Introduction
시냅스 전달은 신경 전달 물질 - 함유 소포 시냅스 세포 외 유출에 의해 매개되고, 이러한 소포는 장기적으로 신경의 통신을 유지하기 위해 신경 말단 내의 지방 세포 내 이입 재활용을 거쳐야한다. 시냅스 소포 사이클 전체적으로 셀룰러 통신의 더 나은 이해를 향해 필수적인 토대 구성 분자 기계 이해, 뇌 시냅스 전달의 중요한 역할을 감안. 셀 모델 시스템 중 부신하는 chromaffin 세포는 시냅스 소포 재활용의 기초가되는 분자 기계에 관하여 가장 정확한 통찰력의 일부를 제공하고 있습니다. 세포 외 유출, 신경 전달 물질 방출의 마지막 단계는, 대단히 공부 부신하는 chromaffin 셀 1,2를 사용하여 조사되었다. 사실, 분비 과립의 형성, 타겟팅, 도킹 및 융합을 조율 분자 선수 대부분 기인 DIV의 애플리케이션에 확인 된하는 chromaffin 세포 하나에서 ERSE 기술. 더욱이, 세포 외 유출에 관여하는 단백질의 단일 기계 소포 해상도를 허용 할 수있는 기회를 제공하여, 셀하는 chromaffin 소포 융합의 3 문제를 해결하기 위해 강력한 모델 남아있다.
세포 부착 된 용량 측정은 첫째 세포 외 유출 세 동안 단일 소포 융합 해결에 사용되었다. ~ 60 nm의 직경이 입증 된만큼 작은 소포 세포 외 유출은 세포 부착 구성 4-7에서 패치 클램프 기술로 세포막 어드미턴스 측정에 의해 검출된다. 어드미턴스는 회로 또는 장치에 전류가 흐르도록하는 방법을 쉽게의 척도로서 정의된다; 이것은 임피던스의 역이다. 따라서, 어드미턴스의 측정은 막의 커패시턴스의 이해를 제공한다. 이는 세포막 소포 막에 혼입함으로써 달성된다; 이 법인은 표면의 변화를 보여준다지역 8. 각 융합 막 소포는 커패시턴스 9,10에서 단계적으로 증가시킨다. 또한,이 측정은 어드미턴스 막 컨덕턴스 및 이벤트 exocytotic 3 중 융합 기공 컨덕턴스를 제공한다. 이 기술은 세포 외 유출 동안 단일 소포 반응 속도를 식별에 고유 한 도구를 제공하고, 우리의 연구소는 최근 하나의 소포 11, 12의 엔도 사이토 시스를 감지하는이 개념을 적용하고있다.
우리의 특정 관심이 많은 셀 (13)과의 연결 단자 (14, 15)에서 시냅스 소포 엔도 시토 시스에 대한 주요 경로로 기본적인 가사 구성 요소로 간주하고있다 clathrin 매개 엔도 시토 시스 (CME)입니다. CME는하지만, 그 반응 속도로 인해 단일 세포 내 이입 된 사건을 검사하는 경우에 기술적 인 제한으로 잘 이해되지 남아, 생물학적으로 중요한 것으로 알려져있다. 하는 chromaffin 세포와 신경 세포 일 사이 exocytic 메커니즘의 유사성을 감안할 때, 그것이 와줘하는 chromaffin 세포 분열 메커니즘 가능성이 뉴런에서 시냅스 소포 엔도 시토 시스에 적용 할 수 있음을 ausible. 세포 부착 된 용량 측정은 각각의 세포 내 이입 이벤트를 모니터링하고 대부분의 방법으로 해결할 수없는 핵분열 반응 속도를 분석하는 데 이용되어왔다. 우리의 세포 - 부착 기록에서, 20 kHz에서 사인파 들고 잠재적 겹쳐되며, 출력 전류는 증폭기 로크에 두 단계에서 다른 채널에서 하나의 채널과 멤브레인 커패시턴스 막 컨덕턴스로 분리 16 18. 멤브레인 컨덕턴스 및 커패시턴스의 변화로부터, 하나의 가능성 소포 핀치 오프 이전 원형질막에 내재화 소포 연결 관형 막 목에 대응 핵분열 기공의 동력학을 계산할 수있다. 종합적으로,이 기술은 우리에게 CME 동안 소포 분열의 규제 메커니즘을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다.
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Protocol
주 : 시카고 일리노이 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 전체 절차는 국립 보건원 (NIH)의 지침에 따라 실시 하였다.
1 솔루션 및 문화 미디어 준비
- 최대 6 개월 -20 ° C에서 모든 솔루션을 유지합니다. 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 배양 배지를 보관하십시오.
- DMEM 100 ml의 ITSX (인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 보충제)의 한 펜 연쇄상 구균의 수용액 1 ml에 혼합하여 배양 배지 100 ㎖를 준비합니다.
- DMEM 250 ㎖, 100 MM의 염화칼슘이 2.5 ml의 50 mM의 EDTA의 2.5 ML을 혼합하여 효소 솔루션을 준비합니다.
- DMEM의 225 ML, FBS의 25 ML, 알부민 625 ㎎, 625 mg을 트립신 억제제를 혼합하여 불 활성화 솔루션을 준비합니다.
- 154 밀리미터의 NaCl, 5.6 밀리미터의 KCl, 5.0 mM의 HEPES, 3.6 mM의 NaHCO3를, 5.6 mM의 포도당의 로크의 솔루션을 준비합니다. NaOH로 7.3로 pH를 조정합니다.
- 50 ㎎ / ㎖의 폴리-D-라이신 (PDL) 솔루션을 준비합니다. 코트 커버 슬립을 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 사용한다.
- 140 mM의 NaCl을, 5 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘 2, 1 mM의 MgCl2를, 10 mM의 HEPES-NaOH를, 10 mM의 포도당의 세포 외 용액을 준비합니다. ~ 310 nmol의 / kg의 삼투압과 NaOH로 7.3로 pH를 조정합니다.
- 50 mM의 NaCl을, 100 mM의 TEACl, 5 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘 2, 1 mM의 MgCl2를, 10 mM의 HEPES의 피펫 솔루션을 준비합니다. ~ 290 nmol의 / kg의 삼투압과 NaOH로 7.3으로 산도를 조정합니다.
2 부신 격리
- 크고 작은 해부 가위와 집게 이쌍 한 쌍의 압력솥. 전체 과정 동안 장갑을 착용하고 얼음 양동이에 해부 트레이를 배치합니다.
- 주 0-3 일에 찍은 마우스를 사용합니다. 잘린 다음에 가압 CO 2 탱크와 동물을 안락사.
- cervi에서 척추 다음 강아지의 뒷면을 줄이기 위해 위의 작은 세트를 활용 칼은 지역을 꼬리 지느러미합니다. 피부 아래 표면적으로 잘라 체강 내에 뚫지해야합니다.
- 다음으로, 멀리 척추에서 껍질 피부가 근육은 척추의 명확한 전망이 노출되도록. 여기에서 자궁 경부 척수에서 transectional 컷을 한 후 척추의 측면을 따라 두 개의 평행 한 컷을합니다.
- 동물의 본체를 들고 집게 일쌍으로 척추를 잡아 신장이 노출 될 때까지 척추를 벗겨 집게의 다른 쌍을 사용합니다.
- 이 때, 신장의 위쪽에있는 부신을 시각화. 그런 다음 조심스럽게 로크의 솔루션으로 가득 원뿔 튜브에 각 동물에서이 샘을 배치합니다.
참고 : 때때로 땀샘은 집게에 충실 할 것이다. 이 경우, 부드럽게 집게로부터 로크의 용액에 땀샘의 제거에 도움이 다른 한 쌍의 집게를 사용한다. 땀샘 2 시간까지이 상태에서 유지 될 수있다.
- 한편, 거품을 15 분 동안 5 % CO 2 + 95 % O 2 효소액 사용 전에. 평형 솔루션은 분홍빛 / 오렌지 색상에 밝은 핑크 색상에서 켜지는지 확인합니다.
- 2,025 단위 / ㎖의 최종 농도 갓 버블 효소액 파파인 추가. 파파인으로 효소 용액에 37 ° C에서 40 ~ 60 분 동안 각 동물에서 동맥의 각 쌍을 품어.
- 각 튜브에 불 활성화 솔루션의 75 %를 추가하고 또 다른 10 분 동안 37 ° C에서 배양. 이 배양은 파파인 효소의 활성을 불 활성화.
- 불 활성화 용액으로 10 분 배양 후, 부드럽게 새로 레이블 튜브로 땀샘을 전송 한 후 샘은 문화 미디어 3 배 씻는다.
4 셀 해리와 도금
- 세안 후, 배양 배지의 200 μL에이 글 랜드 위치하게 한 후, 부드럽게 분비를 적정하고다운 200 μL 피펫 피펫 팁을 통해 더 이상 용액 조직의 큰 조각이 없을 때까지.
NOTE : 적정하면, 200 μL 피펫 팁으로부터 하방으로의 힘으로 튜브의 하단에 분비를 유지 조심스럽게 천천히 결합 조직. 느린 연속 스트로크를 사용하여 특정 수는 결코 빠르거나 갑작스러운 피펫 없습니다. - 450 μL까지 배양 배지의 전체 볼륨을 가지고 추가로 250 ㎕의 문화 매체를 추가합니다.
- 플레이트 60 X 15mm 배양 접시에 배치 일곱 12mm PDL 미리 코팅 된 커버, 각각에이 세포 함유 용액의 60 μL.
- 일단 도금, 세포 생존을위한 환경을 보장하기 위해 30 분 동안 5 % CO 2의 꾸준한 흐름 / 공급 37 ° C로 설정되고 유지되는 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 배양 후, 부드럽게 배양 접시에 미리 예열 문화 매체의 5 mL를 넣고 24 시간 동안 인큐베이터에 다시 접시를 반환 세포 무관 이전D 녹음.
주 : 일반적으로, 세포가 최대 4 일 동안 전기 생리 레코딩에 사용될 수있다.
(5) 셀 식별 및 기가 옴 인감 형성
- 세포 외 용액에 12mm coverslip에 놓습니다. 전체 부신 셀 제조에 사용되기 때문에, 대뇌 피질의 세포 (작고) 셀을하는 chromaffin보다 디머와 문화에하는 chromaffin 세포 (갈색 / 베이지 색상과 완벽에 가까운 원형 형태로 일반적으로 매우 밝은 (그림 1)을 섞는다.
- 프로그램 P-97 풀러를 사용하여 네 단계의 패치 피펫을 당깁니다. 다음 유리의 용량을 줄이고 데 도움이됩니다 녹은 왁스로 피펫 팁을 찍어은 피펫 팁의 안쪽에서 끝이 "불어 멀리"하는 폴란드어이 왁스를 발생.
참고 : 패치 피펫 솔루션 가득 할 때, 패치 피펫은 일반적으로 1 ~ 2 MΩ의 저항이있다. - 몇 m 내에서 세포에 가까운 패치 피펫 접근icrons. 세포 부착 된 구성을 달성하기 위해, 셀에 가까운 패치 피펫의 접근 중에 약간 변형 셀을 찾는다. GΩ 시일이 달성 될 때까지 부드러운 흡입을 적용합니다.
6 셀 첨부 용량 녹음
- GΩ 시일이 계시되면 EPC-7 플러스 패치 - 클램프 증폭기의 사용을 통해 세포 부착을 녹음하고 두 상 아날로그 락 - 인 증폭기 (장비 첨부 표 참조). 잠금 증폭기에서 50 MV (RMS)의 진폭과 주파수 20kHz의 사인파를 적용합니다.
- 1 밀리 초 시정 및 24dB의 종속 증폭기의 출력 필터를 설정합니다. 잠금 증폭기와 같은 부드러운 흡입 펄스에 의해 생성 된 일시적인 정전 용량 변경 사항은 패치 전도도 (재) 추적에 투영법으로 패치 용량 (임) 추적에서 나타나는 (그림 2)의 위상을 설정합니다.
참고 : 재에서 시스템의 교정에 대한 세부 정보를 참조하십시오(19) 전파 방해. - "아래로"단계 (그림 3)에 의해 일반적인 정전 용량의 변화를 확인합니다.
참고 : 고체 기록이 하나의 소포를 내면화 나타냅니다 많은 아래 단계를 "계단"형 닮은으로 볼 수 있습니다. 패치 프로세스는 동작 전류는 일반적으로 대부분의 세포에서 기록 될 수 있기 때문에 기계적 자극의 역할을한다. - 해당 파일 내에서 mm / 일 / 년 및 자신의 개인 번호 (XX) 등의 각 셀에 연결된 기록 : 개별 날짜 등의 폴더로 파일의 이름을 지정합니다.
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Representative Results
세포 생존 및 기가 옴 시일의 품질은 셀에 연결된 커패시턴스 레코딩의 품질을 결정하는데 중요하다. 따라서, 종래 전기 생리 레코딩, 및 일반적인 생존 세포로도 1에 도시되어 효과적이고 효율적인 세포 배양을 조달하는 것이 중요하다. 연습 시간은 고품질 기가 옴 시일을 달성하는데 도움이 될 것이다. 하나 명확 프로토콜 단계 5.3에 기재된 바와 같이 패치 피펫 셀 다가 세포 변형을 알 수 있다면, 고품질의 도장을 얻는 더 나은 기회가있다. 3과 관련된 여러 아래쪽 단계와 막의 커패시턴스의 일반적인 기록을 보여주는 도표 하나의 소포 엔도 시토 시스.
가능한 마우스 부신하는 chromaffin 세포의 그림 1 예세포 배양 후 24 시간. 세 생존하는 chromaffin 세포에 화살표 지점. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
세포 부착 녹음 그림 2 위상 조정. 초기 단계 설정으로 부드러운 흡입구가 과도 모두 정전 용량 (IM) 및 전기 전도도 (재) 흔적의 변화, 그리고 다시 추적에 돌기가 발생할는 23 ° 위상에 의해 취소 이동. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 전형적인 C하나의 소포 엔도 시토 시스와 관련된 다수의 아래 단계로 기록 엘 부착 된 용량. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
세포 부착 커패시턴스 측정이 성공적으로 고품질 레코딩 얻기 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요 : 부신으로부터 제조 1) 실용적이고 건강한 세포; 커버 슬립의 2) PDL 코팅; 3) 기가 옴 씰 형성; 4) 시스템의 노이즈 레벨; 5) 위상 보정.
동물의 수술 한 잠재적 수 변형이 가장 적합 기용으로 수술 접근을 조정하고, 박리시 손상을 방지하는 것이다. 전기 생리 녹음을 위해 이용 될 세포가 부신 수질에서 독점적으로 와서 또한, 위치 및 부신을 제거하기에 충분한 연습은 필수적입니다. 효소 분해의 경우, 5 % CO 2 + 95 % O 2 버블 링시켜 용액을 효소 용액을 평형화 중요하다. 실린더에 연결된 튜브가 더 누수 충분하고 꽉 것을 확신합니다. 또한 반드시 그 끝 난N 용액 적절히 전체 15 분 동안 버블 링에 배치되고; 이 적절히 공기 흐름을 지시하도록 상기 튜브의 단부에 평활화 된 20 G 바늘 끝 배치로 달성 될 수있다. 또한,이 단계에 대한 추가 시간이 튜브에서 솔루션을 오버 플로우로 공기 흐름이 너무 강력 아니므로 너무 오래 해치지 않을 것입니다. 셀 적정 연습을 또 다른 중요한 구성 요소입니다. 오버 적정 경우 세포의 대다수가 손상 될 수있다; 적정에 충분하지 않다면, 반대로, 조직으로부터 해리 거의 단일 절연 세포가있을 것이다. 효과적으로 적정하려면 적정으로 분비 부드럽게 200 μL 피펫 팁을 통해 전달됩니다 확인하고, 아래로 7-8x 최대 피펫 200 μL 피펫 팁을 사용합니다.
PDL 코팅의 경우, 하나는 항상 커버 슬립의 충분한 코팅을 보장하기 위해 3 시간까지 커버 슬립에 PDL의 배양 시간을 연장 할 수있다. PDL 코팅 부착 세포를하는 chromaffin 중요하다과에하면 세포 도금 후 커버 슬립에 성장합니다. PDL 코팅이 충분하지 않은 경우, 세포의 대부분은 기가 옴 밀봉 형성을 어렵게한다 커버 슬립으로부터 분리 될 것이다.
패칭 기법은 전용 과정이므로 세포 부착 녹음 항상 수정되고 개선 될 수있다. 부드러운 미묘한 흡입 패치 피펫 세포가 접촉 할 때 기가 옴 밀봉 형성을 촉진하는데 중요하다. 너무 많은 흡입 패치 팁 세포 접촉을 파괴하고 극단적 인 경우에, 세포는 패치 피펫으로 흡입 될 수있다. 이것은 아주 쉽게 전체 셀 구성으로 변경하거나 하나의 매우 큰으로 돌아 아주 최소한의 저항 오실로스코프에서 관찰됩니다; 연습은 높은 품질의 기가 옴 씰 형성을 얻기 위해 가장 중요합니다.
높은 밀봉 성이 세포 부착에 녹음 잡음 레벨을 최소화하는 것이 중요하지만, 다음과 같은 두 단계는 아르단일 세포 내 이입 이벤트를 해결하는 노이즈 레벨을 감소하는 것이 중요 : (1) 패치 피펫 용액, TEACl은 전압 게이트 된 K + 채널을 차단하기 위해 이용된다; (2) 피펫 팁은 스티커 왁스로 피복되어 있으며 피펫 팁 내부의 왁스가 가열 연마에 의해 제거 될 수있다.
프로토콜 단계 6.2에 상세히 위상 조정이 기록에 대한 초기 위상을 설정하는 것이 중요하지만,이 공정은 이상적이지있다. 따라서, 각각의 이벤트에 대한 분열 기공 분석에서 위상 보정을 수행하는 것이 중요하다. -65 MV의 휴지 막 전위에서, 전체 셀 녹음 전형적인 마우스하는 chromaffin 세포로서 마우스하는 chromaffin 세포의 막 컨덕턴스 ~를 계산 5 pF의의 입력 커패시턴스 및 500 MΩ의 입력 저항을 갖는 것을 보여준다 0.4 PS / FF. 이것은 한 FF의 용량 크기의 세포 내 이입 이벤트가 ~ 0.4 P의 막 전도도의 순 손실됩니다 것을 의미한다. 이 값에 비해 무시할ypical 50 ~ 100 피코 막 전도도 변화는 세포 부착 녹화에서 세포 내 이입 핵분열 기공 폐쇄와 관련. 따라서, 우리는 우리의 위상 보정 우리는 전후 핵분열 기공 폐쇄 같은 수준에 있음을 막 전도의 기준을 조정할 수 있습니다 확신합니다; 이 프로세스는 우리의 데이타 분석으로 <1 %의 오차를 가져올 수있다.
요약하면, 여기에 설명 된 프로토콜은 세포 부착 커패시턴스 녹화가 모델 시스템으로하는 chromaffin 마우스 세포를 이용하여 하나의 엔도 사이토 시스 소포를 모니터링하는 데에 이용 될 수 있는지 보여준다. 이 기술은 하나의 엔도 시토 시스 동안 소포 분열에 대한 규제 메커니즘을 분석 할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm |
References
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).
- Lindau, M., Alvarez de Toledo, G.
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389, 509-512 (1997).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration. Biophys J. 75, 53-59 (1998).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel. The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).
- Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release. Nat Methods. 2, 699-708 (2005).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore. Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).
- Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).
- Yao, L. H., et al. Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).
- Yao, L. H., et al. Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).
- Murthy, V. N., De Camilli, P.
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Rosenboom, H., Lindau, M. Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).
- MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells. Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).
- Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z). J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).
- Debus, K., Lindau, M. Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles. Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).
