Utbildnings Råttor att frivilligt Dive Underwater: Undersökningar av däggdjur Diving Response

Protocol

OBS: Experimentella protokoll som beskrivs här utfördes vid Midwestern University godkändes av Midwestern University IACUC.

1. Rumskrav

1. Fäst ett förfarande rum som har rinnande varmt och kallt rinnande vatten, och ett sätt att ta bort vatten från tanken, typiskt ett avlopp i golvet.
2. Använd en studie tabell där du vill placera dykning tanken. Sedan rum med golvavlopp typiskt konture för dränering, skära ner gummiproppar och placera dem under bordsbenen så att bordsskivan, och därmed vattenytan i tanken, är nivå.

2. Dykning Tank

1. Dykning Tank Construction
   1. Konstruera en rektangulär tank (100 x 60 x 15 cm) med 3/4 i tjocka plexiglas för botten och 1/2 i plexiglas för sidoväggarna (Figur 1). Permanent fästa ytter plexiglas bitar av tanken ihop med cyanoakrylat cement eller solvents såsom triklorometan.
   2. Dela upp tanken i fem kanaler vardera ca 100 cm lång, med hjälp av flyttbara 1/2 tum tjocka plexiglas skuren i 85 x 15 cm bitar. Permanent placera spåren i botten och kanterna hos tanken i vilken dessa kanalväggar kan placeras i läge.
   3. Häng horisontella plexiglas bitar från kanalavdelare för att skapa ett "tak" för en undervattens dive "tunnel.
   4. I ett hörn av tanken platsen en avtagbar upphöjd plattform, "målområdet", för råttor för att dra ur vattnet och vila mellan simning och dykning prövningar. Råttor brukar putsa sig och avlägsna vatten från sin päls medan i målområdet. Placera höga sidor runt kanterna på målområdet för att försäkra råttorna förblir på plattformen mellan träningsförsök.
   5. Vid det motsatta hörnet av tanken från målområdet placera en kammare som bara tillåter vattens tillgång till labyrinten. Denna flyttbara "starta enrea "används endast för dykning prövningar.
      OBS: I början av en dykning rättegång en råtta sänks ner i vattnet medan du sitter på en plattform i startkammaren; varför denna plattform kallas "hissen".
      OBS: Använd en modulär design, där startområdet, målområdet, och alla kanaler avdelare är löstagbar från tanken. Detta görs av två anledningar: 1) för att underlätta fyllning och tömning av tanken med vatten efter avlägsnande av alla kanalavdelare, och 2) om en råtta blir desorienterad, speciellt under vatten, bitarna snabbt kan demonteras för att rädda råttan från vatten.
2. Fyllning och tömning av tanken med vatten
   1. Påfyllning av tank med vatten
      1. Vid början av varje träningssession, fylla tanken med färskt 32 ° C kranvatten till ett djup av ca 12 cm. Rör om vattnet i tanken för att minimera varma eller kalla fickor.
         OBS: Normalt tar det ca 2 timmar att träna 12 råttor. Under denna tidvattentemperatur minskar med ca 4 ° C. I slutet av träningspasset vattnet kyls till ca 28 ° C. Sedan 30 ° C vatten är termo till råttor, med hjälp av detta varma vatten, snarare än rumstempererat vatten, kommer att minimera värmeförlusterna vid upprepad träning.
   2. Tömning av tank med vatten
      1. Vid slutet av varje träningspass, dränera vattnet från tanken med en stor slang, till exempel en 4 m lång bit 1 tum slang innerdiameter. Helt dränka slangen i tanken, vilket garanterar att inga luftfickor finns i slangen. Placera snabbt ena änden av slangen i golvbrunnen. Den erhållna hävertverkan kommer att dränera vattnet från tanken.
      2. Samtidigt hålla tanken änden av slangen under vattenytan för att bibehålla hävertverkan, tippa tanken på kant för att underlätta fullständig dränering av vattnet.
         OBS: Alternativt och i stället för att suga, installera en kran nära basen av tanken, och ansluten slang från tank peka till golvbrunnen.

3. Rat Allergen Överväganden

1. Använd engångshandskar när hantering och utbildning råttorna. Handskarna kommer att begränsa kontakt med vattnet i tanken, som alltid kommer att innehålla råtturin.
   OBS: Råttorna blir blöt under utbildningen, och rummet kommer att fyllas med en "wet-råtta" lukt. Följaktligen en profylaktisk regim antihistaminer kan förhindra eller begränsa effekterna av rått allergier. Utbildare kan också behöva använda engångsdammskydd, eller N95 masker, bör de blir känsliga för rått allergener.

4. Swim Training

1. Dagliga simma träning
   OBS: Personlig erfarenhet visar att yngre råttor lär labyrinten bättre och snabbare, och på så sätt börjar träningen med 35 g nyligen avvanda råttor är att föredra framför att använda vuxna råttor.
   1. Fyll tanken med vatten. Se 2.2.1.
   2. Infoga ytaarea och kanalavdelare för att skapa 5 simning kanaler.
   3. Under det första träningspasset försiktigt sänka råttorna hand i vattnet ca 3-5 cm från målområdet.
      OBS: På deras introduktion till vatten råttor visas ostadig när de först möter känslan av att sväva. Råttorna kommer paddla omkring i ett okoordinerat sätt och samtidigt försöka hitta ett sätt att gå ur vattnet, så småningom nå den närbelägna målområdet. På grund av deras inneboende förmåga att simma, i senare studier råttorna kommer att simma i ett mycket mer samordnat sätt mot målområdet.
      OBS: Stöd råttorna underifrån så deras fötter är på utredarna händer. Sänk försiktigt råttorna i vattnet, och låt dem simma bort från handen, i stället för att släppa dem i vattnet.
   4. Mellan försök låta råttorna kvar i målområdet i minst 1 minut. Detta för att ge råttorna att rykta och utforska, så att de betraktar målområdet som en "säker" platsatt gå mellan försöken. Detta står i kontrast till gripa tag i en råtta som just har avslutat en rättegång och omedelbart placera den tillbaka i vattnet för att starta nästa rättegång.
      OBS: Använd inte externa belöning (dvs. mat) under träningen, för att förhindra aktivering av belönings kretsar i hjärnan.
   5. Efter målområdet väntetid, försiktigt hålla råttorna för 1 minut innan du påbörjar nästa försök. Torka försiktigt råttorna med en handduk under förundersöknings tag sedan repetitiva inträde i vattnet kommer att orsaka råttor för att få mycket våt och torka dem kommer att förhindra hypotermi.
   6. Upprepa 4.1.3. genom 4.1.5. att slutföra 3 till 5 försök för varje råtta för att utbildas under en daglig simtur träningspass.
   7. Ta bort alla kanalavdelare och avsluta område från tanken.
   8. Töm vattnet ur tanken. Se 2.2.2.
2. Vecko simma träningsschema
   1. Genomföra dagliga träningspass (se 4.1.) 5 dagar i veckan, helst på samma gångvarje dag.
   2. Börja den första rättegången från distans framgångsrikt förhandlat dagen innan. Börjar den andra och tredje försöken från ett större avstånd.
   3. Med varje efterföljande dagliga träningspass öka avståndet mellan där råttorna placeras i vattnet och målområdet. För de första träningspass ökar avståndet med 5-10 cm. Efter råttorna verkar mer bekväm med simning, öka avstånden med 30-50 cm.
   4. Använd större Ökningar i simning avstånd medan råttorna lära sig simma en rak del av en simtur kanal. Däremot lär sig simma i hårnålskurvor mellan kanalerna kan ta 2-3 träningspass.
      OBS: Ofta, väntan i målområdet, råttor kommer tillbaka in i vattnet för att simma, och / eller doppa huvudet under vattnet samtidigt som sitter på målområdet plattformen.
   5. Upprepa denna dagliga träningsprotokoll över 3 veckor för att säkerställa ett framgångsrikt bad av hela 5 kanaler.Denna upprepningar tränings protokoll säkerställs framgångsrikt slutförande av labyrinten, särskilt eftersom labyrinten innefattar omväxlande vänster och höger hårnålskurvor.

5. Dive Training

OBS! När råttorna har lärt sig att framgångsrikt förhandla simma genom labyrinten de är redo att börja dykutbildning.

1. Initial dykutbildning (första dagen)
   1. Sätt startkammaren. Fyll tanken med vatten (se 2.2.1.). Se till vattennivån är 1 cm under öppningen till startområdet.
   2. Sätt målområdet och kanalavdelare för att skapa fem simning kanaler.
   3. Under den första dykning session träna råttorna att sänkas på hiss i vattnet inom startkammaren. Tillgång till labyrinten är från botten av startkammaren. Under denna första sessionen vattennivån är tillräckligt låg så råttan lätt kan simma från startkammaren in i labyrinten. Låt råttan att fortsätta simma genom en labyrint tillmålområdet.
   4. Mellan försök låta råttorna kvar i målområdet i minst 1 minut.
      OBS: Använd inte externa belöning (dvs. mat) under träningen, för att förhindra aktivering av belönings kretsar i hjärnan.
   5. Efter målområdet väntetid, försiktigt hålla råttorna för 1 minut innan du påbörjar nästa försök. Torka försiktigt råttorna med en handduk under förundersöknings håll.
   6. Upprepa 5.1.3. genom 5.1.5. att slutföra 3 försök för varje råtta för att utbildas under denna inledande dyk träningspass.
   7. Ta bort alla kanalväggar, börja kammaren och målområdet från tanken.
   8. Töm vattnet ur tanken. Se 2.2.2.
2. Initial dykutbildning (andra dagen)
   1. Sätt startkammaren. Fyll tanken med vatten (se 2.2.1.). Se till vattennivån är något över öppningen till startområdet.
   2. Sätt målområdet och kanalavdelare för att skapa fem simning kanaler.
   3. Under det andra dyketträningspass vattennivån har höjts så att för att avsluta startkammaren råttan har att doppa huvudet under kanten på startkammaren att komma in i labyrinten. Tänk på detta när råttans första dyk. Låt råttan att sedan fortsätta simma genom labyrinten till målområdet.
   4. Låt råttorna kvar i målområdet i minst 1 minut mellan försöken.
      OBS: Använd inte externa belöning (dvs. mat) under träningen, för att förhindra aktivering av belönings kretsar i hjärnan.
   5. Efter målområdet väntetid, försiktigt hålla råttorna för 1 minut innan du påbörjar nästa försök. Torka försiktigt råttorna med en handduk under förundersöknings håll.
   6. Upprepa 5.2.3. genom 5.2.5. att slutföra 3 försök för varje råtta för att utbildas under dyket träningspass.
   7. Ta bort alla kanalväggar, börja kammaren och målområdet från tanken.
   8. Töm vattnet ur tanken. Se 2.2.2.
3. Initial dykutbildning (tREDJE dag)
   1. Sätt startkammaren. Fyll tanken med vatten (se 2.2.1.), Se till att vattennivån är ovanför öppningen till startområdet.
   2. Sätt målområdet och kanalavdelare för att skapa fem simning kanaler. Placera en horisontell bit plexiglas omedelbart utanför startområdet för att skapa en 5 cm lång dykning tunnel.
   3. Under tredje dyk träningspass råttan har att doppa huvudet under kanten på startkammaren och simma 5 cm under vattnet för att nå öppet vatten simma kanalen. Låt råttan att sedan fortsätta simma genom labyrinten till målområdet.
      OBS: När placeras i startområdet, råttor initiera sin egen undervattens nedsänkning, och därmed de anses vara "frivilliga" dyk.
   4. Låt råttorna kvar i målområdet i minst 1 minut mellan försöken.
      OBS: Använd inte externa belöning (dvs. mat) under träningen, för att förhindra aktivering av belönings kretsar i hjärnan.
   5. Efter målområdet väntetid, försiktigt hålla råttorna för 1 minut innan du påbörjar nästa försök. Torka försiktigt råttorna med en handduk under förundersöknings håll.
   6. Upprepa 5.3.3. genom 5.3.5. att slutföra 3 till 5 försök för varje råtta för att utbildas under dyket träningspass.
   7. Ta bort alla kanalväggar, börja kammaren och målområdet från tanken.
   8. Töm vattnet ur tanken. Se 2.2.2.
4. Vecko dyk träningsschema
   1. Utför daglig träningspass (se 5.3.) 5 dagar per vecka, helst vid samma tidpunkt varje dag.
   2. Börja den första rättegången från distans framgångsrikt förhandlat dagen innan. Börja den andra och tredje försök med ökad dykning avstånd.
   3. Med varje efterföljande dagliga träningspass öka längden på dyket tunneln genom att lägga till ytterligare horisontella avdelare för att utöka avståndet råttorna måste simma under vattnet. För första några träningspass ökning this avstånd med 5-10 cm. Efter råttorna verkar mer bekväm med dykning, öka avstånden med 30-50 cm.
      OBS: Använd inte överanstränga dyket avståndet försökte under successiva prövningar. Om det behövs, lyft upp i slutet av den horisontella kanallocket för att ge kortare dyk avstånd. Om det under ett dyk rättegång en råtta inte når slutet av dyket tunneln och börjar vända under vattnet, snabbt lyfta upp i slutet av kanallocket och låt råttan till ytan och fortsätta sin simtur. Detta gör det möjligt för råttan att framgångsrikt slutföra en längre dyk avstånd. Denna positiv förstärkning kommer att hålla råttan framåt genom undervattenstunnel med varje dyk rättegång.
   4. Använd större Ökningar av dykning avstånd medan råttorna lära sig att dyka en rak del av en simtur kanal. Däremot lära sig att dyka runt hårnålskurvor mellan kanalerna kan ta 2-3 träningspass.
      OBS: Ofta, väntan i målområdet, råttor kommer återinträda the vatten att simma, och / eller doppa huvudet under vattnet samtidigt som sitter på målområdet plattformen.
   5. Upprepa denna dagliga träningsprotokoll över 3 veckor för att säkerställa ett framgångsrikt dykning av hela 5 kanaler. Denna upprepningar tränings protokoll säkerställs framgångsrikt slutförande av labyrinten, särskilt eftersom labyrinten innefattar omväxlande vänster och höger hårnålskurvor.
      OBS: hela 6 veckor simma och dyka träningsschema sammanfaller med tillväxt på 35 g nyligen avvanda råttor för att nå en kroppsvikt på 300 g.
   6. Efter dagliga träningspass är klar, och råttorna har återvänt till sina hem bur, se till att råttorna snabbt torka sin päls genom grooming, eller om det är nödvändigt, placera en värmedyna under deras bur för att hålla råttorna varma tills deras päls är torr.

6. Experimentella Variationer

OBS: Den grundläggande experimentuppställningen och djurtränings har beskrivits ovan. Men bara beteendevetenskaplig utbildning provides en modell som ska användas tillsammans med andra experimentella tekniker för att samla in uppgifter av intresse. Grundläggande protokoll är modifierade för att undersöka specifika aspekter av dykresponsen. Exempel på dessa ändringar och vissa överväganden för insamling av data med hjälp av dessa fysiologiska och neuroanatomiska tekniker, ges nedan.

1. Implanterbara telemetrisk Sändare
   1. Efter avslutad utbildning, använda kommersiellt tillgängliga telemetriska sändare för att sända pulserande arteriella blodtrycket från simning och dykning råttor. Skaffa lokal IACUC godkännande för förfaranden för kirurgi och postoperativ återhämtning. Följ implantation förfaranden som föreslås av bolaget för sin sändare, och säkerställa fullständig återhämtning från operationen innan han återvände råttan i vattnet.
   2. Säkerställa att antennen tar emot radiosignalen är i närheten när råttan är i vattnet.
      NOTERA: Vatten dämpar radiosignaler, och så att avståndet radiosignalen needs att resa genom vattnet blir en begränsande faktor av tankdimensioner.
   3. Använd en handhållen antenn trollspö, snarare än en råtta-bur storlek antenn, för att följa råttan när den fortskrider genom labyrinten. Hålla staven antenn inom 30 cm från råtta för att säkerställa att radiosignalen inte förloras medan råttan är under vattnet.
2. Trailing Kanyler
   1. Redesign kanalavdelare och horisontella bitar skapar taket på dykning tunneln att kanyl stigar längs bakom råttan under dess progression genom labyrinten.
      OBS: Den modulära designen av kanalerna är av yttersta vikt och måste också möjligt att snabbt återhämta sig från råttan från vattnet labyrint. Om en kanyl hakar och blev rubbas från råtta, kunde råttan snart blöda ut under vattnet, om kanylen inte snabbt anbringas på nytt.
   2. Använd avslutande arteriell kanyler för att spela in arteriellt blodtryck och hjärtfrekvens i frivilligt dykning råttor. Använd en 90 cm bit av PE50 somen bakre kanyl.
      OBS: Denna kanyl längden är tillräckligt lång för att ansluta råttan till tryckgivaren samtidigt tillåta råttan att gå vidare genom labyrinten, men ändå är tillräckligt kort för att minimera kanyl dött utrymme och är tillräckligt nära till tryckgivaren för att ge tillräcklig tillförlitlighet när det gäller arteriella trycksignalen.
   3. Använd avslutande vent (eller arteriell) kanyler att injicera farmaceutiska medel såsom parasympatiska och sympatiska agonister och antagonister, eller att injicera spårämnen eller färgämnen som bestämmer fördelningen av hjärtminutvolymen.
   4. Uttag blodprov från råttorna med hjälp av venös (eller arteriell) kanyler medan råttorna är under vattnet för att bestämma undervattens katekolaminnivåer eller blodkemi.
      Anmärkning minimera längden av den bakre kanylen och står för kanylens dödutrymme under bloddragningar.
3. Detektion av Aktiverat hjärnstammen Neuroner
   1. Använda immunologisk detektion av Fos-protein till identify specifika områden i hjärnstammen som är en del av den dykresponsen.
      OBSERVERA: Vid repetitiv initiering av en cardiorespiratory reflex, hjärnstammen nervceller som är en del av det reflexkretsen kan bli aktiverad och producera ett protein som kallas Fos.
   2. Repetitivt dyka råttor genom labyrinten var 5 min i 2 timmar för totalt 24 dyk.
      NOTERA: Andra protokoll som också inducerar neuronal Fos produktion kan också användas. För att undvika aktivering av hjärnstammen nervceller som är involverade i svar på stress, bör det beteende som upprepas ingå som en del av beteendeträning.
4. Blod kortikosteron nivåer under Diving
   1. Använd kortikosteron som en indikator på nivån av stress råttor erfarenhet under simning och dykning.
   2. För att få blod för kortikosteron analys, drar 0,1 ml blodprov från svansvenen hos råttor 15 minuter efter 3 frivilliga simmar eller dyk.
      OBS: Preliminära experiment visade att 15 min är sufficient tid för att möjliggöra produktion och frisättning av kortikosteron i cirkulationen och orsaka en topp i plasma kortikosteron nivåer. Sedan kortikosteron nivåer har en dygnsrytm, schemalägga allt blod drar vid samma tidpunkt på dagen och motsvarade med tidpunkten för träningen.

Representative Results

Framgångsrikt slutförande av de beskrivna simning och dykning förfaranden utbildning kan minska stress som upplevs av råttor vid dykning under vatten. Blod kortikosteron nivåer tyder på att upprepad daglig träning minskar stressfulness samband med frivillig dykning, och utbildade råttor hitta dykning inte mer stressande än hanteras dagligen av en människa (Figur 2; ^17). Omvänt, råttor som inte utbildats i dykning protokollet hitta frivilliga dykning stressigt (Figur 2; ^17). Dessutom finner både utbildad och outbildad råttor tvångs dykning vara den mest stressande (figur 2; ^17).

De kardiovaskulära svar från simning, frivillig dykning och tvångs dykning råttor har spelats in med implanterade telemetriutrustning (Figur 3, ^8,17-20) och avslutande kanyler (Figur 4, ^21-23). Omedelbart efter frivilliganedsänkning, och inom en och samma slag, hjärttakten skulle sänkas med 78% och medelartärblodtryck minskar med 25% ^17. Dessa resultat visar att frivilligt dykning råttor uppvisar samma kardiorespiratoriska ändringar typiskt sett i andra dykning djur. Bakkant arteriella kanyler har använts för att injicera den muskarinantagonist atropin, vilket eliminerar bradykardi associerad med frivillig dykning (Figur 4; ^21), och för att bestämma fördelningen av hjärtminutvolym ^22, inklusive cerebrala blodflödet ^23, under frivillig dykning. Avslutande kanyler har också använts för att visa att råttor ignorera ökad arteriell hypoxemi och hyperkapni medan de är nedsänkta ^18, och att redan existerande chemoreceptor enheten inte har någon effekt på de kardiovaskulära reaktioner på frivillig dykning ^21.

Nervceller i lameller I och II i den ventrala märg dorsalhorn (MDH) uttrycker Fos During frivillig dykning, och dessa nervceller kan utgöra den första hjärnstammen afferenta relä dykresponsen (Figur 5; ^24). Viktiga hjärnstammen kardiorespiratoriska kontrollområden, som till exempel den näst sista kompressorn området (CPA), nucleus tractus solitaries (NTS), rostralt ventrolaterala medulla (RVLM) och peribrachial regioner, ökade alla visa Fos märkning under frivillig dykning jämfört med simning ^25. Nervceller i kemosensitivt regioner i hjärnstammen uttrycka Fos efter långvarig tvingade dyk ^18.

Figur 1:. Schematisk bild av Diving Tank A plexiglastank (100 x 60 x 15 cm) användes för att skapa en enkel labyrint bestående av fem 1 m långa kanaler. Tanken fylldes med 30 ° C kranvatten, och råttor initialt tränas att negotiate labyrinten genom att simma på vattenytan, från Start Area (uppe till vänster) till målområdet (nere till höger). Råttorna fick sedan utbildade för att dyka genom labyrinten, hålls under vattnet genom horisontella plexiglasbitar placerade 2-3 cm under vattenytan. [Denna siffra har modifierats ^26]

Figur 2: kortikosteron mätningar. Blod drar från råttsvansvenerna användes för att mäta kortikosteron koncentrationer (medelvärde ± SE) från råttor kvar i sina burar (naiva), råttor behandlas under 10 minuter / dag (Handläggare), råttor tränade att simma och dyka (Utbildad) och råttor det fick ingen simma eller dyka träning (Outbildad). Kortikosteron mättes efter utbildade råttor hade avslutat deras simma utbildning (vänster uppsättning av staplar), hade efter utbildade råttor avslutat deras frivilliga dive-utbildning (Center uppsättning staplar) och efter utbildade råttor hade avslutat sin tvångs dykutbildning (rätt uppsättning av staplar). 1 indikerar värdet är signifikant större än Naiv; 2 indikerar värdet är signifikant större än den som hanteras; 3 indikerar värdet är signifikant större än Utbildade; * Visar att hos Utbildade råttor värdet under forcerad dyk är betydligt större än under frivilliga dyk. [Denna siffra har modifierats ^17]

Figur 3: blodtryck spår från telemetriska sändare rådata spår visar pulserande arteriella blodtryck under simning (vänstra kolumnen), frivillig dykning (mittkolumnen), och tvingade dykning (höger kolumn) från råttor tränade att simma och dyka genom labyrinten. (nedre raden) och från råttor som inte hade haft training förfarande (övre raden). Dykning under vatten (både frivillig och påtvingad nedsänkning) producerade en omedelbar bradykardi och långsammare debut ökning av det arteriella trycket, medan simmar på ytan av vattnet orsakade inga sådana kardiovaskulära förändringar. Bars enligt spår indikerar perioder av nedsänkning. Avbrott i spår indikerar perioder då telemetriska signalen förlorades. [Denna siffra har modifierats ^17]

Figur 4: Atropin eliminerar dykning bradykardi. Originalinspelningarna av pulserande arteriella blodtrycket frivilligt dykning råttor (A) före och (B) efter atropin förbehandling. Spår erhölls med användning av en bakre artärkanyl. Innan atropin förbehandling minskade arteriella trycket något på nedsänkning, men thöna ökade till mer än före dyket för resten av dyket. Hjärtfrekvens bestämdes från intilliggande pulstryckintervall. Vid nedsänkning fanns en omedelbar och betydande bradykardi som höll i under hela dyket. Efter parasympatisk blockad av atropin förbehandling av bradykardi eliminerades. Det fanns också en ökning av artärtryck under dyket. Baren under kurvan visar hur lång nedsänkning. [McCulloch, opublicerat]

Figur 5: Fos märkning inom MDH. Mikrofotografier av trigeminus märg dorsalhorn (MDH) och spinal trigeminala tarmkanalen (SP5) hos råttor tränade att dyka under vattnet. (A) I en kontrollråtta som inte upprepade dyka det finns ingen Fos märkning. (B) I en swimming råtta finns det mycket litTLE Fos etikett i MDH (stor pil) eller paratrigeminal kärnan (liten pil) inom SP5. (C) I en dykning råtta det finns mer Fos märkning ventralt i både MDH (stor pil) och paratrigeminal kärnan (små pilar) i jämförelse med simning och kontroll råtta. För in i panel (A) visar den rostral-kaudala lokalisering av paneler AC. Skalstrecket i panel C är 100 | im. [Denna siffra har modifierats ^24]

Figur 6: Aktiverad katekolaminerga nervceller från dykning råttor. Mikrofotografier visar medullas för en kontroll råtta icke-dykning (A, C och E) och en frivillig dykning råtta (B, D och F). Hjärnvävnaden immunohistologically behandlas för både Fos end tyrosinhydroxylas (TH), som producerar bruna TH SOMAS och svarta Fos kärnor. Öppna pilspetsar identifierar singel-märkt TH-positiva neuron men heldragna pilarna identifierar Fos + TH dubbelmärkta neuroner. A1 nervceller identifieras i A och B. C1 nervceller identifieras i C och D. A5 nervceller identifieras i E och F. Fler Fos och TH dubbelmärkt ses i A1, C1, och A5 regioner av dykning råtta än i den icke-dykning kontrollråtta. Kalibrering bar i E är för paneler AF, och är 250 nm. Kalibrering bar i infällda i F är för alla inlägg, och är 50 pm. [Denna siffra har modifierats ^26]

Discussion

Råttor i deras vilda formen burk och gör utnyttja halv vattenmiljöer, och kommer ofta dyka under vattnet medan födosök för mat ^6. Det är därför inte så förvånande att råttor kan lätt tränas att frivilligt dyka under vattnet. De beskrivna förfarandena utbildning kan vara upp till 6 veckor, vilket kommer att innebära nya avvanda råttor till en kroppsstorlek som används i de flesta vuxna råtthjärna atlaser (~ 300 g). Således hjärnan från dessa dresserade djur blir lättare att jämföra med de anatomiska strukturer som identifierats i dessa atlaser.

Efter att ha placerats i startområdet flesta råttor kommer att börja sin undervattens simma inom 20 sekunder. Men ibland en råtta kan ta upp till 5 minuter eller mer innan den inledde sin frivilliga dyk. Även om det kan vara frestande i detta skede för att tvinga råttorna in i undervattenstunnel, detta i allmänhet bör undvikas för att hindra råttorna från att associera vattnet med en negativ erfarenhet. Gnagare kan vara envis och kan initibundsförvant vägrar att dyka under träningen, men när de inser det enda sättet att avsluta vattnet är genom att fylla i dyket genom labyrinten, de brukar inleda sina dyk snart efter att ha placerats i startområdet.

En viktig aspekt i repetitiva och metodiska förfaranden utbildning är att de genomförs på ett sådant sätt att minska den stress som upplevs av råttorna. Låta råttor utforska sin omgivning, särskilt medan i målområdet mellan försöken, verkar för att ytterligare minska stressen. Råttor kommer ofta tillbaka in i vattnet för att simma, och / eller doppa huvudet under vattnet samtidigt som sitter på målområdet plattformen. Detta tyder på att råttor är inte i sig vatten aversive. Dessutom, medan det inte är ovanligt att råttor att producera fekal pellets under simning eller dykning eller när väntar i målområdet, dagliga träningsresultat i färre fekal pellets ^17. I allmänhet mindre stressade råttorna är under utbildning, desto färre pellets de kommer att producera. Eventuella fekal pellets som produceras tas bort från vattnet eller målområdet så snart som möjligt för att hålla vattnet relativt rena.

Råttor kan ibland få blodiga näsor medan simning och dykning, vilket kan vara ett resultat av inblåsning av vatten i näsgångarna. Uppträdandet av blod kan vara beroende på osmotiska påkänningar i den nasala slemhinnan. Även i målområdet mellan försöken råttorna kommer putsa sig. Som en konsekvens blod från näsan kan få omfördelas över råttor huvud och nos, vilket ger råttorna en lätt rödaktig nyans, speciellt runt ögonen, under ett träningspass. Dessutom kan en och annan råtta hitta dykning stressande och / eller har negativa dykning erfarenheter (dvs, genom att vända sig om och gå vilse under dykning under vatten (se anmärkning efter 5.4.3. Om hur man kan förhindra att detta inträffar)). I dessa råttor porfyrin kan visas i hörnen av ögonen, vilket signalerar en spännings response.

Storleken på dykning tanken kommer i viss utsträckning bestämma rumskraven. Den beskrivna tanken är konstruerad för att ha råttor simma 2-3 cm under vattenytan genom en 5 m lång plexiglas labyrint att ge en undervattenssimning längd 10-15 sek ^{17,19,24,26,27.} Om ett experiment utformas för att mäta svaren från en längre dyk, eller från en djupare dyk under vattnet, kan tanken behöva omarbetas. Kraven rum kunde då också ändra för att passa måtten på en omdesignade dykning tank. Om det inte finns någon golvbrunn tillgängligt i förfarandet rummet, kan vattnet från tanken samlas i en stor behållare, såsom en 60 gal soptunna, som sedan kan tömmas på annan plats på ett bekvämt sätt.

Fos-tekniken kan användas med andra metoder neuronal upptäckt att ytterligare identifiera och karaktärisera nervceller som ingår i hjärnstammen kretsen i dykresponsen. Till exempel,Fos upptäckt i samband med tyrosinhydroxylas färgning har identifierat katekolaminerga neuroner i A1, C1, A2, A5 och under coeruleus områden (Figur 6, ^26), och globosa nervceller inom lateral A7 området ^26,27, som aktiveras vid frivillig dykning. Dessutom har Fos upptäckt i samband med den bakåtsträvande spårkoleratoxin identifierat cellkroppar av hjärt vagala motorneurons inom yttre bildandet av kärnan ambiguus som aktiveras vid frivillig dykning ^20.

Undersöka det centrala nervsystemet integration av kardiorespiratoriska svaren på dykning är viktigt av flera anledningar ^6,8,28. Dykresponsen kan djur, inklusive människor, att vara nedsänkt under vatten utan att andas under längre tidsperioder. Dykresponsen representerar en funktionell omorganisation av hjärnstammen homeostatiska kontroll, och visar en av de mest kraftfulla patterns av autonoma reflexer observerats hos djur. Dykresponsen kan också vara viktigt kliniskt hos människor som en del av trigemino-hjärt reflex, nasofaryngeal reflex, och / eller plötslig spädbarnsdöd. Slutligen kommer en förståelse för den neuronala kretsar som finns inom hjärnstammen hos råttor bidra till att avgöra hur kortikal afferenta signaler kan ändra grundläggande hjärnstams autonoma reflexer. Alla dessa överväganden gör studie av de centrala aspekterna av däggdjurs dykresponsen sig givande och intressant. Genom att använda de beskrivna förfarandena för att träna råttor att frivilligt dyka under vattnet kommer att möjliggöra en bättre utredning av de centrala aspekterna av däggdjurs dykresponsen än kommer användningen av tvångs dök djur. Detta beror på att utbildnings förfaranden som beskrivits 1) minska aktivering av CNS spänningskrets, och 2) inte aktiverar CNS belöning kretsar eftersom externa belöningar inte används.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCulloch Diving Tank Maze	Stoelting Company	60139
1 inch internal diameter tubing	Fisher	14-169-63	Used to fill or drain tank
Plexiglas rodent restraint device (Economy flat bottomed restrainer)	Braintree	FB-M/L	For forced dives
Telemetric transmitters	DSI	Model PA-C40 (270-0040-008)	Used to transmit pulsatile arterial blood pressure
Hand-held antenna wand	DSI	Model RLA 3000 (272-5007)	Used to ensure radio antenna is near to transmitter while rat is negotiating underwater maze
Intramedic PE50, 0.023" ID	Fisher	14-170-12B	Used as trailing arterial cannula
N95 mask - Moldex #2300N Series	Fisher	19-003-246D	Used to limit inhalation of rat allergens