Summary
Entrega sigue siendo el principal desafío para la aplicación terapéutica de pequeños ARN de interferencia (siRNA). Este protocolo implica el uso de una plataforma de entrega siRNA multifuncional y biocompatible, que consiste en arginina y polietilenimina injertada micropartículas de silicio poroso.
Introduction
Los pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) son moléculas de ARN de doble cadena que pueden suprimir la expresión de genes. En los últimos años, siRNAs se han desarrollado como una nueva generación de biofármacos que muestran potencial terapéutico para uso futuro en aplicaciones clínicas 1-5. Sin embargo, la implementación exitosa de la terapia siRNA sigue siendo un reto considerable, debido a la degradación por nucleasas, mala absorción intracelular, la baja eficiencia de transfección y liberación ineficiente desde el endosoma / lisosoma 5. Muchos de estos obstáculos pueden ser superados por el desarrollo de plataformas de distribución, que puede entregar de forma segura y eficiente siRNA al tejido enfermo. En comparación con los portadores virales, las plataformas no virales proporcionan varias ventajas, como la seguridad, bajo costo y facilidad de adaptación. En particular, las nanopartículas catiónicos, tales como polímeros y lípidos, han demostrado su utilidad para la entrega siRNA 3.
Anteriormente, hemos desarrollado un dr discoidalug sistema de entrega, denominado el vector de múltiples etapas (MSV). Esta plataforma se basa en etapas secuenciales, en los que un vehículo se libera de otro. La primera etapa del vehículo es una micropartícula biodegradable hecha de silicio poroso (psi), mientras que los segundos vehículos etapa son nanopartículas cargadas con fármacos o agentes de contraste 6,7. Las nanopartículas, que están incrustados en el material de la ISP, se liberan gradualmente a medida que se degrada el Si 8. Una ventaja de usar partículas de Si es que las características de morfología y de la superficie pueden adaptarse fácilmente para lograr la biodistribución óptima y liberación del fármaco. Recientemente, el uso exitoso de la plataforma MSV para la entrega de liposomas siRNA a tejido tumoral se muestra en un modelo de ratón de ovario y cáncer de mama 9, 10.
En este trabajo, hemos fabricado un sistema de entrega universal para siRNA basado en los principios de la plataforma MSV. La eficacia de este sistema de entrega previamente nos ha demostradoing diferentes siRNA moléculas 11. El sistema es un portador de silicio poroso policatión-funcionalizado (PCPS), que consiste de la ISP injertado con polietilenimina (PEI) y arginina (Arg). PEI puede ayudar en la formación de interacciones electrostáticas con siRNA, mientras que Arg y la ISP pueden servir para reducir la toxicidad de PEI, como anteriormente demonstarted 11. Además, la presencia de PEI puede ayudar en la absorción intracelular y el escape endosomal, mientras que las micropartículas pSi permiten la protección siRNA y de liberación sostenida. Las partículas pSi degradan gradualmente en condiciones fisiológicas, lo que resulta en la formación de nanopartículas Arg-PEI / siRNA (Figura 1), que tienen una morfología distinta y una distribución de tamaño estrecha 11. Para obtener más información con respecto a la estabilidad del sistema PCPS / siRNA, por favor referirse al estudio de Shen et al. 11. Esta plataforma PCPS difiere del MSV convencional, ya que las nanopartículas segunda etapa no se prese inicialmentent en el portador, pero se forman con el tiempo como el portador de la primera etapa se degrada 11, 12. La eficiencia de carga siRNA eficiencia, la citotoxicidad y silenciamiento de los genes del sistema de PCPS se ha evaluado in vitro. La eficacia de transfección se midió usando siRNA contra de la ataxia telangiectasia mutada (ATM) oncogén, que está implicado en la reparación del ADN 10. Anteriormente, la supresión de la ATM se ha demostrado que disminuye el crecimiento del tumor en un modelo de cáncer de mama 10.
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Protocol
1. PCPS preparación de partículas
- Oxidar partículas de silicio poroso no funcionalizado en una solución al 30% de peróxido de hidrógeno a 95 ° C durante 2 hr. Aminar las partículas oxidadas en 2% (3- aminopropil) trietoxisilano solución en alcohol isopropílico durante 2 días a 65 ° C con agitación suave.
- Centrifugar la solución durante 30 min a 18.800 xg y se lavan las partículas dos veces en alcohol isopropílico y tres veces en etanol, usando sonicación breve a suspender el sedimento. Deja las partículas en solución de etanol al realizar el paso 1.3 y 1.4.
- Añadir un volumen conocido de suspensión de partículas (por ejemplo, 10 l) a 10 ml de diluyente isotone y contar las partículas con un analizador de recuento de partículas para determinar la concentración de partículas en la solución madre.
- Activar el grupo ácido de L-arginina (0,1 nmol) con N - (3-dimetilaminopropil) - etilcarbodiimida hidrocloruro de N '(EDC, 0,1 nmol) / N
- Tratar brevemente con ultrasonidos la solución de partículas de stock y añadir 1 mil millones de partículas a la solución de L-arginina y dejar la reacción durante 18 horas a RT con agitación suave.
- Activar el primer grupo de ácido aspártico de N - (terc-butoxicarbonil) -L-aspártico (Boc-Asp-OH, 1 nmol) con EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) en 20 ml de etanol durante 4 horas a 4 ° C con agitación suave.
- Disolver 50 mg de polietilenimina en 10 ml de etanol y añadir la solución a la mezcla de Boc-Asp-OH. Deje que la reacción proceder durante 24 horas a temperatura ambiente con agitación suave.
- Activar el segundo grupo de ácido aspártico de la solución de Boc-Asp-OH / PEI con EDC (0,1 nmol) / NHS (0,1 nmol) a 4 ° C durante 6 horas con agitación suave.
- Para obtener partículas PCPS, añadir la solución de partículas desde el paso 1.5 en la solución de Boc-Asp-OH / PEI desde el paso 1.8. Permitir que la reacción continúe durante 18 horas a TA con suave st irring.
- Centrifugar la solución durante 30 min a 18.800 xg y se lava la solución de partículas tres veces con etanol, usando sonicación breve a suspender el sedimento.
2. PCPS Caracterización de partículas
- Medir el tamaño de las partículas utilizando un microscopio electrónico de barrido (SEM).
- Coloque una gota de suspensión de partículas (10.000 partículas / l en etanol) en una sílice limpia SEM muestra talón y dejar secar a temperatura ambiente al vacío.
- Mida imágenes SEM a las 8 kV con una distancia de trabajo de 3-5 mm utilizando un detector en el objetivo.
- Medir el potencial zeta de las partículas utilizando un sistema analizador de partículas.
- Mezclar 10 l de suspensión de partículas (10.000 partículas / l en etanol) con 1 ml de 10 mM de tampón de fosfato (pH 7,4).
- Cargar la muestra en células capilares plegadas y medir el potencial zeta de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Secar las partículas PCPS (de partículas PCPS etapa de preparación 1.9) a vacío O / N.
- Añadir siRNA (4 g) en agua libre de nucleasa (20 l) para las partículas PCPS secos y tratar brevemente con ultrasonidos. Utilice la siguiente partícula de relaciones siRNA: 2 × 10 5 partículas / 0,2 mg siRNA, 4 × 10 5 partículas / 0,2 mg siRNA, 6 × 10 5 partículas / 0,2 mg siRNA, 8 × 10 5 partículas / 0,2 mg siRNA, 10 × 10 5 partículas / 0,2 mg siRNA y 12 × 10 5 partículas / 0,2 mg siRNA.
- Incubar durante 3 horas a 4 ° C en un agitador (1000 rpm) para permitir siRNA de unión a las partículas.
4. Optimización de la relación de partículas siRNA / PCPS
- Agregar colorante de carga de ADN a 20 l de las partículas siRNA PCPS / control con diferentes partículas a las relaciones de siRNA (ver carga de siRNA en partículas PCPS).
- Cargue el samples en un gel de agarosa al 2% que contenía tinción en gel de ADN.
- Realizar la electroforesis a un voltaje constante de 120 V durante 20 min en tampón.
- Analizar el gel con adquisición de imágenes y el software de análisis.
5. Liberación de siRNA de PCPS Partículas
- Mezclar 20 l de las partículas siRNA PCPS / control con diferentes partículas a las relaciones de siRNA (ver paso 3) en dodecilsulfato de sodio (SDS, 2%) y dejar reposar durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Añadir colorante de carga de ADN de las muestras.
- Cargar las muestras en un gel de agarosa al 2% que contenía la mancha gel de ADN.
- Realizar la electroforesis a un voltaje constante de 120 V durante 20 min en tampón de electroforesis de ADN usando un equipo y una fuente de alimentación.
- Analizar el gel con adquisición de imágenes y el software de análisis.
6. Microscopía Confocal de PCPS Partículas
- Añadir 5 l de partículas siRNA PCPS / fluorescentes de control (10 × 10 5 partículas / 0.2 g siRNA / 20 l) a una hoja de cubierta de vidrio.
- Visualizar capas de partículas por microscopía confocal.
7. Caracterización de Arg-PEI / control de siRNA nanopartículas
- Para degradar el material de silicio y formar Arg-PEI nanopartículas / siRNA control, añadir partículas PCPS / siRNA (10 × 10 6 partículas PCPS / 2 g siRNA) a 100 l de solución salina tamponada con fosfato y agitar (1000 rpm) a 37 ° C durante 2 días.
- Centrifugar la muestra durante 30 min a 18.800 xg y se recoge el sobrenadante.
- Medir el tamaño de las nanopartículas Arg-PEI / siRNA formada con dispersión de luz dinámica (DLS).
- Mezclar 10 l del sobrenadante con 1 ml 10 mM de tampón de fosfato (pH 7,4) y ponerlo en una cubeta de plástico.
- Medir el tamaño de las partículas utilizando un sistema analizador de partículas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Determinar el tamaño y la morfología de la formada Arg / PEI-siRNAnanopartículas con microscopía de fuerza atómica.
- Tomar 10 l del sobrenadante y el lugar en una oblea de silicio.
- Visualice las partículas con microscopía de fuerza atómica (AFM).
8. Cultivo Celular
- Cultura MDA-MB-231 células de cáncer de mama humano en medio de cultivo celular suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina a 5% de CO 2, 95% de humedad y 37 ° C.
9. Microscopía confocal de células vivas con PCPS Partículas
- Células de la placa en la cultura 2-así se desliza a una densidad de siembra de 3 x 10 5 células / pocillo durante 24 hr.
- Añadir partículas PCPS cargados de control de siRNA fluorescente (10 × 10 5 partículas / 0,2 mg de partículas de relación siRNA, 50 nM siRNA) a las células.
- Grabar una película de las células con un microscopio confocal (suministrado con una cámara, 5% de CO2, 95% de humedad y 37 ° C) durante 12 horas después de la expo de partículasSeguro.
10. Microscopía confocal de células fijadas con PCPS Partículas
- Células de la placa en la cultura 2-así se desliza a una densidad de siembra de 3 x 10 5 células / pocillo durante 24 hr.
- Añadir partículas PCPS cargados de control de siRNA fluorescente (10 × 10 5 partículas / 0,2 mg de partículas de relación siRNA, 50 nM siRNA) a las células y se incuba durante 1 día, 7 días y 10 días.
- Lavar las células dos veces con tampón fosfato salino y luego fijar con solución de paraformaldehído al 4% durante 10 min.
- Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato.
- Permeabilizar las células con 0,1% de octil fenol etoxilado durante 10 minutos y luego lavar tres veces con tampón fosfato salino.
- Bloquear las células con albúmina de suero bovino (10 mg / ml) en salina tamponada con fosfato durante 10 min a TA con agitación suave.
- Para visualizar actina filamentosa, incubar las células con forma fluorescente phalloidin etiquetado (1 mu l / 40 lsolución de bloqueo) durante 20 min a TA con agitación suave y después lavar en tampón fosfato salino.
- Retire las diapositivas de la trama y añadir antifade reactivo con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualizar el núcleo.
- Añadir una cubierta de vidrio en la parte superior y tomar imágenes de las células con microscopía confocal.
11. citometría de flujo de células con PCPS / fluorescentes control siRNA Partículas
- Células de la placa en una placa de 6 pocillos a una densidad de siembra de 3 x 10 5 células / pocillo durante 24 horas.
- Añadir partículas PCPS cargados con siRNA de control fluorescente (10 × 10 5 partículas / 0,2 g de partículas de relación de siRNA, 50 nM siRNA) a las células y se incuba durante 24 hr.
- Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato y raspar con un raspador de células.
- Almacenar las células en solución salina tamponada con fosfato con suero bovino fetal al 2% antes del análisis. Use las células no tratadas como control negativo.
- Realizar cy flujotometry.
12. La viabilidad celular de células con PCPS Partículas y PCPS / control de siRNA Partículas
- Células de la placa en una placa de 96 pocillos a una densidad celular de 3 × 10 3 células / pocillo durante 24 horas.
- Tratar las células con partículas PCPS (1,5 × 10 5 / pocillo y 6 × 10 5 / pocillo) o partículas siRNA PCPS / control (10 × 10 5 partículas / 0,2 mg de partículas de relación siRNA, 10 nM y 100 nM siRNA) para 48 hr y 72 hr. Use las células no tratadas y las células tratadas con tampón fosfato salino (mismo volumen que las partículas añadidas) como controles. Analice cada muestra por triplicado.
- Realizar un ensayo de proliferación celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Representar datos como la media ± desviación estándar.
13. Western Blot de células con PCPS / ATM mutados siRNA Partículas
- Células de la placa en una placa de 6 pocillos a una densidad celular de 2 × 10 5 células / well durante 24 horas.
- Se incuban las células con siRNA PCPS / control (50 nM) partículas o PCPS / ATM siRNA (50 nM) partículas de 72 h. Use las células no tratadas como control.
- Lisar las células usando un reactivo de extracción de proteínas complementado con un cóctel inhibidor de la proteasa.
- Centrifugar los lisados de células durante 10 min a 14.000 xg y recuperar el sobrenadante.
- Determinar la concentración de proteína con un ensayo de cuantificación de proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Añadir tampón de carga de muestra (con 5 l 2-mercaptoetanol / ml de tampón) a las muestras y calentarlos durante 6 min a 99 ° C.
- Cargar las muestras de proteínas (20 g / l) en un gel de SDS-poliacrilamida al 12% en tampón y realizar la electroforesis en gel de poliacrilamida (1 h, 120 V) utilizando un equipo de electroforesis y una fuente de alimentación.
- Transferir el gel en tampón de transferencia (con 20% de metanol) a una membrana de nitrocelulosa (1 h, 100 V) utilizando un equipo de electroforesis yuna fuente de alimentación.
- Bloquear la membrana con leche en polvo al 5% durante 1 hora.
- Incubar la membrana con el anticuerpo primario ATM (de conejo) en solución de bloqueo (del paso 13.9) a una dilución 1: 1.000 O / N.
- Se lava la membrana con solución salina tamponada de fosfato que contiene monolaurato de sorbitán polietilenglicol 0,1% y luego se incuba con el anticuerpo secundario (anti-conejo) en solución de bloqueo (del paso 13.9) a una dilución 1: 2500 durante 1 hora.
- Se lava la membrana con solución salina tamponada de fosfato que contiene monolaurato de sorbitán polietilenglicol 0,1% y detectar las bandas de proteína con reactivo de detección de transferencia Western utilizando adquisición de imágenes y el software de análisis.
- Para el control de carga, lavar la membrana y repita los pasos 13,9-13,12 usando un anticuerpo primario-β actina (de ratón, dilución 1: 10.000) y un anticuerpo secundario (anti-ratón 1: 4000 dilución).
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Representative Results
Este protocolo describe el uso de un sistema de suministro no virales para la transfección segura y eficiente siRNA. Los resultados de SEM revelan que las partículas de los PCP son de forma cilíndrica y tener un diámetro de 2,6 m (Figura 2A). Las partículas están cargadas positivamente con un potencial zeta de aproximadamente 8,21 (Figura 2B), permitiendo de este modo unión electrostática con nucleótidos cargadas negativamente. Confocal de imágenes de diferentes capas de las partículas de PCPS demuestran que el control fluorescente siRNA se carga dentro de las partículas de silicio poroso (Figura 2C). La formación y liberación de nanopartículas Arg-PEI / siRNA de las partículas pSi se confirmó con DLS y AFM. La distribución del tamaño de las partículas variaba desde 70 hasta 120 nm, con un tamaño medio de 94 nm (Figura 2D). Imágenes de AFM ilustrar que las nanopartículas tienen una forma esférica (Figura 2E).
El ratio de partículas a siRNA se optimizó mediante electroforesis en gel de agarosa para asegurar una alta afinidad de unión (Figura 3A). Se utilizó una amplia gama de partículas a las relaciones de siRNA (2 × 10 5, 4 × 10 5, 6 × 10 5, 8 × 10 5, 10 × 10 5 y 12 × 10 5 /0.2 g siRNA). Los resultados indican que siRNA puede unir fuertemente a las partículas cuando la cantidad de partículas está por encima de 8 × 10 5. Una proporción de 10 × 10 5 PCPS / 0,2 g siRNA se seleccionó para experimentos adicionales. Además, siRNA fue lanzado con éxito de la portadora cuando se tratan con SDS, como se ilustra en la Figura 3B.
A continuación, la internalización bodega de partículas siRNA de control fluorescentes PCPS / se evaluó en MDA-MB-231 células. Confocal imágenes tomadas después de 24 horas de tratamiento muestran que las partículas se internalizan eficazmente en las células (Figura 4 la Figura 5 muestra que el 89% de las células han internalizado PCPS / partículas de siRNA después de 24 h de incubación. Por otra parte, el proceso de internalización se registró durante 12 h (Video 1). Estos resultados indican que las partículas de PCP pueden suministrar eficientemente siRNA en las células. La acumulación a largo plazo de siRNA en el interior de las células también se evaluó por microscopía confocal. En el día 7 y el día 10 el siRNA fue aún detectable en el interior de las células (Figura 6).
Uno de los factores más importantes a considerar cuando se desarrolla un sistema de entrega de siRNA es la seguridad de la portadora 13. PEI es conocido por formar poliplejos con siRNA, la ayuda en la absorción celular y la liberación de disparo desde el endosoma / lisosoma. Sin embargo, PEI puede tener efectos tóxicos, debido a la presencia de grupos amino primarios cargados positivamente en la columna vertebral 14,15. Por ejemplo, PEI unión a la glycocalyx en la superficie celular puede resultar en la formación de grandes grupos 16. A fin de eliminar esta toxicidad inducida por carga, PEI se conjugó covalentemente a la arginina a través de un enlazador puente, para reducir el número de grupos amino primarios. La viabilidad celular se mantuvo por encima del 95% después de 48 hr y 72 hr cuando se usaron partículas y siRNA a una concentración de hasta 6 × 10 5 / nM bien y 100, respectivamente (Figura 7A). A continuación, la eficacia de la transfección de siRNA contra el oncogén ATM se evaluó en MDA-MB-231 células. Western blot resultados demuestran que los niveles de proteína de ATM se disminuyeron después del tratamiento con PCPS / ATM siRNA (Figura 7B). Los resultados sugieren la plataforma PCPS es un sistema de suministro seguro y eficiente para siRNA.
Figura 1. Representación esquemática de silicio poroso partículas policatión funcionalizado (PCP). strong> arginina (Arg) -polyethylenimine (PEI) / pequeñas nanopartículas de ARN de interferencia (siRNA) se forman después de la degradación de silicio (Si).
Figura 2. Caracterización de las partículas de los PCP. (A) Microscopía electrónica de barrido (SEM) Imagen de partículas de los PCP. (B) Zeta potencial de las partículas de los PCP. (C) Confocal de imágenes de diferentes capas de las partículas siRNA control de PCPS / fluorescente. Distribución (D) Tamaño de la arginina nanopartículas siRNA control / Arg-PEI liberados de las micropartículas de silicio poroso. Imágenes (E) microscopía de fuerza atómica (AFM) de Arg-PEI / control de nanopartículas siRNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. gel de agarosa para la optimización del sistema de suministro PCPS / siRNA. (A) La afinidad de unión entre las partículas de PCP y controlar siRNA. Las bandas representan sin consolidar siRNA. (B) la liberación siRNA tras la incubación con SDS al 2% durante 1 hora. Las bandas representan totales siRNA (no unido y consolidado). Muestra 1: siRNA; Muestra 2: 2 × 10 5 partículas PCPS / 0,2 mg siRNA; Muestra 3: 4 × 10 5 partículas PCPS / 0,2 mg siRNA; muestreo 4: 6 × 10 5 partículas PCPS / 0,2 mg siRNA; Muestra 5: 8 × 10 5 partículas PCPS / 0,2 mg siRNA; Muestra 6: 10 × 10 5 partículas PCPS / 0,2 mg siRNA; Muestra 7: 12 × 10 5 partículas / PCPS 0,2 g siRNA.
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Figura 4. Imágenes de microscopio confocal de partículas / PCPS fluorescentes siRNA (rojo) en MDA-MB-231 células (24 h de incubación). El núcleo y la actina filamentosa se visualizó con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul ) y faloidina (verde), respectivamente. Tres capas diferentes fueron imágenes (superior, medio y basal). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. citometría de flujo cuantitativa análisis de fluorescentes MDA-MB-231 células después de la incubación con PCPS / control de partículas siRNA fluorescente. Las células no tratadas se utilizaron como un control negativo. 89% de las células había internalizado las partículas.
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Figura 6. Confocal imágenes del control fluorescente siRNA (rojo) dentro de MDA-MB-231 células. Las células se incubaron con PCPS / fluorescentes partículas de control de siRNA para 1 día, 7 días y 10 días. Las células fueron visualizadas con microscopía confocal. El núcleo y filamentosos actina se visualizó con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, azul) y phalloidin (verde), respectivamente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. La viabilidad celular y silenciamiento génico in vitro. (A) Un ensayo de viabilidad celular de células incubadas con partículas de PCP y partículas siRNA PCPS / de control (SCR). El experimento se realizó en viajelicate y los resultados se presentan como media ± desviación estándar. Las células no tratadas (en blanco) y las células incubadas con PBS se utilizaron como controles. (B) Western blot de telangiectasia PCPS / ataxia mutada (ATM) partículas siRNA. Las células se expusieron a PCPS / control de siRNA (SCR) partículas y partículas PCPS / ATM siRNA. Las células no tratadas (Mock) se utilizaron como control. β-actina se utilizó como control de carga.
Video 1 . absorción en función del tiempo de PCPS / fluorescentes partículas siRNA control en células vivas MDA-MB-231. El video fue grabado durante 12 horas después de la exposición de las células a las partículas.
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Discussion
Este protocolo describe un método para la entrega exitosa y transfección de ARNsi en las células. En particular, la entrega de siRNA se logra mediante el uso de una plataforma multifuncional que consiste de partículas pSi policatión-funcionalizado. El uso de la terapia de ARNip tiene un gran potencial, por ejemplo, el tratamiento del cáncer, ya que varios oncogenes pueden ser dirigidos con alta especificidad. Por lo tanto, existe una demanda para desarrollar vehículos de administración de ARNsi, que puede mitigar los problemas de la terapia de siRNA. En conclusión, hemos diseñado un protocolo que se muestra prometedor para la entrega segura y eficiente de los siRNA. Sin embargo, hay algunos factores clave que deben tenerse en cuenta cuando se realiza la técnica descrita. Por ejemplo, una consideración importante en la preparación de las partículas de PCPS es para manejar el siRNA cuidadosamente, con el fin de evitar la degradación por nucleasas. En particular, los guantes limpios y RNAsa tubos libres y agua deben ser usados en todo momento cuando se trabaja consiRNA. Si la eficacia de transfección siRNA es baja, un spray que elimina la contaminación de ARNasa se puede utilizar para pulverizar guantes y áreas de trabajo. Además, si la transfección no tiene éxito, el ARNsi debe ser probado con un reactivo de transfección comercial, para determinar si el problema es causado por el siRNA o las partículas. Otra consideración importante para la implementación exitosa del sistema de entrega / siRNA PCPS es tener cuidado al realizar los pasos de centrifugación y lavado. Es decir, el sobrenadante debe estar totalmente descartado para eliminar el exceso de reactivos que se requieren a través de los pasos de preparación de partículas.
Una ventaja importante del sistema de PCPS entrega / siRNA es la seguridad. Varios agentes de transfección siRNA tienen una alta carga catiónica, que contribuye a la toxicidad celular 13,15. De hecho, la mayoría de los protocolos comerciales indican que los reactivos deben incubarse con las células durante sólo unas pocas horas, para evitar la muerte celular. Por el contrario, cells pueden estar expuestos a las partículas PCPS por varios días sin signos de toxicidad, como se desprende de los resultados de viabilidad celular. Las partículas de PCP pueden unirse siRNA con alta afinidad debido a la presencia de PEI. Sin embargo, la toxicidad inducida por carga de PEI se evita mediante la configuración única de la plataforma de entrega. Especialmente la unión de Arg a PEI covalente y la encapsulación de PEI dentro de la Si poros contribuir a la toxicidad reducida. Otra ventaja de la plataforma de PCPS es que siRNA transfección puede tener lugar en presencia de suero. Otros métodos existentes generalmente requieren el uso de medios de cultivo celular libre de suero, añadiendo así pasos adicionales para el proceso de transfección y potencialmente interferir con las vías regulares de señalización celular.
Un beneficio adicional del sistema de PCPS es que no requiere ninguna modificación de las moléculas de siRNA. Mientras que algunos métodos actuales requieren complicados pasos de conjugación para estabilizar el siRNA o que permitan cinternalización ellular 13, el sistema PCPS se basa en una simple mezcla de siRNA carga. La unión a PEI y los poros en el material de Si proporcionar un entorno protector para el siRNA, reduciendo así el contacto con nucleasas. Las partículas PCPS se pueden almacenar durante períodos prolongados de tiempo como material seco o en alcohol isopropílico. Además, si se liofilizan las partículas de PCPS / siRNA se pueden almacenar durante al menos tres meses a 4 ° C. Las partículas liofilizadas PCPS deben ser suspendidos en RNasa libre de agua justo antes de la transfección, y no deben ser almacenados en una solución. Por último, la plataforma lo permite PCPS liberación sostenida de siRNA, como se informó anteriormente 11, aumentando en consecuencia el período de tiempo en el que se dirigen los genes siguen siendo reprimidas. Por consiguiente, después de la internalización celular, las partículas de Si degradan poco a poco, lo que resulta en la formación de nanopartículas Arg-PEI / siRNA. Posteriormente, el siRNA se libera lentamente en el citoplasma, donde se puede unir a messededo de ARN (ARNm), ejerciendo de este modo la actividad biológica. Aunque, las partículas de PCPS proporcionan varias ventajas en comparación con los métodos existentes para la entrega de siRNA, una limitación de la técnica es que las micropartículas no funcionalizados pSi se requieren como material de partida. Mientras que las partículas pueden ser sintetizados usando fotolitografía y ataque electroquímico 17, estas técnicas no están disponibles en todas las instituciones.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10x Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10x Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1x solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4x) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100x) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1x |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blot |
| 6x TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10 cm) dia., 5 x 7 mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (height), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
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