Introduction
Синаптической передачи опосредуется экзоцитоза нейромедиаторов содержащих синаптических пузырьков, и эти пузырьки должны пройти местную переработку эндоцитотических внутри нервного окончания поддерживать нейронов связи в долгосрочной перспективе. Учитывая важнейшую роль синаптической передачи в головном мозге, понимая молекулярные машины, составляющие синаптической цикл пузырек представляет собой краеугольный камень в сторону лучшего понимания в сотовой связи в целом. Среди модельных клеток систем, надпочечников хромаффинных клеток предоставил некоторые из самых окончательного прозрения молекулярных машин, лежащей в основе синаптической переработки пузырьков. Экзоцитоз, заключительный шаг в высвобождения нейромедиатора, была безмерно изучены и рассмотрены с помощью надпочечников хромаффинной ячейки 1,2. На самом деле, большинство молекулярных игроков, которые руководят этими образование, адресности, стыковку, и слияние секреторных гранул были выявлены благодаря применению делметоды ERSE в хромаффинных клеток 1. Кроме того, путем предоставления возможность позволить для разрешения одного пузырька от машин белка, участвующего в экзоцитоза, хромаффинных клетка остается мощной моделью для решения вопросов слияния пузырьков 3.
Измерения емкости Сотовые подключением были впервые использованы в решении одной слияния пузырьков во время экзоцитоза 3. Экзоцитоза пузырьков размером до ~ 60 нм в диаметре были продемонстрированы быть обнаружены с помощью измерений допуска клеточных мембран с техникой патч зажима в конфигурации клеток присоединены 4-7. Прием определяется как мера того, насколько легко схема или устройство позволит току течь; это обратная импеданса. Таким образом, измерения допуска обеспечить понимание мембранного емкости. Это достигается путем введения везикулярного мембрану в плазматической мембране; это включение показывает изменения в поверхностиплощадь 8. Каждый слияния пузырьков вызывает ступенчатое увеличение мембрана емкости 9,10. Кроме того, это измерение допуска обеспечивает проводимости мембраны и поры слияния проводимость во время экзоцитоза события 3. Как эта техника предоставил уникальный инструмент на установления единых-пузырек кинетики во экзоцитоза, наша лаборатория недавно применил эту концепцию для обнаружения эндоцитоз одиночных пузырьков 11,12.
Наши конкретные интерес клатрин-эндоцитоз (CME), который был рассмотрен в качестве основного компонента домашнего хозяйства во многих клетках 13 и в качестве основного пути для синаптических пузырьков эндоцитоза в нейронных терминалов 14,15. CME, как известно, биологически важно, однако, его кинетика остаются не до конца понятны связи с техническими ограничениями в мониторинге особых эндоцитотических события. Учитывая сходство в exocytic механизмов между хромаффинных клеток и нейронов 1, это плausible, что механизмы деления клеток в хромаффинных может, вероятно, относится к эндоцитоза синаптических пузырьков в нейронах. Измерения емкости сотовых подключением были использованы для мониторинга отдельных эндоцитотических события и анализа кинетики деления, которые большинство методов не в состоянии разрешить. В наших сотовых подключением записей, синусоида с частотой 20 кГц накладывается на проведения потенциал, а выходной ток разделяется на проводимости мембраны в одном канале и мембраны емкости в другой канал от двухфазного синхронного усилителя 16- 18. Из изменений в мембранной проводимости и емкости, можно рассчитать кинетики деления порами, что, вероятно, соответствует трубчатой шеи мембраны, которая соединяет интернализации пузырек в плазматическую мембрану до везикул отсечки. В совокупности эта техника дает нам возможность изучить нормативные механизмы пузырьков деления во время CME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура была проведена в соответствии с руководящими принципами Национальных Институтов Здоровья, утвержденный уходу и использованию комитета животных из Университета Иллинойса в Чикаго на.
1. Решения и Культура Медиа Препараты
- Держите все решения при -20 ° С в течение до шести месяцев. Держите питательных сред при 4 ° С в течение 3 месяцев.
- Приготовьте 100 мл культуральной среды путем смешивания 1 мл пера-Strep раствора и 1 мл ITSX (инсулин-трансферрин-Селен-надбавок) до 100 мл DMEM.
- Готовят раствор фермента путем смешивания 250 мл DMEM, 2,5 мл 100 мМ CaCl 2 и 2,5 мл 50 мМ ЭДТА.
- Готовят раствор инактивации путем смешивания 225 мл DMEM, 25 мл FBS, 625 мг альбумина и 625 мг ингибитор трипсина.
- Приготовьте раствор Локка 154 мМ NaCl, 5,6 мМ KCl, 5,0 мМ HEPES, 3,6 мМ NaHCO3, 5,6 мМ глюкозы. Доводят рН до 7,3 с помощью NaOH.
- Подготовка поли-D-лизином (PDL) Раствор, содержащий 50 мг / мл. С помощью конечной концентрации 1 мг / мл для покрытия покровные.
- Подготовка внеклеточный раствор 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, 10 мМ HEPES-NaOH, и 10 мМ глюкозы. Доводят рН до 7,3 с помощью NaOH с осмолярности ~ 310 нмоль / кг.
- Подготовка пипетки раствор 50 мМ NaCl, 100 мМ TEACl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl 2, и 10 мМ HEPES. Отрегулируйте рН до 7,3 с помощью NaOH с осмолярности ~ 290 нмоль / кг.
2 надпочечников Изоляция
- Автоклав пару больших и малых ножницами рассечение и две пары щипцов. Надевайте перчатки во время всего процесса и поместите рассекает лоток на ведерке со льдом.
- Используйте мышей, принятые на День 0-3. Усыпить животных с CO 2 бака под давлением с последующей декапитацией.
- Использовать меньший набор ножницы, чтобы вырезать вниз по задней части щенка следующие позвоночника от Cervi кал в хвостовой части. Обязательно обрежьте поверхностно под кожей, а не проколоть в полость тела.
- Далее, корки от позвоночника так, чтобы мускулатура подвергается иметь четкое представление о позвоночнике. Отсюда, сделать transectional сокращение в шейного отдела спинного мозга, а затем сделать два параллельных разрезов по бокам позвоночника.
- С одной парой щипцов, занимающих основную часть животного, использовать другую пару щипцов, чтобы захватить позвоночник и отогните позвоночник до почки подвергаются.
- В этот момент, визуализировать надпочечники на верхней части почек. Затем осторожно переместите два желез от каждого животного в коническую трубку, заполненную раствором Локка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда железы будут придерживаться пинцетом. Если это так, мягко использовать другую пару щипцов, чтобы помочь в удалении желез от щипцов и в раствор в Локка. Железы могут храниться в этом состоянии в течение до 2 часов.
- В то же время, пузырь раствора фермента с 5% CO 2 + 95% O 2 в течение 15 мин перед использованием. Убедитесь, что уравновешивают решение превращается из яркого розового цвета в розовато / оранжевого цвета.
- Добавьте папаин в свеже барботируют раствора фермента до конечной концентрации 20-25 ед / мл. Инкубируйте каждую пару желез у каждого животного в течение 40-60 мин при 37 ° С в растворе фермента папаина с.
- Добавить 75% инактивации раствора в каждую пробирку и инкубируют при 37 ° С в течение еще 10 мин. Это инкубирование инактивирует фермент активности папаина.
- После 10 мин инкубации с инактивации решения, мягко передать желез во вновь помеченную пробирку и затем промыть железы 3x культуральной средой.
4 диссоциации клеток и покрытия
- После мытья, разместить два желез в 200 мкл культуральной среды, а затем аккуратно титруйте желез ивниз через наконечника пипетки с 200 мкл пипетки до тех пор, пока больше не большой кусок ткани в растворе.
Примечание: При титровании, поддерживать железы в нижней части трубки с направленной вниз силы от кончика пипетки 200 мкл и участвовать в ткань осторожно и медленно. Будьте уверены, чтобы использовать медленные, непрерывные удары, никогда не пипетки быстро или резким. - Добавление дополнительного 250 мкл культуральной среды, чтобы довести общий объем культуральной среды до 450 мкл.
- Пластина 60 мкл этой клеточной раствора, содержащего на каждый из семи 12 мм покровные PDL-пре-покрытием, которые размещены в 60 х 15 мм чашки для культивирования.
- После покрытием, положите блюдо в инкубатор, который установлен до 37 ° С и поддерживается с постоянным потоком / поставку 5% CO 2 в течение 30 мин, чтобы обеспечить условия для жизнеспособности клеток. После инкубации, мягко добавить 5 мл подогретого культуральной среды в блюдо культуры и вернуть блюдо обратно в инкубатор на 24 ч до клеток-атташед записи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, эти клетки могут быть использованы для электрофизиологических записей на срок до 4 дней.
5 Сотовый Идентификация и Gigaohm Seal Формирование
- Поместите 12 мм покровное в внеклеточный раствор. Поскольку весь надпочечники используются для клеточного препарата, смешать хромаффинных клетки (как правило, очень яркие с коричневатым / бежевый окраски и почти идеальной круглой формы (рисунок 1) в культуре с корковых клеток (более мелкие и более призрачной, чем хромаффинных клетки).
- Потяните патч пипетки в четыре этапа, используя программируемый P-97 съемник. Погрузите наконечник пипетки в расплавленный воск, который поможет уменьшить емкость стекла, а затем уволить ногтей чаевые "Blow-далеко" это воска изнутри пипетки.
Примечание: Если наполненный патч пипетки раствора, патч-пипетки обычно имеют сопротивление ~ 2 МОм. - Подойдите к патч пипетки близко к клетке с точностью в несколько метровicrons. Для достижения конфигурацию клеток-прилагается, посмотрите на слабое деформации клеток во время подхода патча пипетки ближе к камере. Нежный всасывание до ГОм печать не будет достигнута.
6. Сотовые подключением емкости Записи
- После ГОм печать раскрывается, сделать сотовые подключением записи с помощью усилителя EPC-7 плюс патч-зажим и замок усилитель аналогового двухфазный (см прилагаемую таблицу оборудования). Нанесите синусоиды с амплитудой 50 мВ (RMS) и частотой 20 кГц от усилителя блокировки в.
- Установите выходной фильтр усилителя блокировки в в 1 мс постоянной времени и 24 дБ. Установите фазу усилителя блокировки в таких, что временные изменения емкости, производимые нежных импульсов всасывающих появляются только в патч емкость (Im) следа, без проекции на патч проводимость (Re) следа (рис 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, видеть детали для калибровки системы в реФеренц 19. - Определить типичные изменения емкости от "вниз" шагов (рисунок 3).
ПРИМЕЧАНИЕ: твердый запись будет рассматриваться как "лестница" типа сходства со многими вниз шагов, что свидетельствует интернализации одиночные пузырьки. Процесс исправления служит в качестве механической стимуляции, так как текущее действие может быть, как правило, записанной в большинстве клеток. - Имя файлы в виде отдельных папок, включая дату: дд / мм / год и каждой записи клеток-прилагается в качестве своей собственной индивидуальной нумерации (XX) в этом файле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Жизнеспособность клеток и качество gigaohm печатью имеют решающее значение в определении качества записей клеток подключением емкости. Поэтому, очень важно, чтобы обеспечить эффективный и действенный клеточную культуру до электрофизиологических записей, и типичных жизнеспособных клеток показаны на рисунке 1. Практика и время будет полезно в достижении gigaohm печать с высоким качеством. Если можно четко видеть деформацию клеток, когда патч пипетки приближается ячейку, как описано в протоколе Шаг 5,3, есть больше шансов в получении высококачественного уплотнения. Рисунок 3 демонстрирует типичную запись мембраны емкости с несколькими сверху донизу шагов, связанных с один пузырек эндоцитоз.
Фигура 1.Примеры жизнеспособным надпочечников мыши хромаффинных клеток24 часа в сутки после клеточной культуре. Стрелки указывают на 3 жизнеспособных хромаффинных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок регулировка 2 Фаза в записях клеток-прилагается. С настройкой начальной фазы, нежные всасывающие причиной временного изменения как емкости (Im) и проводимости (Re) следов и проекции в Re следа гасятся с помощью 23 ° фазы переложить. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3 Типичная сELL-прилагается емкость записи с несколькими вниз шагов, связанных с одной пузырьков эндоцитоза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Измерения емкости Сотовые подключением требуют несколько критических шагов для того, чтобы успешно получить записи с высоким качеством: 1) жизнеспособные и здоровые клетки, полученные из надпочечников; 2) PDL покрытием из покровных; 3) формирование gigaohm уплотнение; 4) уровень шума системы; и 5) фаза коррекции.
Для животных хирургии, модификации можно потенциально делают это, чтобы отрегулировать хирургический подход, который наиболее соответствует ловкости и для предотвращения повреждения во время вскрытия. Кроме того, достаточно практика по локализации и удаления надпочечников необходимо как клетки, которые будут использованы для электрофизиологических записей поступать исключительно из мозгового вещества надпочечников. Для ферментативного расщепления, очень важно, чтобы уравновесить ферментного раствора путем пропускания раствора с 5% CO 2 + 95% О 2. Будьте уверены, что трубка подключена к цилиндру достаточно и плотно, без утечек. Кроме того, убедитесь, что конец ян раствор должным образом размещены в течение всего 15 минут времени восходящей; это может быть достигнуто с размещением в конец иглы 20 G, который был затупленных на конце трубки таким образом, чтобы направлять поток воздуха соответственно. Кроме того, дополнительное время для этого шага не повредит, пока поток воздуха не настолько сильный, чтобы переполнить решение в трубке. Сотовый титрования является еще одним важным компонентом, который возьмет практику. Большинство клеток могут быть повреждены, если в течение-титруют; наоборот, если титрование не хватает, там будет очень мало одиночные изолированные клетки отделены от тканей. Для эффективного титрование, использовать мкл наконечника 200 пипетки пипетки вверх и вниз 7-8x, убедившись, что железы осторожно прошел через пипетки 200 мкл, как вы титрование.
Для PDL покрытием, всегда можно продлить время инкубации в PDL на покровные до 3 часов, чтобы обеспечить достаточное покрытие покровные. PDL покрытие имеет решающее значение для хромаффинных клетки приложитьчтобы и растут на покровные после клеточной обшивки. Если PDL покрытия не является достаточным, большинство клеток будут отделяться от покровного стекла, что сделает формирование gigaohm уплотнение трудно.
Сотовые подключением записи всегда могут быть изменены и улучшены, так как этот метод исправления является выделенным процессом. Нежный и тонкий всасывания имеет решающее значение в содействии формированию gigaohm уплотнения, когда патч пипетки и клеток находятся в контакте. Слишком много всасывания уничтожит патч наконечник-клеток контакт и в экстремальных ситуациях, клетки могут быть всасывается в патч пипетки. Это будет очень легко наблюдать на экране осциллографа, изменив в конфигурации цельных клеток или очень минимальным сопротивлением, возвращающегося в очень большой один; практика имеет первостепенное значение для получения образования высокого качества gigaohm уплотнения.
В то время как высокая устойчивость уплотнение имеет решающее значение для снижения уровня шума в записях клеток-прилагается, следующие два шага такжеВажно, чтобы уменьшить уровень шума, чтобы разрешить одиночные эндоцитотических событий: (1) В патч пипетки раствора, TEACl используется, чтобы блокировать напряжения закрытого К + каналов; (2) наконечник пипетки покрыта липким воск и воск внутри наконечника пипетки могут быть удалены путем полировки тепла.
В то время как регулировка фазы подробно в Протоколе шагом 6,2 важно установить начальную фазу для записи, этот шаг не может быть идеальным. Таким образом, важно, чтобы выполнить коррекцию фазы при анализе деления пор для отдельных событий. На мембранный потенциал покоя -65 мВ, цельноклеточные записи показывают, что типичный мыши хромаффинных клетка имеет входную емкость 5 пФ и входное сопротивление 500 МОм, которая вычисляет мембраны проводимость мыши хромаффинных клеток как ~ 0,4 пс / FF. Это означает, что эндоцитотический мероприятие с размером емкости 1 FF приведет к чистым убытком в мембранной проводимости ~ 0,4 пс. Это значение можно пренебречь по сравнению с по крайнейypical 50-100 пСм изменение проводимости мембраны связано с эндоцитотическом закрытия деления пор в клеточных подключением записей. Поэтому, мы уверены, что наша фазовой коррекции позволяет нам регулировать базовую проводимости мембраны, что замыкание до и после деления пор на том же уровне; этот процесс может принести <1% ошибку в нашем анализе данных.
Таким образом, протокол, описанный здесь, показывает, как клеточно-прикреплен записи емкости могут быть использованы для мониторинга одного пузырьков эндоцитоз с помощью мыши хромаффинных клетки в качестве модельной системы. Эта техника позволяет анализировать механизмов регулирования пузырьков деления в ходе эндоцитоза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm |
References
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).
- Lindau, M., Alvarez de Toledo, G.
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389, 509-512 (1997).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration. Biophys J. 75, 53-59 (1998).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel. The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).
- Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release. Nat Methods. 2, 699-708 (2005).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore. Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).
- Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).
- Yao, L. H., et al. Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).
- Yao, L. H., et al. Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).
- Murthy, V. N., De Camilli, P.
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Rosenboom, H., Lindau, M. Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).
- MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells. Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).
- Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z). J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).
- Debus, K., Lindau, M. Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles. Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).
