料の上面にゆっくりと継続的にこの手順を実行します。注：この手順は、 表1に示した生体材料に付着した細胞の60％を達成する。
- 37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で3日間培養して、37℃でHG-DMEMの1.5ミリリットルを追加し、維持する。その培養プレート皿の底上の細胞の堆積回避のための培養培地の添加で乱流を生成しません。これは最初の時間です。
フローCytom 4.細胞表面マーカーのキャラクタリゼーションetry
- 行列のディスク上に播種する前に9 番目のサブカルチャーから細胞を切り離します。 0.25％トリプシン/ 1mM EDTAを使用し、氷冷2％ホルムアルデヒド中で30分間それらを修正。固定後、0.05％PBSで細胞を1回洗浄します。
- 氷上で3分間20％のヒト免疫グロブリンで細胞をインキュベートすることによって非特異的結合をブロックし、フィコエリトリン（PerCP標識）で0.1×10 6細胞のアリコートをインキュベートは、CD73、FITC結合mAb CD90、CD34に対するPE結合mAbに対するmAb -結合暗闇の中で25℃で1時間、FITC結合mAb CD45およびPE結合mAb CD105。アイソタイプが一致したFITC結合mAb、PE結合mAb andPerCP結合mAbを陰性対照にサービスを提供する。
- データ収集と分析のためのソフトウエアを用いて表面マーカーの発現レベルを計算する。
走査型電子顕微鏡5.細胞接着の検出
- PBSで2回3日間の培養における細胞のディスクのサンプルをリンス0.1 MのNa-カコジル酸緩衝液（pH7.2）solutionin 4％（v / v）のグルタルアルデヒドfixtheサンプル。
- 10。以前らリベラ-Nによって報告されるように、顕微鏡観察のための試料を調製し、15kVでの電位にし、500X及び2000Xの倍率で走査型電子顕微鏡を用いて観察する。
6.細胞増殖アッセイ
- 培地1.5 mlを含有する細胞のディスクのサンプルを、製造業者のガイドラインに従ってバイタル色素（AB）の150μlを添加し、37℃で5％CO 2の加湿雰囲気中で細胞をインキュベートする。
- すぐに、細胞培養の7日に達するまでAB（0時間）、各24時間の添加後、600nmの参照波長で570nmで吸光度を測定する。
7コロニー形成単位（CFU）11
- 培養100mmの組織培養diskin HG-DMEM当たり100細胞および14インキュベート37℃、5％CO 2の加湿雰囲気中日。
- 室温で5〜10分間、メタノール中0.5％クリスタルバイオレットで染色し、PBSで培養物を洗浄する。
- 二回PBSでプレートを洗浄し、血球計数器を使用して目に見えるコロニーを数える。
Representative Results
ヒト間葉系幹細胞の単離
鈍的切開（ 図1）を使用して絨毛膜からAMの機械的分離の後、接着細胞集団を、トリプシンおよびコラゲナーゼII消化によって得られた。健康なドナーの母親から得た光学顕微鏡写真（ 図2A）及び走査型電子顕微鏡写真（ 図2B）、この研究で使用.theの胎盤に示すように、3日目に線維芽細胞様細胞の形態presenta培養皿に付着したこれらの細胞集団の単離を投稿インフォームドコンセントwithprevious。
フローサイトメトリーによる細胞の特徴付け
AMから得られた細胞集団は、表面間葉系マーカーCD90 +（6.85±93.5％）およびCD73 +及びCD105 +（3.46±79％）に強く反応性であり、そのようなCD34-およびCD45などの造血マーカーに陰性反応を示した。このように、この作品で使用されるAM-たhMSCは、以前レイバらによって報告されたaccordancewith情報で、間葉だった。（ 図3）。さらに、この結果は、間葉系幹細胞のための細胞療法のための国際協会（ISCT）によって確立された免疫表現型特性と一致する。
骨基質上の細胞接着
スキャン顕微鏡写真は7日NKBに重ねた後、AM-hMSCの挙動を示す。生体材料の表面は、球状細胞（初日）で覆われており、いくつかの拡散セルは、見かけ上七日目にウシマトリックス表面に付着させた。より高い倍率では、拡散セルはfilipodialプロセス（FL）（ 図4） を介して密着するように思われた。
骨基質上の細胞増殖
ABアッセイの結果は、相対的な吸光度のわずかな減少を示したのuニットウシマトリックス条件（+骨基質）の（RAU）インキュベーションの1日後、その後5日目に、足場の存在は、ウシの非存在下で行わ培養と比較して統計学的に有意な細胞増殖の増加を誘導するマトリックス（-boneマトリックス）（ 図5）。
コロニー形成単位
CFUは、幹細胞の伝統的アッセイである。この作品において単離さAM-たhMSCは、培養中の14日目の離散コロニーを形成するその能力を保存した。
図1：羊膜の分離。 （A）、臍帯（UC）は、羊膜が得られる領域を同定するために片手で保持されている。（B）羊膜（AM）は、血液神経支配することなく、半透明膜に似ている。
図2：ヒト羊膜由来の幹細胞の形態学的特性 AM-hMSCの培養3日後の単離では、光学顕微鏡を用いて観察し、線維芽細胞様の形態を示した。
図3：。（右のヒストグラムの変位により示されるように、彼らは、間葉系マーカー（CD73、CD90、CD105）陽性であったため、人間の羊膜から細胞は主に、間葉系細胞であった特性評価フローサイトメトリー 、および造血マーカーは陰性CD34およびCD45）、左にヒストグラムの変位によって確認されるように。 PEおよびFITC蛍光色素isotypesfor制御がで観察されている間の抗原は、赤のヒストグラムに示されている黒。
図4：ウシ骨マトリックス上での細胞接着生体材料の細孔内への細胞の付着を示すSEM画像列球状状態（CS）における生体材料に付着した複数のセルとNKB細孔の（A）のパノラマビジョン生体材料の表面に（CF）平坦化され、骨小腔がウシマトリックス上の培養3日目に（ラック）として示して鑑賞することも可能である。細胞の（B）の増幅の表面に適応させるプロセスでfilipodial予測を通る材料ウシマトリックスに付着し、平らに2セルの間の（C）の相互作用は、（C1、セル1;およびC2、セル2）。。 Vにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をIEW。
図5：ウシ骨マトリックス細胞増殖における細胞の増殖は、ABの減少によって評価培養の7日間に沿って相対的な吸光度単位で表した。結果は、陰性症状（-boneマトリックス）と比較して、静的に異なっていたAM-hMSCの増殖における骨基質（+骨基質）の影響を示している。た（* p <0.05）
図6：MSCのCFUアッセイは、最初に様々な密度でプレーティングし、14日間培養し（* /意味- SDを、N = 10）。
| 細胞が付着した | 細胞接着（％） | |
| 底の細胞 | 187667±1208 | 62.47 |
| 足場上の細胞 | 312333±1208 | 37.53 |
表1：三重のための2つの独立した実験にウシのマトリックス上の接着の効率化プレート皿の底と足場に付着した細胞に付着した細胞は、表に示さtrypsinization.Theデータによって回復された後、血球計によりカウントした対応標準偏差は±
Discussion
ヒト羊膜（ 図1）から得られた幹細胞は、線維芽細胞様の形態、間葉系細胞に類似した（ 図2）を示し、主にMSCをした。また、フローサイトメトリーアッセイは、これらの細胞が造血マーカー（CD34、CD45）（ 図3）のための間葉細胞マーカー（CD73、CD90、およびCD105）は、正および負であることが明らかになった。また、AM-たhMSCは、CFUの（ 図6）を形成する能力を提示し、この作業中に単離した。同様に、この形で単離された間葉系幹細胞（ 図5）osteoinductor生体材料（ 図4）に付着し、足場に増殖する能力を保持した。
これらの理由から、本研究で使用したマクロ多孔性骨生体材料上のAM-hMSCの培養方法は、負傷した骨組織内の細胞に挿入して、そのdiffereを誘発する機会を表す骨芽細胞系統へntiation。 NKBは骨伝導andosteoinductive材8であるため、この培養系は、骨芽細胞の表現型および骨芽細胞分化プロセスを維持するために、骨芽インダクタの添加を必要としない。例えば、ヒト胎盤などの廃棄組織の使用は、しばしば侵襲的方法または低い細胞収率を伴う他のソースと比較して、MSCが分化する可能性を有する幹細胞の集団にアクセスするためのシンプルかつ倫理的な代替手段を表す。
細胞を上部表面材料にマイクロマスに播種し、細胞がコロニーを形成し、適切なインキュベーション時間の後に全体の生体材料の表面に付着しているため、提案培養方法は、 インビボ系に外挿することができる。この技術を実装する際にさらに洗練された試薬、機器や手順も同様に既存の方法とは異なり、マイクロマスcultureasをしている必要はありません細胞が優先的に生体材料とではなく、プレートの底と相互作用することを確実にする材料上の細胞のアリコートのゆっくりと着実な堆積。これは、それらが表面または細孔内にある場合、それらは関係なく、材料に組み込まれたとき、細胞が培養培地から必要な栄養を持っていることを保証するように、別の重要な点は、細胞を培養する前に予め湿潤材料の使用である。それは骨芽細胞分化を誘導し、維持するために、外部因子の添加を回避するので、最終的に、骨誘導生体材料の使用は、このプロセスにとって重要である。技術の制限は、ウシマトリックスの骨誘導可能性に基づいていることである。しかしながら、提案された培養系は、20〜200μmでの細孔分布を有する任意の多孔質材料に外挿することができる。したがって、この研究で提示手順は、様々な材料tの間葉系幹細胞を培養するための代替方法がある帽子は、特に骨再生のために、組織工学のために使用される。
Disclosures
著者らは、開示することは何もない。
Acknowledgments
私たちは、Facultadデ食事と-UNAM DGAPA IN201510とDGAPA IN216213、ConsejoナシオナルデCiencia yのテクノロジア（CONACyT No.49887）が提供する奨学金や財政支援を認める。セルバンテスナシオナル·デ·Perinatologíaのサルバドールコレア生物学的物質との助けのため。 Nukboneを供与するための、およびBiocriss、SA·デ·C. V。またイングに感謝。 IIM、UNAMのヘクター·マルティネスと技術支援のためのCINVESTAVのM EN Cファビオラ·ゴンザレス。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| sterile phosphate buffered saline | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10010023 | cell culture |
| penicillin-streptomycin | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 10378016 | cell culture |
| FBS | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 26140111 | cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with high glucose | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 11965118 | cell culture |
| collagenase type II | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 17101015 | cell culture |
| 3 mM calcium chloride | SIGMA_ALDRICH | C5670 | cell culture |
| trypsin/0.5 mM EDTA solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | R001100 | cell culture |
| Trypan Blue solution | GIBCO,LIFE TECHNOLOGIES | 15250061 | cell culture |
| phycoerythrin (PerCP)-conjugated CD73 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC- CD90, | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD34 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| FITC-CD45 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| PE-CD105 | BD Pharmigen | 562245 | cytomery |
| BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Pharmigen | BD FACSCalibur | cytomery |
| alamarBlue (AB) | LIFE TECHNOLOGIES | DAL1025 | proliferation cell assay |
| SUNRISE-reader | TECAN, Germany | Sunrise | proliferation cell assay |
References
- Alviano, F., et al. Term amniotic membrane is a high throughput source for multipotent mesenchymal stem cells with the ability to differentiate into endothelial cells in vitro. BMC Developmental Biology. 7, 1-14 (2007).
- Anker, P. S., et al. Isolation of mesenchymal stem cells of fetal or maternal origin from human placenta. Stem Cells. 22 (4), 1338-1345 (2004).
- Seebach, C., Schultheiss, J., Wilhelm, K., Frank, J., Henrich, D. Comparison of six bone-graft substitutes regarding to cell seeding efficiency, metabolism and growth behaviour of human mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. Int J Care Injured. 41, 731-738 (2010).
- Meseguer-Olmo, L. J., et al. In vitro growth kinematics of human osteoblasts on porous hydroxyapatite ceramics. Rev. Ortop. Traumatol. 50, 224-232 (2006).
- Fassina, L., et al. Low-power ultrasound as a tool to culture human osteoblasts inside cancellous hydroxyapatite. Bioinorganic Chemistry and Applications. 2010, 1-8 (2010).
- Fassina, L., et al. Ultrasonic and Electromagnetic Enhancement of a Culture of Human SAOS-2 Osteoblasts Seeded onto a Titanium Plasma-Spray Surface. Tissue Engineering Part C: Methods. 15, 233-242 (2009).
- Gomes, M. E., Holtorf, H. L., Reis, R. L., Mikos, A. G. Influence of the porosity of starch-based fiber mesh scaffolds on the proliferation and osteogenic differentiation of bone marrow stromal cells cultured in a flow perfusion bioreactor. Tissue Eng. 12, 801-809 (2006).
- Rodriguez-Fuentes, N., et al. Nukbone(R) promotes proliferation and osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells from human amniotic membrane. Biochemical and Biophysical Research Communications. 434, 676-680 (2013).
- Leyva-Leyva, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cell subpopulations from human amniotic membrane with dissimilar osteoblastic potential. Stem Cells and Development. 22, 1275-1287 (2013).
- Rivera, N., et al. Blackwater fever like in murine malaria. Parasitology Research. 112, 1021-1029 (2013).
- Pochsmpally, R. Colony Forming Units Assays for MSCs. Mesenchymal Stem Cells. Methods and Protocols. Procko, D. J., Phinney, D. G., Bunnell, B. A. , Humana Press. New York, NY. (2008).
