Introduction
Synaptisk transmission medieres af exocytose af neurotransmitter-holdige synaptiske vesikler, og disse vesikler skal gennemgå lokal endocytiske genbrug inden nerveterminalen at opretholde neuronal meddelelse på lang sigt. I betragtning af den afgørende rolle, som synaptisk transmission i hjernen, forståelse af det molekylære maskineri, der udgør det synaptiske vesikel cyklus er et vigtigt fundament i retning af en bedre forståelse i cellulær kommunikation som helhed. Blandt celle modelsystemer har adrenale chromaffinceller celle billede nogle af de mest definitive indsigt i molekylære maskineri underliggende synaptiske vesikel genanvendelse. Exocytose, det sidste skridt i neurotransmitterfrigivelse er blevet uhyre studeret og undersøgt ved hjælp af den adrenale kromaffine celle 1,2. Faktisk har de fleste af de molekylære spillere, der orkestrere dannelse, målretning, docking, og fusion af sekretoriske granulat blevet identificeret på grund af anvendelsen af divErse teknikker i kromaffinceller 1. Desuden ved at give en mulighed for at give mulighed for enkelt-vesikel opløsning af proteinet maskiner involveret i exocytose, den chromaffinceller celle fortsat er en stærk model til at løse spørgsmålene om vesikelfusion 3.
Cell-attached kapacitansmålinger blev først anvendt i løsningen enkelt vesikelfusion under eksocytose 3. Exocytose af vesikler så små som ~ 60 nm i diameter er blevet påvist at blive detekteret af cellemembran adgangskort målinger med patch-clamp-teknik i cellen vedlagte konfiguration 4-7. Optagelse er defineret som et mål for, hvor let et kredsløb eller enhed vil tillade en strøm til at løbe; Det er det modsatte af impedans. Således adgangskrav målinger giver en forståelse af membranen kapacitans. Dette opnås ved inkorporering af vesikulære membran ind i plasmamembranen; denne integration afslører ændringer i overfladenområde 8. Hver fusing vesikel forårsager en trinvis stigning i membran kapacitans 9,10. Derudover denne optagelse Målingen giver membranen ledningsevne og fusion pore ledningsevne under en exocytotiske begivenhed 3. Da denne teknik har givet et unikt værktøj til at identificere enkelt-vesikel kinetik under exocytose, har vores laboratorium for nylig anvendt dette begreb til at detektere endocytose af enkelte vesikler 11,12.
Vores særlige interesse er clathrin endocytose (CME), der er blevet betragtet som en grundlæggende husholdning komponent i mange celler, 13 og som den vigtigste vej for synaptisk vesikel endocytose i neuronale terminaler 14,15. CME er kendt for at være biologisk vigtige dog fortsat sine kinetik ikke godt forstået på grund af tekniske begrænsninger i overvågning af ental endocytiske begivenheder. På grund af lighederne i eksocytiske mekanismer mellem kromaffinceller og neuroner 1, er det plausible at fission mekanismer kromaffinceller sandsynligvis kan finde anvendelse på synaptiske vesikel endocytose i neuroner. Cellen-attached kapacitansmålinger er blevet udnyttet til at overvåge individuelle endocytiske begivenheder og analysere fission kinetik, som de fleste metoder er i stand til at løse. I vores celle-attached optagelser, er en sinusbølge på 20 kHz overlejret over bedrift potentiale, og den nuværende produktion er opdelt i membran ledningsevne i den ene kanal og membran kapacitans i den anden kanal fra en tofaset lock-in forstærker 16- 18. Fra ændringer i membranen ledningsevne og kapacitans, kan man beregne kinetikken af fission pore, som sandsynligvis svarer til den rørformede membran hals, der forbinder internaliserende vesikel til plasmamembranen før vesikel afsnøring. Kollektivt, denne teknik giver os mulighed for at undersøge de regulatoriske mekanismer vesikel fission under CME.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Hele proceduren blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra National Institutes of Health, som er godkendt af Animal Care og brug Udvalg fra University of Illinois i Chicago.
1. Opløsninger og Kultur Medier Forberedelser
- Hold alle de løsninger ved -20 ° C i op til seks måneder. Hold dyrkningsmediet ved 4 ° C i op til 3 måneder.
- Forbered 100 ml dyrkningsmedier ved at blande 1 ml pen-strep-løsning og 1 ml ITSX (Insulin-Transferrin-Selen-Tilskud) til 100 ml med DMEM.
- Forbered enzymopløsning ved at blande 250 ml DMEM, 2,5 ml af 100 mM CaCl2, og 2,5 ml af 50 mM EDTA.
- Forbered inaktivering opløsning ved at blande 225 ml DMEM, 25 ml FBS, 625 mg albumin og 625 mg trypsininhibitor.
- Forbered en Lockes opløsning af 154 mM NaCl, 5,6 mM KCI, 5,0 mM HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM glucose. PH justeres til 7,3 med NaOH.
- Forbered en poly-d-lysin (PDL) opløsning af 50 mg / ml. Brug af en slutkoncentration på 1 mg / ml til at belægge dækglas.
- Forbered en ekstracellulær opløsning af 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH og 10 mM glucose. PH justeres til 7,3 med NaOH med en osmolaritet på ~ 310 nmol / kg.
- Forbered en pipette opløsning af 50 mM NaCI, 100 mM TEACl, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2 og 10 mM HEPES. PH justeres til 7,3 med NaOH med en osmolaritet på ~ 290 nmol / kg.
2. binyrerne Isolering
- Autoklavér et par store og små dissektion saks og to par pincet. Brug handsker under hele processen, og placer dissekere bakke på en isspand.
- Brug mus truffet på dag 0-3. Aflive dyrene med en tryksat CO2 tanken efterfulgt af halshugning.
- Udnyt mindre sæt saks til at skære ned på bagsiden af hvalpen efter rygsøjlen fra Cervi CAL til kaudal region. Vær sikker på at skære overfladisk under huden og ikke punkteres i kroppen hulrum.
- Dernæst skræl hud væk fra ryggen, således at muskulaturen er udsat for at have et klart billede af rygsøjlen. Herfra gøre en transectional snit på den cervikale rygmarv og derefter foretage to parallelle snit langs siderne af rygsøjlen.
- Med et par pincet holder hoveddelen af dyret, skal du bruge det andet par pincet til at få fat i rygsøjlen og skræl tilbage rygsøjlen indtil nyrer er udsat for.
- På dette tidspunkt, visualisere binyrerne på toppen af nyrerne. Derefter forsigtigt placere to kirtler fra hvert dyr i en konisk rør fyldt med Lockes opløsning.
BEMÆRK: Nogle gange kirtler vil holde sig til tangen. Hvis dette er tilfældet, forsigtigt bruge en anden tang for at hjælpe med fjernelse af kirtler fra tangen og ind i Lockes opløsning. Kirtler kan holdes i denne tilstand i op til 2 timer.
- I mellemtiden boble enzymopløsningen med 5% CO2 + 95% O2 i 15 minutter før brug. Sørg for, at den ligevægt opløsningen bliver fra en lys rosa farve i rosa / orange farve.
- Tilsæt papain til frisk bobles enzymopløsning ved en slutkoncentration på 20-25 enheder / ml. Inkuber hvert par af kirtler fra hvert dyr 40-60 minutter ved 37 ° C i enzymopløsningen med papain.
- Tilføj 75% af inaktivering opløsning til hvert rør og inkuberes ved 37 ° C i yderligere 10 minutter. Denne inkubation inaktiverer enzymaktiviteten papain.
- Efter 10 minutters inkubation med inaktivering løsning, forsigtigt overføre kirtler i en nyligt mærket rør og derefter vaske kirtler 3x med kulturmedier.
4. celledissociationsbuffer og Belægning
- Efter vask, placere de to kirtler i 200 pi af dyrkningsmedier og derefter forsigtigt titreres kirtler op ogned gennem pipettespidsen med en 200 pi pipette, indtil der ikke længere er et stort stykke af væv i opløsningen.
BEMÆRK: Når titrering, vedligeholde kirtler i bunden af røret med en nedadrettet kraft fra 200 ul pipettespidsen og engagere vævet forsigtigt og langsomt. Vær sikker på at bruge langsomme, kontinuerlige strøg aldrig pipettering hurtigt eller pludselige. - Tilføj en ekstra 250 ul kultur medier til at bringe det samlede volumen af kultur medier op til 450 pi.
- Plade 60 ul af denne opløsning celleholdige på hver af syv 12 mm PDL-præ-overtrukne dækglas, som er placeret i en 60 x 15 mm dyrkningsskål.
- Når forgyldt, anbringes fadet i rugemaskine, der er indstillet til 37 ° C og holdes med en lind strøm / forsyning af 5% CO2 i 30 minutter for at sikre et miljø for cellernes levedygtighed. Efter inkubation forsigtigt tilsættes 5 ml forvarmet kultur medier i dyrkningsskålen og returnere skålen tilbage i inkubatoren i 24 timer forud for celle-attached optagelser.
BEMÆRK: Typisk kan cellerne anvendes til elektrofysiologiske optagelser i op til 4 dage.
5. Cell Identifikation og gigaohm Seal Dannelse
- Placer 12 mm dækglas i ekstracellulære løsning. Da hele binyrerne anvendes til cellepræparation, blande kromaffinceller (typisk meget lyse med en brunlig / beige farve og en nær perfekt cirkulær form, (figur 1) i kultur med kortikale celler (mindre og svagere end kromaffinceller).
- Træk patch pipetter i fire faser ved hjælp af en programmerbar P-97 aftrækker. Dyp pipettespidsen i en smeltet voks, hvilket vil bidrage til at reducere kapaciteten af glasset, og derefter fyre polere spidsen for "blow-away" denne voks fra indersiden af pipettespidsen.
BEMÆRK: Når fyldt med patch pipette løsning, patch pipetter har typisk en modstand på ~ 2 MOhm. - Approach patch-pipetten tæt til cellen inden for flere microns. For at opnå en celle-tilsluttet konfiguration, ser for enhver lille celle deformation under tilgangen af plasteret pipette tættere på cellen. Anvend mild sugning indtil en GQ forsegling er opnået.
6. Cell-Vedhæftet Kapacitans Optagelser
- Når en GQ sæl er afsløret, gør celle-attached optagelser ved brug af et EPS-7 plus patch-clamp forstærker og en to-faset analog lock-in forstærker (se vedlagte tabel af udstyr). Påfør en sinusbølge med amplitude på 50 mV (RMS) og frekvens på 20 kHz fra lock-in forstærker.
- Indstil output-filter af lock-forstærker på 1 ms tidskonstant og 24 dB. Indstil fase af lock-in forstærker sådan at forbigående kapacitans ændringer produceret af mild sugning pulser kun forekommer i den patch kapacitans (IM) spor uden fremspring i patch ledningsevne (Re) spor (figur 2).
BEMÆRK: Se detaljerne for kalibrering af systemet i referencen 19. - Identificere typiske kapacitans ændringer ved "nedadgående" trin (Figur 3).
BEMÆRK: En solid optagelse vil blive betragtet som en "trappe" type lighed med mange nedadgående trin, hvilket indikerer at internalisere enkelte blærer. Lappe-processen fungerer som en mekanisk stimulering, da handling strøm kan typisk optaget fra de fleste celler. - Navngiv filer som individuelle mapper, herunder dato: dd / mm / år, og hver celle-attached optagelse som sin egen individuelle nummerering (xx) Inden for denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Cellelevedygtigheden og kvaliteten af gigaohm tætning er afgørende for kvaliteten af celle-tilknyttet kapacitans optagelser. Derfor er det vigtigt at fremskaffe en effektiv cellekultur forud for elektrofysiologiske optagelser, og typiske levedygtige celler er illustreret i figur 1. Praksis og tiden vil være nyttigt at opnå en gigaohm tætning med høj kvalitet. Hvis man tydeligt kan se celle deformation når patch-pipetten nærmer cellen som beskrevet i protokol Trin 5.3, der er en bedre chance for at opnå en høj kvalitet forsegling. Figur 3 viser en typisk optagelse membran kapacitans med flere nedad trin forbundet med enkelt vesikel endocytose.
Figur 1. Eksempler på levedygtige mus Binyre kromaffinceller24 timer efter cellekultur. Pile peger på 3 levedygtige kromaffinceller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fase justering i celle-attached optagelser. Med den oprindelige indstilling fase blide sugeledninger forårsage forbigående ændringer i både kapacitans (IM) og ledningsevne (Re) spor, og fremskrivningerne i Re spor forsvinder på grund af en 23 ° fase skift. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. En typisk cell-attached kapacitans optagelse med flere nedadgående trin, der er forbundet med en enkelt vesikel endocytose. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cell-attached kapacitansmålinger kræve flere kritiske trin for at kunne opnå optagelser med høj kvalitet: 1) levedygtige og raske celler fremstillet fra binyrerne; 2) PDL belægning af dækglassene; 3) gigaohm tætning formation; 4) støjniveau af systemet; og 5) fase korrektion.
Til dyr kirurgi, modifikationer kan man potentielt gøre er at justere den kirurgiske metode passer bedst til fingerfærdighed og for at forhindre skader under dissektion. Derudover er tilstrækkelig praksis på at lokalisere og fjerne binyrerne bydende nødvendigt som celler, der vil blive anvendt til elektrofysiologiske optagelser kommer udelukkende fra medulla i binyrerne. Til enzymfordøjelse, er det vigtigt at ækvilibrere enzymopløsningen ved gennembobling af opløsningen med 5% CO2 + 95% O 2. Vær sikker på at slangen er forbundet til cylinderen er tilstrækkeligt og stram med utætheder. Derudover være sikker på at ende in opløsning er korrekt placeret i hele 15 minutter boblende tid; dette kan opnås med at placere en 20 G nål ende, der er blevet gjort stumpe ved enden af slangen for at lede luftstrømmen passende. Desuden vil yderligere tid til dette skridt ikke ondt så længe luftstrømmen ikke er så kraftig som at løbe løsningen i røret. Celle titrering er en anden afgørende komponent, der vil tage praksis. Størstedelen af celler kan blive beskadiget, hvis over-titrering; omvendt, hvis titrering ikke er nok, vil der være meget få enkelte isolerede celler dissocieres fra væv. For effektivt at titrere, udnytte en 200 ul pipettespids at pipettere op og ned 7-8x, og sørg for kirtler er forsigtigt passeret 200 ul pipettespidsen som du titrere.
For PDL belægning, kan man altid udvide inkubationstid PDL på dækglassene op til 3 timer for at sikre tilstrækkelig belægning af dækglas. PDL belægning er kritisk for kromaffinceller at vedhæftetil og vokse på dækglassene efter celleudpladning. Hvis PDL belægningen ikke er tilstrækkelig, vil de fleste af cellerne løsnes fra dækglasset, som vil gøre gigaohm forseglingsdannelsen vanskelig.
Cell-attached optagelser kan altid ændres og forbedres, da lappe teknik er en dedikeret proces. Blid og subtil sug er kritisk i at lette gigaohm forseglingsdannelse når plasteret pipette og celle er i kontakt. For meget sugning vil ødelægge kontaktflade tip-celle og i ekstreme situationer, kan cellerne blive suget ind i patch-pipetten. Det vil være meget let observeret på oscilloskopet ved at skifte til en hel celle konfiguration eller ved en meget minimal modstand vender tilbage til en meget stor én; praksis er af allerstørste betydning for at opnå en høj kvalitet gigaohm sæl-dannelse.
Mens høje tætning modstand er kritisk for at minimere støjniveauet i celle-tilknyttet optagelser, er også de følgende to trinvigtigt at reducere støjniveauet til at løse enkeltstående endocytiske begivenheder: (1) I patch pipette opløsning, TEACl udnyttes til at blokere spændingsafhængige K + kanaler; (2) pipettespidsen er belagt med klæbrig voks og voks inde i pipettespidsen kan fjernes ved hjælp af varme polering.
Mens fasejusteringen beskrevet i protokol trin 6.2 er afgørende for at oprette den indledende fase til optagelsen, kan dette skridt ikke være ideel. Derfor er det vigtigt at udføre korrektion fase under fission-pore analyse for de enkelte arrangementer. Ved en potentiel hvilende membran på -65 mV helcelle-optagelser viser, at en typisk muse chromaffinceller celle har en input kapacitans af 5 pF og en indgangsmodstand 500 MQ, der beregner membranen konduktans af muse kromaffinceller som ~ 0,4 pS / fF. Dette indebærer, at en endocytisk begivenhed med en kapacitans størrelse på FF 1 vil resultere i et nettotab af membran ledningsevne på ~ 0,4 ps. Denne værdi er ubetydelig i forhold til iypiske 50-100 pS membran ledningsevne forandring forbundet med endocytisk fission-pore lukning i celle-attached optagelser. , Er vi derfor overbeviste om, at vores fase korrektion giver os mulighed for at justere grundlinjen membran ledningsevne, således at før og efter fission-pore lukning er på samme niveau; denne proces kan bringe <1% fejl ind i vores dataanalyse.
Sammenfattende protokollen beskrevet her viser, hvordan celle-tilknyttet kapacitans optagelser kan anvendes til at overvåge en enkelt vesikel endocytose hjælp muse kromaffinceller som modelsystem. Denne teknik gør det muligt at analysere de regulerende mekanismer for vesikel fission under endocytose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly-D-Lysine | Sigma | P0899 | |
| DMEM | 15066024 | Keep out of UV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Life Technologies | ||
| Cover Glass | Carolina Biological | 633029 | 12 mm |
| Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | 100 ml |
| Insulin-Trans-Sel-X | Life Technologies | 51500056 | Only thaw on ICE! |
| Papain | Worthington | 39S11614 | |
| EPC-7 plus patch amplifier | HEKA | ||
| BNC-2090 data acquisition board | National Instruments | ||
| Igor data acquisition software | Wavemetrics | ||
| P-97 pipette puller | Sutter Instruments | ||
| Microforge | Scientific Instruments | ||
| Borosilicate glass capillaries | Sutter Instruments | B150-110-10 | Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm |
References
- Rettig, J., Neher, E. Emerging roles of presynaptic proteins in Ca++-triggered exocytosis. Science. 298, 781-785 (2002).
- Gong, L. W., et al. Phosphatidylinositol phosphate kinase type I gamma regulates dynamics of large dense-core vesicle fusion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 5204-5209 (2005).
- Lindau, M., Alvarez de Toledo, G.
- Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389, 509-512 (1997).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. Capacitance flickers and pseudoflickers of small granules, measured in the cell-attached configuration. Biophys J. 75, 53-59 (1998).
- Lollike, K., Borregaard, N., Lindau, M. The exocytotic fusion pore of small granules has a conductance similar to an ion channel. The Journal of cell biology. 129, 99-104 (1995).
- Dernick, G., Gong, L. W., Tabares, L., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Patch amperometry: high-resolution measurements of single-vesicle fusion and release. Nat Methods. 2, 699-708 (2005).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Gong, L. W., de Toledo, G. A., Lindau, M. Exocytotic catecholamine release is not associated with cation flux through channels in the vesicle membrane but Na+ influx through the fusion pore. Nature Cell Biology. 9, 915-922 (2007).
- Gong, L. W., Hafez, I., Alvarez de Toledo, G., Lindau, M. Secretory vesicles membrane area is regulated in tandem with quantal size in chromaffin cells. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 23, 7917-7921 (2003).
- Yao, L. H., et al. Actin polymerization does not provide direct mechanical forces for vesicle fission during clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 33, 15793-15798 (2013).
- Yao, L. H., et al. Synaptotagmin 1 is necessary for the Ca2+ dependence of clathrin-mediated endocytosis. The Journal of Neuroscience : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 32, 3778-3785 (2012).
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 12, 517-533 (2011).
- Murthy, V. N., De Camilli, P.
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51, 773-786 (2006).
- Rosenboom, H., Lindau, M. Exo-endocytosis and closing of the fission pore during endocytosis in single pituitary nerve terminals internally perfused with high calcium concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 5267-5271 (1994).
- MacDonald, P. E., Eliasson, L., Rorsman, P. Calcium increases endocytotic vesicle size and accelerates membrane fission in insulin-secreting INS-1 cells. Journal of Cell Science. 118, 5911-5920 (2005).
- Zhao, Y., Fang, Q., Straub, S. G., Lindau, M., Sharp, G. W. Hormonal inhibition of endocytosis: novel roles for noradrenaline and G protein G(z). J Physiol. 588, 3499-3509 (2010).
- Debus, K., Lindau, M. Resolution of patch capacitance recordings and of fusion pore conductances in small vesicles. Biophys J. 78, 2983-2997 (2000).
