Summary
Live avbildning av embryonala däggdjur snäckan är en utmaning eftersom de utvecklingsprocesser till hands verkar på en tidsmässig lutning under tio dagar. Här presenterar vi en metod för odling och sedan avbilda embryonal cochlea explantat vävnad som tas från en fluorescerande reporter musen över fem dagar.
Abstract
Här presenterar vi en metod för långsiktig tidsförlopp avbildning av levande embryonala mus cochlea explants. Det utvecklingsprogram ansvarig för att bygga den starkt ordnade, komplex struktur av däggdjurs cochlea intäkterna för cirka tio dagar. För att studera förändringar i genuttryck under denna period och deras reaktion på läkemedel eller genetisk manipulering, är nödvändiga långsiktiga avbildning. Tidigare har Bildproduktion typiskt begränsats av livskraft explanterad vävnad i en fuktig kammare ovanpå en vanlig mikroskop. Svårigheter att upprätthålla optimala förutsättningar för kultur tillväxt med avseende på luftfuktighet och temperatur har placerat gränser på hur lång avbildning experiment. Ett mikroskop integreras i en modifierad vävnadsodlingsinkubator ger en utmärkt miljö för långsiktig-levande avbildning. I denna metod visar vi hur man kan upprätta embryonala mus cochlea explants och hur man använder en inkubator mikroskop för att bedriva time lapse fantasinng med både ljusa fält och fluorescerande mikroskopi för att undersöka beteendet hos en typisk embryonala dag (E) 13 cochlea explant och Sox2, en markör av prosensory cellerna i snäckan, under 5 dagar.
Introduction
Den däggdjurs snäckan är en mycket beställt komplext organ. I musen, mellan framväxten av den primitiva innerörat från öron vesikler på dag E11 och slutförande av utvecklings programmet vid första tiden efter födseln, flera vågor av cellsignalering och samordnade förändringar i genuttryck sker. Köra från bas till spets cochlea kanalen är ljudet upptäcka sensoriska epitel, eller organ Corti. Utveckling av organ Corti är utsökt kontrolleras så att i slutet av utvecklingen kommer det att bestå av en enda rad av inre hårceller, tre rader av yttre hårceller varvas med fem rader av stödjande celler (två rader av pelare celler, tre rader av Deiters 'celler) 1. Avvikelse från detta exakta order medför hörselnedsättning, heighlighting vikten av studye FATTAT uppkomst och mönstring av den sensoriska epithemlium 2.
In vitro odling av embryonala musen cochlea är ett viktigt verktyg för att studera mekanismerna för utvecklingen av organ Corti. Denna teknik grundades 1974 och under de senaste 40 åren, har använts för att belysa många av de mekanismer genom vilka den sensoriska epitelet specificeras och Cortis organ etablerade 3. Snäckan är ett komplext organ med dynamiska utvecklingsprocesser; en manipulation kan ta så länge som sju dagar att manifestera 1. Till exempel, när man lägger till GSK 3β inhibitorer till ett cochlea explantatet kulturen vid E13, den optimala inkubationstiden för att observera en stark effekt av föreningen är sex dagar 4.
Live avbildning av utvecklings snäckan medger undersökning förändringar i morfologi Cortis organ, förändringar i genuttryck, spårning av migrerande, förökar eller döende celler, och det tillåter realtid observation av resultaten av farmaceutiska medel och störning av signalering vägar. Hittills levande avbildning av snäckanhar främst utförts med hjälp av konfokalmikroskopi att avbilda små områden av Cortis organ under korta tidsperioder 5-8, men denna teknik har begränsningar på grund av explant livskraft. I avbildning av effekterna av långsiktiga manipulationer på långsamma utvecklingsprocesser, är bildmiljön avgörande. Typiskt en konfokala Bildproduktion system använder en fuktig plastlåda som sitter på mikroskopet. Värme och fukt kan komma ut genom luckorna i inkubation rutan där den möter mikroskopbordet, genom access fönstren, genom de svängbara öppningar och genom luckor runt olika delar av microscope- såsom målet eller ljuskällan. Detta är inte optimalt för en hälsosam explantat i mer än två eller tre dagar.
Vi definierar "kuvös mikroskop" som ett inverterat mikroskop förseglat inne i en standard CO2 inkubator, snarare än en inkubator byggd runt mikroskopet. En inkubator mikroskop extenderar livet av experimentet så att i stället för avbildning under två eller tre dagar, kan prover avbildas i upp till två veckor. En inkubator mikroskop ger en utmärkt miljö för celltillväxt och differentiering, med minimal störning till explantation kulturer och standardkontrollerade betingelser. I studier som sker över flera dagar är det vanligt att ta till avbildnings prover dagligen genom att ta bort dem från inkubatorn och transporterar dem till ett inverterat fluorescensmikroskop. Detta förhållningssätt kan arbeta, ta bort disken från inkubatorn fogar stress på känsliga utveckla vävnaden. Förändringar i surhetsgrad odlingsmediet och svängningar i temperaturen på grund av avlägsnande från inkubatorn kan resultera i suboptimal utveckling och ohälsosamt vävnad. Avbildning av samma region vid samma fokalplan och i samma orientering vid varje tidpunkt är extremt utmanande. Genom att använda ett automatiserat system inom en inkubator, är det möjligt att bevara friskavävnad, för att samla in bilderna vid flera tidpunkter och för att säkerställa att samma område fångas i varje ram. Under senare år har flera integrerade mikroskop vävnads inkubatorer har utvecklats, dessa har varit till nytta, inte bara i klinisk praxis 9 men också i stamcells och cancerforskning 10,11.
Här presenterar vi ett protokoll för långsiktig levande avbildning av embryonala mus cochlea explants. Vi använder en automatiserad mikroskope-system i en vanlig CO2 inkubator som har förmågan att ta bilder av flera prover vid inställda tidpunkter. Systemet består av ett inverterat mikroskop inställd inuti en inkubator. Proverna placeras i en roterande podium som tillåter avbildning av multipla prover vid varje tidpunkt. Belysning, bildfångst, och rotation av podiet styrs av ett automatiserat system drivs genom metamorfa programvara. Genom att sätta en avbildningsrutin med hjälp av operatörsprogrammet kan vi ställa ett experiment för att köra upp till two veckor med minimal mänsklig inblandning. I det här exemplet använder vi både ljusa fält och fluorescens för att visa storskalig tillväxt och omarrangemang av snäckan, och specifikt prosensory regionen. I detta experiment kommer hörselsnäckor dissekeras från Sox2 EGFP reporter möss på embryonala dag E13. In vitro kulturer kommer att upprättas och sedan avbildas under fem dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus vävnad skördades från Sox2 EGFP -reporter möss 12 hållna och avlivas i enlighet med kanadensiska rådet om Animal Care riktlinjer för vård och användning av försöksdjur.
1. Odling Embryonala hörselsnäckor
- Supplement Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) genom blandning av 8,89 ml DMEM, 1 ml fetalt bovint serum (FBS), 100 | il av 100x N2 supplement, och 10 | il av 10 mg / ml ciprofloxacin. Supplement Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) genom att blanda 495 ml HBSS med 5 ml av 100% HEPES.
- Förbered glas botten kultur rätter:
- I en huv med laminärt flöde, resuspendera 200 pl basalmembranextrakt substrat i 5 ml DMEM. Förbered 35 mm diameter glasbottenodlingsskålar med 10 mm brunnar. Tillsätt 150 pl substrat / DMEM in till centrum av varje glas botten maträtt. Dessa rätter kan användas efter 40 min inkubation, eller kan lagras i en CO2 OBS: Glas botten rätter används av följande skäl: för att säkerställa att basen av skålen är transparent och passar för avbildning, för att skapa en brunn i mitten av skålen som gör explantaten att bosätta sig i en lätt beläget område och slutligen så att efter ett experiment provet kan bearbetas för immunofärgning och efterföljande analys.
- Förbered arbetsstationen och verktyg:
- Slå på laminärt flöde ren bänk, och spraya ner med 70% EtOH för att skapa en ren arbetsyta. Blöt pincett, skedar, och en svart 184 silikonelastomer skålen (en blandning av 184 silikonelastomer (10 delar), härdningsmedlet (en del) och kol-pulver (2,5 g)) i 70% EtOH.
- I ren arbetsstation, skörd embryon för experimentet. Samla embryon av lämplig dräktighet i iskallt HBSS kompletterad med 1% HEPES.
- Bestäm en extern eller synlig organ som kommer att visareporter aktivitet och undersöka embryona med hjälp av en fluorescerande stereomikroskop. Samla embryon som uppvisar reporteraktivitet i iskall HBSS kompletterad med 1% HEPES som dessa är föremål för experimentet.
- Samla tidsmässiga ben:
- Arbeta snabbt, med hjälp av en kall ljuskälla och fin pincett, samla cheferna på valparna. Var noga med att fästa vid halskotor och nedanför käken för att undvika skador på den temporala ben.
- Öppna försiktigt skallen. Ta hjärnan, trimma bort framsidan av huvudet, och överföra den bakre skallen till frisk iskall HBSS kompletterad med 1% HEPES i en ren skål. Försiktigt dissekera ut jordnötsformade tidsmässiga ben noga med att hålla det vestibulära systemet i takt.
- Dissekera snäckan:
- Överför tidsmässiga ben till en svart silikonelastomerbelagd skålen i iskall HBSS kompletterad med 1% HEPES, stift vestibulära region i benet. Sätt insekter stift påen sned vinkel för att stabilisera temporalbenet och skapa utrymme för tången. Nålning är ett avgörande steg i processen som om temporalbenet tillåts att röra sig för mycket är det mycket svårt att skörda en intakt snäckan.
- Ta försiktigt bort brosket runt snäckan. Sätt en pinne av tången i brosket vid den yttre kanten av basen av snäckan och klipp ett hål i brosket.
- Clip en flik upp sidan, sätt in pinnen i tången och försiktigt separerar taket på kanalen från brosk. Clip horisontellt över toppen och diagonalt, och lyft försiktigt bort den främre delen av kapseln. Sätt i ett stift av tången mellan återstående brosk och kanalen och försiktigt klippa bort det sista avsnittet. Den apikala ytan av snäckan är nu exponerad.
- Börjar på basen, fånga det område där taket på kanalen möter cochlea epitel och öppna cochlea kanalen. Dra försiktigt av taket, putsningvid behov tills den är helt bort. Trimma bort några delar av membranet kvar på den mediala sidan av kanalen. Rengöra rökgasledningen av överskott av mesenkymal vävnad och lösgöra kanalen från vestibulära systemet.
- Kultur explantaten:
- Placera en explant, luminalyta upp, i mitten av ett substrat belagt glas botten odlingsskål, försiktigt dra bort all vätska och låt stå i två minuter. Tillsätt 150 pl kompletterat DMEM droppvis till explantatet, noga med att inte störa den. Skulle explant flyta fritt, flytta med pincett, men se till att explantatet sedimenterar till botten av skålen så att den kan fästa på underlaget.
- Placera glasbotten rätter i en djup 12 cm petriskål diameter, med en liten skål med sterilt vatten för att bibehålla fuktigheten. Satte odlingarna i en 35 ° C inkubator över natt för att explantatet att fästa vid substratet och platta.
2. Live ImagIng
- Välj Explantation prover. Använd en fluorescerande stereomikroskop för att utvärdera tillståndet hos varje explanterade snäckan. Välj bara explants där kanalen är intakt och fäst på glaset från basen till apex.
- Ställ inkubator vid 35 ° C med 5% CO2 till kultur cochlea vävnaden. Sätt kulturerna i inkubatorn mikroskop:
- Aspirera försiktigt av kompletterat DMEM och ersätta med minst 500 l färska medier. För avbildning upp till 6 dagar, är 1-1.5 ml bättre. I de fall där explantaten löst fästa, pipettera en ring av media runt kanten av skålen. Denna extra vätska kommer att göra en miniatyr "fuktkammare" utan att störa Explantation medan den fortsätter att fästa till matrisen.
- Alternativt gångjärn använda skålen täcker öppna locken medan skålen kvar i sin montering i mikroskop om reagens behöver bytas ut under intervall mellan bildsamlingar. Ledade maträtt täcker låta locken varaöppnas utan att störa proverna eller tar bort disken från sina inställningar. Detta bibehåller sin exakta position för efterföljande bild fångar.
- Sätt i glas botten rätter som innehåller lämpliga prover i prov skålen hållaren. Mikroskopet i detta exempel har en roterande plattform som rymmer åtta 35 mm prov rätter.
- Under laminärt flöde huva ersätta plastlock med glaslock och sätt in disken i prov skålen hållaren. Placera provet skålen hållaren inne i inkubatorn se till att inte rubba explants från botten av skålen eller störa media.
- Aspirera försiktigt av kompletterat DMEM och ersätta med minst 500 l färska medier. För avbildning upp till 6 dagar, är 1-1.5 ml bättre. I de fall där explantaten löst fästa, pipettera en ring av media runt kanten av skålen. Denna extra vätska kommer att göra en miniatyr "fuktkammare" utan att störa Explantation medan den fortsätter att fästa till matrisen.
- Ställ in bild rutin:
- Slå på mikroskopet, UV-lampan och kameran och öppna bildprogram.
- Leta proverna, plocka en bildområde, plan fokus och justerar exponeringstider för varje maträtt i sekvens. Välj fokalplanet beror inte bara på synen på Explantation vid start, men alså med tanke på hur vävnaden ska röra sig och hur lång tid kursen kommer att köras.
- Ställ en Z stack centre runt den markerade fokalplanet i fluorescenskanalen. Ställ in frekvens och längd provtagningen för experimentet. Provtagningsfrekvensen kommer att begränsas av den tid det tar att samla in bilder, så detta bör fastställas när du har valt synfält och sätta en Z-stack. I detta fall provtagning sker var 30: e minut under fem dagar. Varaktigheten av experimentet kan vara upp till 14 dagar.
- Skapa en film:
- Vid slutet av tidsperioden förflutit öppna bildfilerna. I det här fallet Metamorph mjukvara som öppnar sekventiella insamlingspunkter används. Ruta för ruta välja den bästa fokalplanet för att visa cellpopulationen av intresse.
- Konvertera dessa bilder till en AVI-fil, eller exportera dem som ett montage för att generera en uppsättning bilder som kan öppnas och analyseras i bildbehandlingsprogram eller konverteras till flera formats använder video programvara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här visar vi ett montage (figur 1) och en film (figur 2) visar hur en typisk organotypisk cochlea Explantation kommer att växa om det pläterade på E13.5. En Sox2 reporter mus användes för att visualisera prosensory regionen. Filmen illustrerar att snäckan undergår tillväxt och konvergens och förlängning, behöver cellerna i det laterala området av grönt Sox2 domän verkar inte för att dela upp som den vävnad som omger den expanderar. Detta är en egenskap hos organ Corti; på E13 den blivande sensoriska epitelet lämnar cellcykeln och därefter känd som den zon av icke-spridning 13. En andra tidsförlopp experiment centrering på mitten basen av en annan cochlea Explantation (figur 3 och 4) visar att då den sträcker sig, smalnar prosensory regionen. Notera att efter tre dagar i odling vävnaden har tillplattad avsevärt så att det är möjligt att visualisera Individubbla fluorescerande celler, medan i början finns det regioner där inre reflektion av ljuset beroende på vävnadstjocklek gör det möjligt att identifiera områden av uttryck, men inte enskilda celler.
Figur 1:. Time - lapse bilder av Sox2 reporter cochlea vävnad samlas under fem dagar Detta montage visar förloppet för Explantation tillväxt med start på dag noll och slutar den dag fem, provtagning var 30 min med hjälp av en 10X objektiv. Explantation fastställdes på E13 och odlades över natten innan avbildning. Som explantatet mognar det både växer och genomgår konvergerande förlängningsrörelser. (A) Sekventiell bilder som visar omfattningen av cochlea tillväxt vid 12 timmars intervall. Synligt ljus kanal övertäckt med GFP fluorescens-genbetygsatt av EGFP Sox2 reporter. Endast (B) GFP fluorescens kanal. Skala stapel motsvarar 200 m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 :. Time-lapse-animering av Sox2 reporter cochlea vävnad samlas under 5 dagar är detta samma explantatet experiment visas i figur 1, är denna tidsramar som valts vid 30 minuters intervall under 5 dagar och kombineras som en AVI-fil för att skapa en film.
Figur 3:. Mid bas genomgår CE rörelser och tillplatt Sequential bilder som visar att den prosensory epitel mitten basen (EGFP) smalnar, sträcker och slätar ut under loppet av fem dagar. Pilar indikerar regionen som smalnar. Ramar som väljs från en 5 dagars time lapse-sekvens med 12 timmars intervall med en 10X objektiv. Skala stapel motsvarar 200 m. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Time-lapse animering av mellanbasen genomgår CE rörelser och tillplatt Animerad time-lapse-sekvens som visar konvergensen och förlängning av sensoriska epitel visas i figur 3 med ramar som valts med 30 minuters intervall..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera tekniska punkter att tänka på när kulturer är etablerade och i upprättandet av tidsförlopp mikroskop för att långsiktigt avbildning.
Vi använder basalmembranmatris som ett substrat för odling av cochlea explantat, men substratet bör matchas till den celltyp. För att till exempel bild neuronala kulturer kan det vara bättre att ge en fibronektin beläggning. Inkubationstemperatur och gassammansättning bör också väljas beroende på vävnadstyp. Att välja en ålder av explantatet är viktigt. Vi börjar på E13 tidigast eftersom riktning mot tillväxt på E12 är mindre förutsägbar. Eftersom det är viktigt att explantat odlas över natten för att fästa på underlaget, bör försök planeras att starta nästa dag. Om ett experiment är att börja på E15 eller äldre, bör kulturer fastställas på E13 som med tiden vävnaden planar och sprider så cellerna är lättare att bilden (se figur 3). Om Cortis organ är som skall avbildas, är det väsentligt att snäckan dissekeras mycket noggrant. Skåror på den laterala kanten av explantatet bryta den inre spänning i vävnaden, därav när snäckan undergår morfologiska omlagringar, cellernas spill "genom revan som bildar en" V "formade protrusion.This utsprång kan förflytta regionen av intresse ur vy . Dessutom måste försiktighet iakttas för att avlägsna så mycket av taket av kanalen på den mediala sidan som möjligt. Denna vävnad fortsätter att föröka sig som Explantation expanderar och kan växa under början av det intressanta området skymma den ur sikte.
När du ställer in bildrutinen måste tillväxten och förändringar i morfologi snäckan vägas noga. Målet bör väljas baseras inte bara på storleken på det område som ska avbildas, men också med hänsyn till om denna region kommer att flytta eller expandera. Celler i den mediala-regionenav snäckan (Figur 1 och 2) dela och flytta inom ett begränsat område, så en stor förstoring kan användas (20X, 40X, 60X). Celler i Cortis organ eller den laterala epitelet kommer dock att röra sig som explantatet växer; en lägre förstoring (10X eller 20X) är bättre, eftersom chanserna att cellerna kommer att förbli i synfältet är högre. Imaging av stationära regioner i snäckan är möjlig vid höga förstoringar. Vi valde att använda en 10X mål i avsnittet representativa resultat eftersom vi ville visa hela explantatet, och eftersom vävnaden rörelsen är dynamisk i tidiga skeden.
Nästa att tänka på är fokalplanet. Med tanke på att explantatet växer utåt och platta, är det troligt att fokalplanet kommer att förändras dramatiskt under tidsförloppet. Om det intressanta är Cortis organ eller lateral epitel, förutse detta och fokusera på cellerna migrerar ut explantatet kan hjälpa. Detta är alså ett argument för att använda de lägre förstoringsgrad. Det är möjligt att ställa in Z stackar för både fluorescens och DIC. Om cellerna av intresse kommer sannolikt att flytta ur fokus, inrätta en Z bunt med 3-5 um per steg kan motverka detta, särskilt om det sista steget är i planet för täckglas. Det kan vara svårt att välja den korrekta planet vid visning av kulturer på dag ett, eftersom densiteten för förpackning av cellerna och reflekterat ljus från omgivande vävnad kan förhindra att en tydlig bild. Vid granskning av ramar för att skapa en film eller montage senare, gör ett noggrant urval av Z-plan även spårning av cellförändringar i tre dimensioner. Experimentet kan pausas vid något tillfälle att justera fokusinställningarna om provet flyttar utanför intervallet.
Live avbildning av ett cochlea Explantation över en vecka ger en ny dimension för att förstå utvecklingen av snäckan som kommer att komplettera konfokala Bildproduktion. Detta är en utmärkt metod att använda när orgel bred lång-TERM undersökning är nödvändig, men kommer inte att ersätta hög förstoring konfokala bildhantering för korttidsstudier enda cell. Valet av teknik är beroende av den typ av vävnad som skall avbildas och ramen för experimentet. Denna teknik gör det möjligt för forskare att undersöka spatio-temporala förändringar i reportergenuttryckning, cellproliferering och migration i realtid och tillåta studier av reportergenen som svar på farmaceutiska medel och livskraft av celler i mer detalj än vad som tidigare var möjligt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Tack till Willy Sun för tekniskt stöd och Dr Kris Gellynck för värdefulla kommentarer och tre anonyma granskare för deras konstruktiva råd. Detta arbete har finansierats av Sunnybrook Hearing Regeneration Initiative
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
References
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
- Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
- Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
- Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
- Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
- Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
- Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
- Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
- Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
- Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).
