Summary
استجابات حساسية، والتي تتميز تنشيط الخلايا البدينة والخلايا القاعدية، ويقودها الربط عبر ال IgE وإطلاق وسطاء proinflammatory. ويمكن تحقيق التقييم الكمي للاستجابات حساسية باستخدام ايفانز الأزرق صبغ لرصد التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية بعد التحدي حساسية.
Abstract
استجابات حساسية هي نتيجة لتنشيط الخلايا البدينة والخلايا القاعدية، وإطلاق سراح لاحق من فعال في الأوعية والوسطاء proinflammatory. التعرض لمسببات الحساسية في الأفراد الحساسين يمكن أن يؤدي إلى الأعراض السريرية التي تختلف من حمامي طفيف إلى الحساسية المفرطة التي تهدد الحياة. في المختبر، وقد تم تطوير نماذج حيوانية مختلفة لفهم آليات القيادة استجابات حساسية. هنا، نحن تصف طريقة مفصلة لقياس التغيرات في نفاذية الأوعية الدموية لقياس استجابات حساسية موضعية. وذكرت وفحص الحساسية المفرطة المحلي أولا في 1920s، وقد تم تكييفها من تقنية نشرته كوجيما وآخرون. في عام 2007 1. في هذا الاختبار، يتم الطعن الفئران توعيتهم OVA في الأذن اليسرى مع السيارة وفي الأذن اليمنى مع OVA. ويلي ذلك حقنة في الوريد من ايفانز الأزرق صباغة. عشرة دقيقة بعد حقن ايفانز الأزرق، والموت الرحيم للحيوان والصبغة التي extravasated فيالى الاسماع يستخرج بين عشية وضحاها في الفورماميد. ثم يتم كميا امتصاص الصبغة المستخرجة مع طيفي. هذه الطريقة النتائج بشكل موثوق في مظهر البصرية وقابل للقياس للاستجابة تحسسية المحلية.
Introduction
وبوساطة النوع الأول من فرط الحساسية الناجمة عن مستضد عبر ربط إيج على سطح الخلايا البدينة والخلايا القاعدية. وهذا يؤدي إلى تحبب الخلوية والإفراج عن وسطاء فعال في الأوعية وproinflammatory مثل الهستامين، تريبتاز، وعامل تنشيط الصفائح الدموية 2. وعقب صدور سطاء بريفورميد خلال تحبب الخلايا البدينة توليف والافراج عن البروستاجلاندين و leukotrienes، التي تزيد من نفاذية الأوعية الدموية 3. وتحدث هذه الاستجابة السريرية الأولية بسرعة ويشار إليه على أنه "رد فعل فوري". في الجلد، استجابة الانتفاخ و-مضيئة مرئيا بسهولة في غضون دقائق من التحدي مستضد. اعتمادا على جرعة من التحدي، فمن الممكن لمراقبة "رد مرحلة متأخرة" بعد بضع ساعة. ويرجع ذلك إلى وذمة موضعية والتوظيف الكريات البيض في الأنسجة 2 أواخر مرحلة التورم. الهستامين، يعتبر عموما أن يكون الوسيط الرئيسي يشاركون فياستجابات حساسية مباشرة، يعمل على مستقبلات الهستامين أعرب 1 (HR1) على السفن ومستقبلات الهستامين 2 (HR2) أعرب على العضلات الملساء. التأثير المشترك يزيد من تدفق الدم ونفاذية الأوعية الدموية في موقع الالتهاب 4.
وقد وضعت مجموعة متنوعة من نماذج حيوانية من الحساسية وذلك لدراسة الآليات التي تشارك في الالتهاب التحسسي، بما في ذلك نماذج من الربو التحسسي، الحساسية المفرطة النظامية، والحساسية المفرطة المحلية. وقد استخدمت إدارة صبغة عن طريق الوريد لقياس استجابات حساسية موضعية في نماذج حيوانية لمدة قرن تقريبا، مع المنشورات التي تصف هذه التقنية التي يعود تاريخها إلى 1920s 5. كانت الأرانب والخنازير الغينية على نماذج حيوانية الأولى المستخدمة لاختبار تفاعلات فرط الحساسية المباشرة، وعثر الردود الأكثر حساسية عموما في الأذن 5،6. تم التحقق من صحة الفحص في وقت لاحق للاستخدام في الجرذان والفئران 7 8.
تاريخيا،وقد استخدمت مجموعة متنوعة من الأساليب التجريبية، بما في ذلك حقن مستضد قبل حقن الصبغة، حقن الصبغة قبل حقن المستضد، وحقن صبغة في وقت واحد والمستضد. إدارة صبغة عن طريق الوريد كوسيلة لقياس استجابات حساسية هي فحص تنوعا لأنها يمكن أن تستخدم لقياس نشطة، سلبية، وعكس ردود فعل سلبية 5،9. وقد استخدمت الأصباغ العديدة لتقييم استجابات حساسية، بما في ذلك التريبان الأزرق، Pontamine السماء الزرقاء، ايفانز الأزرق، الأزرق غايغي 536، والهند الحبر 5،6،9. هناك حل من 0.5٪ ايفانز الأزرق حاليا الصبغة القياسية المستخدمة لقياس استجابات حساسية في الجلد.
الاستجابة إلى التحدي الحساسية هي عابرة. يتم التوصل إلى الحد الأقصى لكثافة الداخل 10 - 15 دقيقة من حقن الصبغة، وأي رد فعل مرئيا إذا كانت تدار صبغة أكثر من 30 دقيقة بعد التحدي، بغض النظر عن أنواع الحيوانات المستخدمة 9. كان الكمي لصبغ تسرب الأصليلاي الحصول عليها عن طريق قياس حجم الانتفاخ كما يدل على ذلك صبغة زرقاء 7-9. بالإضافة إلى ذلك، تهم الخلايا البدينة degranulated يمكن كميا بواسطة استئصال أنسجة الجلد من موقع رد الفعل وتلطيخ مع طولويدين الأزرق 7. وكثيرا ما يستخدم تحبب الخلايا البدينة كعلامة للالجلدي، استجابات حساسية إيج بوساطة، والخلايا البدينة هي خلية السكان المحليين الرئيسي معربا عن تقارب عالية إيج مستقبلات FcεRI. تم تطوير تقنيات طيفية لقياس تسرب الصبغة في الأنسجة الجلدية الحساسية المفرطة للالسلبي (PCA) في الفئران والفأر 10 11 في عام 1990.
وقد تم تكييف البروتوكول الحساسية المفرطة فحص المحلية التالية من كوجيما وآخرون. 1، ويستخدم ألبومين البيض بيض الدجاج (OVA) كما مستضد لانتزاع استجابات حساسية. ومع ذلك، مستضدات أخرى من OVA قد تستخدم اذا شئت. ثم يستخدم الفحص ايفانز الأزرق صبغ لرصد التغيرات في الأوعية الدموية permeabilitذ التي تحدث بسبب الصاري خلية إيج عبر ربط وإطلاق الهستامين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. الفئران توعية
- إعداد محلول المخزون عن طريق تمييع OVA OVA في برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز النهائي من 20 ملغ / مل. تجميد أسفل مأخوذة في cryovials وتخزينها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- تحقيق واحد أو أكثر aliquots من 20 ملغ / مل الأسهم OVA إلى درجة حرارة الغرفة. تمييع OVA في برنامج تلفزيوني 1X إلى تركيز النهائي من 1 ملغ / مل في أنبوب 5 مل البوليسترين جولة القاع مع قبعة. دوامة لفترة وجيزة لخلط.
- في حين عقد أنبوب البوليسترين التي تحتوي على 1 ملغ / مل OVA على دوامة وضعت في سرعة متوسطة، إضافة حجم مساو من المتجانس تماما Imject الشب (40 ملغ / مل) قطرة قطرة مع الاستمرار في دوامة أنبوب لإنتاج نسبة 1: 1 ل الشب لمستمنع.
- وضع غطاء على أنبوب وأنبوب الشريط لدوامة. تحويل دوامة على أدنى الإعداد والسماح OVA بأن يمتص إلى الشب لمدة 30 دقيقة.
- لا تسمح كمية كبيرة من الوقت لتمرير بين إعداد OVA / الشب وتوعية الفئران. إذا التوعية لا يمكن إتمام مباشرة بعد OVA / الشب preparatأيون، مخزن OVA / الشب في درجة حرارة الغرفة. دوامة لمدة 1 دقيقة قبل استخدام.
- تحميل الأنسولين حقنة 1 مل مع OVA / الشب الخليط. سقف الحقنة مع إبرة قياس 27.
- ضخ 100 ميكرولتر من OVA / الشب في الصفاق من BALB / ج الفئران لجرعة في الماوس من 50 ميكروغرام من OVA و 2 ملغ من الشب.
- لمراقبة سلبية، توعية مجموعة أخرى من الفئران إلى برنامج تلفزيوني. إعداد 1: 1 خليط من الشب وPBS في بنفس الطريقة المذكورة أعلاه، حذف OVA.
- توعية جميع الفئران (OVA والسيطرة PBS) مرة واحدة في الأسبوع لمدة 3 أسابيع ليصبح المجموع 3 الحقن. بعد الحقن النهائي، انتظر على الأقل 2 أسابيع قبل إجراء فحص الحساسية المفرطة المحلي.
2. المحلية العوار الفحص
- جلب OVA محلول المخزون إلى درجة حرارة الغرفة. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وتمييع 20 ملغ / مل الأسهم OVA إلى تركيز النهائي من 5 ملغ / مل مع برنامج تلفزيوني (1: 4 التخفيف من OVA في 1X PBS). دوامة لفترة وجيزة لخلط.
- تخدير الفئران باستخدام RC 2 </ سوب> القوارض نظام التخدير (أو نظام مماثل تسليم يتبخر). ملء خزان مع isoflurane، وبدوره على تدفق الهواء O 2. مكان الفئران في غرفة تحريض وضبط قرص التحكم الأيزوفلورين إلى 5٪ لبدء التخدير. مرة واحدة يتم تخدير الفئران تماما، يتبين من عدم الحراك، وضبط قرص التحكم الأيزوفلورين إلى 3٪ للحفاظ على التخدير العميق. الغرض من التخدير في هذا الإجراء هو شل الحيوان. الحقن الأذن والذيل الوريد لا تسبب الألم أو الضيق كبيرا للحيوان.
ملاحظة: الأيزوفلورين يمكن أن يكون لها آثار سلبية على الجهاز التناسلي البشري. تأكد من استخدام في غرفة جيدة التهوية وإرفاق اسطوانة الكسح إلى غرفة تحريض لتحييد النفايات الغازية. إذا كنت حاملا أثناء استخدام الأيزوفلورين، وارتداء قناع فلتر الكربون لتقليل التعرض. - تحميل 10 ميكرولتر من 5 ملغ / مل OVA إلى حقنة الأنسولين 3/10 سم مكعب توج مع إبرة 31 G. تحميل 3/10 سم مكعب حقنة الأنسولين آخر مع 10 ميكرولترمن 1X PBS.
- باستخدام مجهر تشريح، وضخ 10 ميكرولتر من OVA في الأذن اليمنى من الماوس تخدير لجرعة التحدي من 50 ميكروغرام من OVA. جرعات أخرى، مثل 20 ميكروغرام، هي أيضا مقبولة.
- لتحقيق الاستقرار في الأذن للحقن، والتفاف الاسكتلندي (الجانب زجة متابعة) حوالي 15 مل أنبوب مخروطي. تأمين الجانب الظهري من الأذن اليمنى إلى الشريط. إدراج الجانب شطبة إبرة يصل بين الأوراق اثنين من الأذن. حقن ببطء OVA في وسط النسيج الأذن، مع الحرص على عدم ضرب أي الأوعية الدموية.
- باستخدام نفس الطريقة المذكورة أعلاه، وضخ 10 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في الأذن اليسرى كعنصر تحكم السلبية.
- انتظر 3 دقائق.
- خلال هذا الوقت، ضع الماوس في رادع وعقد ذيل تحت مصباح الحرارة أو في حمام ماء دافئ لمدة 1 دقيقة إلى تمدد الأوعية الدموية.
- باستخدام حقنة 1 مل الأنسولين توج مع إبرة 27 G، حقن ببطء 200 ميكرولتر من 0.5٪ ايفانز الأزرق صبغة في الذيل الخامسعين من الفأرة. تدار الحقن السريع قد تدمر هيكل السفينة قبل كامل 200 ميكرولتر. إذا حدث هذا، محاولة لحقن حجم ما تبقى من الصبغة في الوريد على الجانب الآخر من الذيل.
- الانتظار 10 دقيقة.
- الموت ببطء الماوس وإزالة كلتا الأذنين باستخدام ملقط ومقص جراحي.
- الاستيلاء على حواف الأذن مع ملقط، والتأكد من أن أي ضغط يطبق على موقع الحقن في مركز الأذن. إزالة أكبر قدر ممكن من أنسجة الأذن ممكن عن طريق خفض بالقرب من، ولكن ليس من خلال سلسلة من التلال الغضروف الحاضر في قاعدة الأذن. كميات صغيرة من الفراء قد تكون موجودة على الأذن استئصاله. هذا لن يؤثر على الفحص.
- قسامة 700 ميكرولتر من الفورماميد إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. إعداد أنبوب واحد في الأذن (أنبوبين في الماوس).
ملاحظة: الفورماميد هو ماسخة، مطفرة، ومصدرا للإزعاج. ارتداء القفازات، وحماية العين، وحماية الوجه. النساء الحوامل يجب توخي الحذر عند التعامل معقد تكون ق الفورماميد سمي جنيني. - إضافة إلى آذان الفورماميد، وكأب الأنابيب، واحتضان بين عشية وضحاها في حمام الحرارة الجافة المنصوص إلى 63 درجة مئوية. الأذنين قد لا تزال تظهر اللون الأزرق قليلا بعد الحضانة. ولكن يتم استخراج معظم الصبغة في الفورماميد.
- إضافة 300 ميكرولتر من كل عينة من نسختين إلى 96 لوحة جيدا. تجنب نقل الفراء إذا كان موجودا في العينة. ضمان عدم وجود فقاعات الموجودة في الآبار، لأنها سوف تؤثر على القراءة الامتصاصية.
- إضافة 300 ميكرولتر من الفورماميد، في نسختين، إلى 96 لوحة جيدا. وسوف تستخدم هذه الآبار والفراغات.
- استخدام مطياف لقياس الامتصاصية في 620 نانومتر. آبار الفورماميد طرح من كل قراءة العينة.
ملاحظة: تم تنفيذ جميع التجارب في إطار البروتوكولات وافقت عليها اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام جامعة الخدمات الموحدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والحيوانات التي خضعت للفحص بنجاح يكون الجلد والعيون التي تظهر باللون الأزرق. يجب توعية PBS الحيوانات لا تتفاعل إما برنامج تلفزيوني أو OVA التحدي، ينبغي أن تظل بالتالي كلتا الأذنين الأبيض (الشكل 1A). في الحيوانات OVA توعية، الأذن تلقي التحدي PBS (يسار) وينبغي أن تكون إما بيضاء أو زرقاء تماما بخفة بطريقة موضعية في موقع الحقن. الأذن تلقي التحدي OVA (يمين) يجب أن تصبح تدريجيا أكثر قتامة الأزرق خلال 10 دقيقة بعد تناوله صبغ (الشكل 1B).
سوف PBS الحيوانات توعية يكون قراءات الامتصاصية ضئيلة لكل من برنامج تلفزيوني وOVA التحدي (الشكل 2A). للحيوانات OVA توعية، حقن PBS النتائج عموما في قراءة الامتصاصية يعني من 0.13 وانحراف معياري 0.04. على العكس، 50 ميكروغرام OVA نتائج التحدي في قراءة الامتصاصية يعني من 0.58 وانحراف معياري 0.18 (فايجوري 2B). كمية OVA المستخدمة في التحدي يمكن تعديل للتجارب الفردية إذا لزم الأمر. على سبيل المثال، النتائج 20 ميكروغرام التحدي OVA في الامتصاصية يعني من 0.30 وانحراف معياري 0.10 (الشكل 2C)، ومع ذلك تحديا أقل من 20 ميكروغرام قد لا تعطي نتائج موثوقة. يجب أن يكون الأمثل تغييرات في تركيز OVA والتحقق من صحتها قبل استخدامها.
النتائج يمكن إقران بيانيا، مع PBS الامتصاصية مقارنة OVA الامتصاصية. بدلا من ذلك، يمكن رسم النتائج كقيمة واحدة، مع الامتصاصية PBS تطرح من الامتصاصية OVA لكل حيوان على حدة.
الشكل 1: الأذن تصبغ في الحيوانات PBS وOVA توعية. (A). الأذن تصبغ في برنامج تلفزيوني توعية الحيوانات. الأذن اليسرى (تحدى مع PBS) والأذن اليمنى (تحدى مع 50 ميكروغرام OVA) تظهر شيئا يذكر لولا تسرب الصبغة. (B). الأذن تصبغ في الحيوانات OVA توعية. ليست هناك استجابة الحساسية في الأذن اليسرى (تحدى مع PBS)، كما يتضح من عدم وجود تسرب الصبغة الزرقاء. الأذن اليمنى (50 ميكروغرام تحدى مع OVA) يظهر التلوين الأزرق مشرق يدل على زيادة نفاذية الأوعية الدموية، ونتيجة مباشرة لتنشيط الخلايا في أنسجة الأذن.
الشكل 2: القيم OD التمثيلية للحيوانات OVA توعية التطوير التنظيمي القيم المستمدة من قياسات طيفية التي اتخذت في 620 نانومتر (A).. 50 ميكروغرام التحدي OVA في الحيوانات PBS توعية. قيم التطوير التنظيمي لكل من برنامج تلفزيوني وOVA التحدي تكاد لا تذكر. (B). 50 ميكروغرام التحدي OVA OVA توعية في الحيوانات. PBS نتائج التحدي في القيم OD <0.2 والتحدي OVA دورة الفتشوبLTS في القيم OD> 0.3. (C). 20 ميكروغرام OVA التحدي. PBS نتائج التحدي في القيم OD <0.2. الأذنين اليمنى خفضت قليلا القيم OD بسبب جرعة التحدي أصغر من OVA المستخدمة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتستخدم علامات عديدة من أمراض الحساسية لتقييم قوة استجابات حساسية التالية التحدي حساسية، بما في ذلك التغيرات في مستويات تعميم الهستامين، إنتاج السيتوكينات الاستجابة Th2، وتجنيد خلية في السائل القصبات في وضع التحدي مجرى الهواء. في حين رصد التغيرات في هذه المعايير المهم لدراسة أمراض الحساسية، والعلامات البيولوجية لا تتطابق دائما مع أمراض الحساسية السريرية. فحص الحساسية المفرطة المحلي الموصوفة في هذا البروتوكول يتيح قياس استنساخه من نفاذية الأوعية الدموية المحلية باعتبارها القرين لمرض حساسية موضعية. باستخدام الصبغة الزرقاء التسرب، هذا البروتوكول يتيح كل من التصور والكمي النسبي من الحساسية الموضعية. على النقيض من فحوصات الحساسية التي تعتمد على التهديف السريرية، لا تعرض نتائج الأولية لهذا الاختبار (الصبغة الزرقاء تسرب مقاسا امتصاص الطيفي) بسهولة للانحياز مراقب. أدفا أخرىntage هو أن الحيوانات يصرح باستخدامها بعد وقت قصير من التحدي، والحد من أي إزعاج المحتمل الناجم عن التحدي حساسية والإدارة صباغة. استخدام بديل لطيفي باليد وصفها أكياما وآخرون 10 يسمح للقياس المستمر للتغيرات في نفاذية الأوعية الدموية. ومع ذلك، ايفانز الأزرق صبغة غير سامة، وسوف يؤدي في نهاية المطاف إلى حقن الحيوان يحتاج أن يكون الموت الرحيم.
بينما هذا الاختبار لديها عدد من نقاط القوة، وأنها لا تملك الحد من كونها تحديا إلى حد ما من الناحية الفنية. نتائج موثوقة تعتمد على الأذن والذيل حقن الوريد ثابتة وناجحة. إذا لم يتم إدارتها جرعة التحدي كلها في الأذن، إن نتائج الحقن في الأذن ثقب واضح في وعاء دموي، أو إذا كان ايفانز الأزرق الحقن في الوريد ليست كاملة، ينبغي استبعاد الحيوان من التحليل. في مختبرنا، وكان المحققين لممارسة الحقن داخل الأدمة الأذن لسفقبل أسابيع راؤول تطوير الكفاءة. بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم لتشغيل الضوابط المناسبة للفحص. على وجه التحديد، ينبغي أن تستخدم بشكل روتيني حقن PBS باعتبارها الرقابة الداخلية، ويبدو أن الحيوانات للرد بشكل مختلف قليلا إلى الأضرار الناجمة عن الإدراج الإبرة. القراءة PBS يعطي مقياس خط الأساس للتغيرات في نفاذية الأوعية الدموية الناجمة عن حقن نفسها. بدلا من استخدام الحقن الأذن داخل الجلد، الفحص يمكن أيضا أن تطبق على الجلد الخلفي من الفئران. قد يجد المحققون هذا الطريق ليكون تحديا أقل من الناحية الفنية، وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يسمح لاختبار مستضدات متعددة في نفس الوقت.
فحص الحساسية المفرطة المحلي مرنة للغاية، حيث أن جرعة التحدي يمكن التلاعب بها اعتمادا على التجربة. إذا كان من الضروري أن ننظر إلى تغيرات في استجابات حساسية، قد يكون من المفيد استخدام جرعة التحدي OVA أقل مثل 20 ميكروغرام. وهذا يسمح لزيادة حساسية في رصد التغيرات في الامتصاصية، وسيكون أقل احتمالا أن نقطة التشبع لتنشيط الخلايا سيتم التوصل إليها.
بالإضافة إلى ذلك، هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لدراسة الحساسية المفرطة الجلدي السلبي (PCA). في هذا الإعداد، يتم حقن الجلوبيولين مستضد معين في أذن واحدة ومركبة إلى أخرى. بعد 24 ساعة، يتم إعطاء الحيوان تحديا في الوريد من مستضد وايفانز الأزرق صباغة. يمكن للنموذج PCA تقليل الوقت الذي يستغرقه لإكمال التجربة، فإن عدد الحيوانات المستخدمة، وتسمح للمحققين للنظر في التأثيرات المحددة للإيج عبر ربط.
على الرغم قتا أطول لأداء، وهناك بعض المزايا لاستخدام الحساسية المفرطة الجلدي (ACA) نموذج نشط وصفها في هذه الورقة. التوعية من خلال التعرض لمستضد أسبوعي يحاكي العملية التي من خلالها الأفراد على تطوير أمراض الحساسية، وتوعية عادة النظامية والناس عموما على حد سواء إيج حساسية محددة ومفتش في الدورة الدموية. بينما إيج عبر ربط هو الوسيلة الرئيسية لأماهشارع تحبب الخلايا، تستجيب الخلايا البدينة أيضا إلى مفتش عبر الربط. ولذلك، فإن نموذج ACA يسمح للباحثين للتحقيق في آليات استجابات حساسية بالإضافة إلى مرض فقط إيج بوساطة. في الختام، في حين أن أسلوب التوعية المستخدم هو في السلطة التقديرية للمحقق، وفحص الحساسية المفرطة المحلي هو تنوعا، ويمكن استخدامها مع مجموعة متنوعة من المنهجيات التوعية.
تورم الأذن، علامة تستخدم عادة لتقييم استجابات حساسية، ويمكن أيضا أن يقاس بعد التحدي OVA. لقد وجدنا أن آذان تحدى مع OVA لها أكثر بكثير من تورم الأذنين تحدى مع برنامج تلفزيوني في 1 ساعة حقن آخر. على النقيض من اختبار ايفانز الأزرق، لاحظنا أن سماكة الأذن قياسات أقل حساسية من صبغ التسرب وتظهر التباين أكبر بين المحققين وسمك الأذن يمكن تغييرها بواسطة ضغط الأذن عند استخدام أجهزة القياس.
الماوس سلالات أخرى منBALB / ج يمكن استخدامها لفحص الحساسية المفرطة المحلي؛ لكن قراءات الامتصاصية سوف تختلف قليلا اعتمادا على السلالة المستخدمة. بسبب ميلها لتطوير استجابات الاستجابة Th2 قوية والفئران BALB / ج تنتج عادة موثوقة، وقراءات استنساخه مع هذا الاختبار.
هذا الاختبار يسمح للالكمي لاستجابات حساسية موضعية في الحيوانات توعيتهم مجموعة متنوعة من المستضدات. اختيار مستضد مرنة، ومقايسة تم تنفيذها بنجاح مع المواد المسببة للحساسية شيوعا، مثل OVA والبطلينوس ثقب المفتاح هيموسيانين (KLH). وعلاوة على ذلك، بدلا من التوعية، يمكن استخلاصها من ردود الفعل التحسسي المحلي في حيوان السذاجة عن طريق حقن الأجسام المضادة التي عبر الارتباط أو إيج إيج المستقبلات على الخلايا القاعدية والخلايا البدينة، أو عن طريق تنشيط مستقبلات ligating غير إيج على هذه الخلايا مثل CD200R3 1 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BALB/c Mice | The Jackson Laboratory | 651 | |
| PBS pH 7.4 | Quality Biologic | 114-058-101 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503-10G | |
| Imject Alum | Thermo Scientific | 77161 | Mix thoroughly before use |
| Evans Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Formamide | Sigma | 295876 | 99%+ Spectrophotometric grade |
| Isoflurane, USP | Phoenix | NDC 57319-474-06 | |
| 1cc Insulin syringes | BD | 329654 | |
| 3/10 cc Insulin syringe with 31 G needle | Terumo | NDC 100861 | |
| 27 G Needles | BD | 305109 | |
| Forceps | F.S.T. | 11000-12 | |
| Surgical scissors | F.S.T. | 14070-12 | |
| 5 ml Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Medical Supply Partners | 15-1151 | |
| 15 ml Conical tubes | BD Falcon | 352097 | |
| Flat-bottom 96 well plate | Costar | 3590 | |
| Scotch tape | |||
| RC2 Rodent Anesthesia System | VetEquip | 922100 | |
| Vortex Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | Model G560 with 3 inch platform |
References
- Kojima, T., et al. Mast cells and Bbasophils are selectively activated in vitro and in vivo through CD200R3 in an IgE-independent manner. The Journal of Immunology. 179 (10), 7093-7100 (2007).
- Parikh, S. A., Cho, S. H., Oh, C. K. Preformed enzymes in mast cell granules and their potential role in allergic rhinitis. Current Allergy and Asthma Reports. 3 (3), 266-272 (2003).
- Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
- Nakaya, M., Takeuchi, N., Kondo, K. Immunohistochemical localization of histamine receptor subtypes in human inferior turbinates. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 113 (7), 552-557 (2004).
- Ramsdell, S. G. The use of Trypan Blue to demonstrate the immediate skin reaction in rabbits and guinea pigs. The Journal of Immunology. 15 (4), 305-311 (1928).
- Chase, M. W. Studies on the sensitization of animals with simple chemical compounds: X. Antibodies inducing immediate-type skin reactions. The Journal of Experimental Medicine. 86 (6), 489-514 (1947).
- Goose, J., Blair, A. M. J. N. Passive cutaneous anaphylaxis in the rat, induced with two homologous reagin-like antibodies and its specific inhibition with disodium cromoglycate. Immunology. 16, 749-760 (1969).
- Ovary, Z.
- Ovary, Z. Immediate reactions in the skin of experimental animals provoked by antibody-antigen interactoin. Progress in Allergy. 5, 459-508 (1958).
- Akiyama, H., et al. Quantitiative evaluation of passive cutaneous anaphylaxis (PCA) using a hand-held spectrophotometer. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 19 (8), 1112-1114 (1996).
- Teshima, R., et al. Simple spectrophotometric analysis of passive and active ear cutaneous anaphylaxis in the mouse. Toxicology Letters. 95 (2), 109-115 (1998).
