Summary
تصوير حي من القوقعة الجنينية لدى الثدييات يمثل تحديا لأن العمليات التنموية في متناول اليد تعمل على التدرج الزمني على مدى عشرة أيام. نحن هنا نقدم وسيلة للزراعة ومن ثم تصوير الأنسجة الجنينية مأخوذة من قوقعة النباتى مراسل الماوس الفلورسنت على مدى خمسة أيام.
Abstract
نحن هنا نقدم وسيلة على المدى الطويل الوقت الفاصل بين التصوير من حي الجنينية إإكسبلنتس الماوس القوقعة. البرنامج التنموي مسؤولة عن بناء أمر غاية، بنية معقدة من عائدات القوقعة الثديية لنحو عشرة أيام. من أجل دراسة التغيرات في التعبير الجيني خلال هذه الفترة وردهم إلى الأدوية أو التلاعب الجيني، والتصوير طويل الأجل أمر ضروري. سابقا، والتصوير الحي، وعادة ما يحد من قابلية الأنسجة explanted في غرفة ترطيب فوق المجهر العادي. وقد وضعت صعوبة في الحفاظ على الظروف المثلى لنمو الثقافة فيما يتعلق الرطوبة ودرجة الحرارة حدود على طول تجارب التصوير. مجهر دمجها في تعديل حاضنة زراعة الأنسجة ويوفر بيئة ممتازة للتصوير على المدى الطويل الحية. في هذه الطريقة ونحن لشرح كيفية إنشاء الفأر الجنينية إإكسبلنتس القوقعة وكيفية استخدام المجهر حاضنة لإجراء الفاصل الزمني imagiنانوغرام باستخدام كل حقل مشرق والمجهري الفلورسنت لدراسة سلوك نموذجي يوم الجنينية (E) 13 النباتى القوقعة وSox2، علامة من الخلايا prosensory من القوقعة، على مدى 5 أيام.
Introduction
القوقعة الثدييات هي جهاز معقد أمر غاية. في الماوس، وبين ظهور الأذن الداخلية البدائية من الحويصلة الأذنية في يوم E11 والانتهاء من البرنامج التنموي في مراحل ما بعد الولادة المبكرة، موجات متعددة من الخلايا مما يشير الى والتغيرات في التعبير الجيني منسقة تحدث. يمتد من القاعدة إلى قمة القناة القوقعة هو صوت كشف ظهارة حسية، أو جهاز كورتي. تطوير جهاز كورتي يتم التحكم بشكل رائع بحيث بنهاية التطوير، وسوف تتكون من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية، وثلاثة صفوف من خلايا الشعر الخارجي تتخللها خمسة صفوف من الخلايا الداعمة (صفين من خلايا عمود، ثلاثة صفوف من خلايا دايترس) 1. الانحراف عن هذه النتائج الترتيب الدقيق في فقدان السمع، heighlighting أهمية studye إف تي إتش إي نشأة والزخرفة من epithemlium الحسية 2.
زراعة في المختبر من كوتش الفأر الجنينيةليا هي أداة أساسية في دراسة آليات تطوير جهاز كورتي. تأسست هذه التقنية في عام 1974 وعلى مدى السنوات ال 40 الماضية، وقد استخدمت لتوضيح العديد من الآليات التي يتم من خلالها تحديد ظهارة حسية وجهاز كورتي إنشاء 3. القوقعة هي جهاز معقد مع العمليات التنموية الحيوية. تلاعب قد تستغرق وقتا طويلا كما سبعة أيام في إظهار 1. على سبيل المثال، عند إضافة مثبطات 3β GSK لثقافة يزدرع في قوقعة E13، فترة الحضانة المثلى لمراقبة تأثير قوي من المجمع هو ستة أيام 4.
التصوير المباشر لتطوير القوقعة يسمح التحقيق في التغييرات في مورفولوجية جهاز كورتي، والتغيرات في التعبير الجيني، وتتبع للهجرة، المتكاثرة أو يموتون الخلايا، وأنه يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من نتائج وكلاء الأدوية وتعطل الإشارات مسارات. حتى الآن، والتصوير من القوقعة العيشوقد أجريت أساسا باستخدام متحد البؤر المجهري لصورة مناطق صغيرة من جهاز كورتي على مدى فترات زمنية قصيرة 5-8، ولكن هذه التقنية لديها قيود بسبب قابلية النباتى. في تصوير آثار التلاعب على المدى الطويل على العمليات التنموية بطيئة، والبيئة التصوير أمر بالغ الأهمية. وعادة ما يستخدم نظام التصوير الحي متحد البؤر مربع من البلاستيك مرطب الذي يجلس على المجهر. يمكن للحرارة والرطوبة الهروب من خلال الثغرات في مربع احتضان حيث يلتقي الجدول المجهر، من خلال النوافذ الوصول، من خلال فتحات يتوقف ومن خلال الفجوات حول أجزاء مختلفة من microscope- مثل الهدف أو مصدر الضوء. ليس هذا هو الأمثل للحفاظ على إإكسبلنتس صحية لأكثر من يومين أو ثلاثة أيام.
نحدد "المجهر حاضنة 'كما مجهر مقلوب مختومة داخل القياسية CO 2 الحاضنة، بدلا من أن تكون حاضنة تتمحور حول المجهر. سابق المجهر الحاضنةيميل إلى الحياة من هذه التجربة بحيث بدلا من التصوير على مدى يومين أو ثلاثة أيام، والعينات ويمكن تصوير لمدة تصل إلى أسبوعين. يوفر المجهر حاضنة بيئة ممتازة لنمو الخلايا والتمايز، مع الحد الأدنى من اضطراب في يزدرع الثقافات والظروف القياسية التي تسيطر عليها. في الدراسات التي تجري على مدى عدة أيام ومن الشائع أن يلجأ إلى عينات التصوير بشكل يومي عن طريق نقلهم من الحاضنة وتحمل لهم المجهر الفلورسنت المقلوب. في حين أن هذا النهج يمكن أن تعمل، وإزالة الأطباق من الحاضنة ينزل الضغط على الأنسجة الحساسة النامي. التغيرات في حموضة المتوسطة زراعة والتقلبات في درجات الحرارة بسبب إزالة من الحاضنة يمكن أن يؤدي إلى تطوير الأمثل والأنسجة غير الصحية. تصوير نفس المنطقة في نفس المستوى البؤري وفي نفس التوجه في كل نقطة زمنية هي صعبة للغاية. باستخدام نظام آلي داخل حاضنة، فمن الممكن للحفاظ على صحة جيدةالأنسجة، لجمع الصور في المزيد من النقاط والوقت لضمان أن يتم التقاط نفس المنطقة في كل إطار. في السنوات الأخيرة تم تطوير عدة حاضنات متكاملة الأنسجة المجهر، وكانت هذه مفيدة ليس فقط في الممارسة السريرية 9 ولكن أيضا في الخلايا الجذعية وأبحاث السرطان 10،11.
هنا نقدم بروتوكول للتصوير الحية على المدى الطويل الجنينية إإكسبلنتس الماوس القوقعة. نستخدم نظام المجهر الآلي داخل القياسية CO 2 الحاضنة التي لديها القدرة على التقاط الصور من عينات متعددة في نقطة زمنية محددة. ويتكون النظام من مجهر مقلوب مجموعة داخل حاضنة. توضع العينات في المنصة الدوارة التي تتيح التصوير عينات متعددة في كل نقطة زمنية. يتم التحكم في الإضاءة، والتقاط الصور، وتناوب على المنصة من قبل النظام الآلي تعمل من خلال برنامج Metamorph. عن طريق وضع روتين التصوير باستخدام برنامج التشغيل نتمكن من تجربة لتشغيل لمدة تصل إلى TWس أسابيع مع الحد الأدنى من التدخل البشري. في هذا المثال يمكننا استخدام كل حقل مشرق ومضان لإظهار نمو واسع النطاق وإعادة ترتيب القوقعة، وتحديدا، في المنطقة prosensory. في هذه التجربة، سيتم تشريح قوقعة من Sox2 EGFP الفئران مراسل في يوم الجنينية E13. سيتم تأسيسها في المختبر الثقافات ومن ثم تصويرها على مدى خمسة أيام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تحصد الأنسجة الماوس من Sox2 EGFP الفئران -reporter 12 حافظ والموت الرحيم وفقا لمبادئ توجيهية المجلس الكندي للرعاية الحيوان لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. التثقيف الجنينية القوقعي
- تكملة Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) عن طريق خلط 8.89 مل من DMEM، 1 مل من مصل بقري جنيني (FBS)، 100 ميكرولتر من 100X N2 ملحق، و 10 ميكرولتر من 10 ملغ / مل سيبروفلوكساسين. تكملة محلول الملح هانك المتوازن (HBSS) عن طريق خلط 495 مل HBSS مع 5 مل من 100٪ HEPES.
- إعداد أطباق ثقافة أسفل الزجاج:
- في غطاء تدفق الصفحي، و resuspend 200 ميكرولتر استخراج غشاء الطابق السفلي الركيزة في 5 مل DMEM. إعداد أطباق زجاجية قطرها 35 ملم ثقافة القاع برصيد 10 ملم الآبار. ماصة 150 ميكرولتر الركيزة / DMEM لفي وسط كل الزجاج قاع الطبق. هذه الأطباق يمكن استخدامها بعد 40 دقيقة الحضانة، أو يمكن تخزينها في CO 2 ملاحظة: يتم استخدام الزجاج القاع أطباق للأسباب التالية: التأكد من أن قاعدة الطبق شفافة ومناسبة للتصوير، لإنشاء بئر في وسط الطبق الذي يسمح للإإكسبلنتس ليستقر في منطقة تقع بسهولة، وأخيرا ذلك أنه بعد تجربة يمكن معالجة المناعية للعينة وتحليلها لاحقا.
- إعداد محطة العمل والأدوات:
- بدوره على تدفق الصفحي مقاعد البدلاء نظيفة، ورذاذ أسفل مع 70٪ ETOH لخلق مساحة عمل نظيفة. نقع ملقط، ملاعق، والأسود 184 طبق سيليكون المطاط الصناعي (مزيج من السيليكون والمطاط الصناعي 184 (10 أجزاء)، وكيل المعالجة (جزء 1) ومسحوق الفحم (2.5 غرام)) في 70٪ ETOH.
- في محطة عمل نظيفة والأجنة حصاد التجربة. جمع الأجنة في الحمل المناسب في الجليد الباردة HBSS تستكمل مع 1٪ HEPES.
- تحديد جهاز خارجي أو مرئية من شأنها أن تثبتالنشاط الصحفي وفحص الأجنة باستخدام مجهر ستيريو الفلورسنت. جمع الأجنة التي تظهر النشاط الصحفي في الجليد الباردة HBSS تستكمل مع HEPES 1٪ حيث أن هذه هي موضوع التجربة.
- جمع العظام الزمنية:
- العمل بسرعة، وذلك باستخدام مصدر ضوء بارد وملقط غرامة، وجمع رؤساء الجراء. الحرص على مقطع في الفقرة العنقية وتحت الفك لتجنب الأضرار التي لحقت العظام الصدغية.
- فتح بعناية الجمجمة. إزالة الدماغ، وتقليم قبالة الجزء الأمامي من الرأس، ونقل الجمجمة الخلفي لHBSS الجليد الباردة العذبة تستكمل مع HEPES 1٪ في طبق نظيف. تشريح بعناية والفول السوداني على شكل عظام الزمانية مع الحرص على الحفاظ على النظام الدهليزي في براعة.
- تشريح القوقعة:
- نقل عظام الزمانية إلى صحن الأسود سيليكون المطاط الصناعي المغلفة في الجليد الباردة HBSS تستكمل مع 1٪ HEPES، دبوس المنطقة الدهليزي من العظام. إدراج دبابيس الحشرات فيزاوية مائلة من أجل تحقيق الاستقرار في العظم الصدغي، وخلق مجال للملقط. التدبيس هو خطوة حاسمة في هذه العملية حيث إذا سمح العظم الصدغي للتحرك كثيرا فمن الصعب جدا أن يحصد أحد القوقعة سليمة.
- إزالة بعناية الغضاريف المحيطة القوقعة. إدراج طينة واحدة من الملقط في الغضروف في الحافة الخارجية للقاعدة القوقعة ومقطع ثقب في الغضروف.
- مقطع رفرف فوق الجانب، تضاف طينة من الملقط وفصل بلطف سقف القناة من الغضروف. مقطع أفقيا في أعلى وقطريا، ورفع بعناية قبالة الباب الأمامي للكبسولة. إدراج الشق من ملقط بين الغضروف المتبقي والقناة ومقطع بلطف القسم الأخير. يتعرض الآن السطح القمي من القوقعة.
- بدءا من القاعدة، وقبض على المنطقة التي فوق سطح القناة يلبي ظهارة القوقعة وفتح قناة القوقعة. تقشر بلطف السطح، وتقليمعند الضرورة حتى تتم إزالته تماما. تقليم من أي أجزاء من الغشاء المتبقية على الجانب الأنسي من القناة. تنظيف القناة من الأنسجة الزائدة الوسيطة وفصل القناة عن النظام الدهليزي.
- ثقافة إإكسبلنتس:
- وضع يزدرع، اللمعية السطحية تصل، في وسط الركيزة الزجاج المطلي طبق ثقافة القاع، ورسم بعناية قبالة كل من السائل ويترك لمدة دقيقتين. إضافة 150 ميكرولتر DMEM تستكمل إسقاط الحكيم إلى النباتى، مع الحرص على عدم الإخلال به. ينبغي أن يزدرع المرجح بالأسهم الحرة، وتعديل بالملقط، ولكن الحرص على أن يزدرع تستقر في قاع الطبق بحيث يمكن أن نعلق على الركيزة.
- وضع أطباق أسفل الزجاج في طبق قطره 12 سم بتري العميق، مع طبق صغير من الماء المعقم للحفاظ على الرطوبة. وضع الثقافات إلى 35 درجة مئوية الحاضنة بين عشية وضحاها من أجل ازدراع لنعلق على الركيزة وتتسطح.
2. لايف ايماججي
- اختيار العينات يزدرع. استخدام المجهر ستيريو الفلورسنت لتقييم حالة كل من القوقعة explanted. فقط حدد إإكسبلنتس حيث القناة سليمة وتعلق على الزجاج من القاعدة إلى قمة.
- تعيين الحاضنة عند 35 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لزراعة الأنسجة قوقعة. وضع الثقافات في حاضنة المجهر:
- نضح بلطف قبالة DMEM تستكمل واستبدالها مع لا يقل عن 500 ميكرولتر وسائل الاعلام الطازج. لتصوير ما يصل إلى 6 أيام، 1-1.5 مل هو أفضل. في الحالات التي تعلق إإكسبلنتس فضفاضة، ماصة حلقة من وسائل الإعلام حول حافة الطبق. وهذا السائل الزائد جعل مصغرة "غرفة ترطيب" دون إزعاج يزدرع في حين أنها لا تزال تعلق على المصفوفة.
- بدلا من ذلك، يتوقف استخدام يغطي الطبق لفتح الأغطية بينما يبقى الطبق في تقريرها المناسب في المجهر إذا كانت بحاجة الكواشف التي يتم تبادلها أثناء الفترات الفاصلة بين مجموعات الصور. يغطي الطبق يتوقف تسمح الأغطية لتكونفتحت من دون إزعاج عينات أو إزالة الأطباق من إعداداتها. هذا يحافظ على الموضع الدقيق من أجل يلتقط صورة لاحقة.
- إدراج الأطباق الزجاجية القاع التي تحتوي على عينات مناسبة في حامل الطبق العينة. المجهر في هذا المثال يحتوي على منصة دوارة الذي يحمل ثمانية أطباق 35 ملم العينة.
- تحت غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي استبدال الأغطية البلاستيكية ذات الأغطية الزجاجية وإدراج الأطباق في حامل الطبق العينة. وضع حامل الطبق عينة داخل الحاضنة مع الحرص على عدم طرد إإكسبلنتس من قاع الطبق أو أن تخل وسائل الإعلام.
- نضح بلطف قبالة DMEM تستكمل واستبدالها مع لا يقل عن 500 ميكرولتر وسائل الاعلام الطازج. لتصوير ما يصل إلى 6 أيام، 1-1.5 مل هو أفضل. في الحالات التي تعلق إإكسبلنتس فضفاضة، ماصة حلقة من وسائل الإعلام حول حافة الطبق. وهذا السائل الزائد جعل مصغرة "غرفة ترطيب" دون إزعاج يزدرع في حين أنها لا تزال تعلق على المصفوفة.
- إعداد روتين التصوير:
- تشغيل المجهر، مصباح الأشعة فوق البنفسجية والكاميرا وفتح برامج التصوير.
- تحديد العينات، واختيار مجال التصوير، وطائرة من التركيز وضبط التعرض مرات لكل طبق في التسلسل. اختيار الطائرة من التركيز ليس فقط اعتمادا على وجهة نظر يزدرع في وقت الانطلاق، ولكن اللهمع الأخذ في الاعتبار كيف ذلك النسيج ستتحرك ومتى سيتم تشغيل مسار الزمن.
- وضع Z كومة تتمحور حول طائرة التنسيق المحدد في قناة مضان. ضبط تردد وطول أخذ العينات للتجربة. تردد أخذ العينات سيتم محدودة بسبب الوقت الذي يستغرقه لجمع الصور، وحتى هذا ينبغي أن تحدد بعد تحديد المجالات النظر ووضع Z المكدس. في هذه الحالة يأخذ العينات تضع كل 30 دقيقة على مدى خمسة أيام. مدة التجربة يمكن أن تصل إلى 14 يوما.
- توليد فيلم:
- في نهاية الفترة الفاصل الزمني فتح ملفات الصور. ويستخدم في هذه الحالة البرمجيات Metamorph الذي يفتح نقاط جمع متسلسلة. الإطار من جانب الإطار اختيار أفضل البؤري لإظهار السكان خلية من الفائدة.
- تحويل هذه الصور إلى ملف .avi، أو تصديرها كما مونتاج لتوليد مجموعة من الصور التي يمكن فتحها وتحليلها في برامج معالجة الصور أو تحويلها إلى شكلية متعددةTS باستخدام برنامج معالجة الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن هنا تظهر المونتاج (الشكل 1) وفيلم (الشكل 2) يدل على كيفية النباتى قوقعة عضوي النمط العادي سوف تنمو إذا مطلي على E13.5. تم استخدام الماوس مراسل Sox2 لتصور المنطقة prosensory. ويوضح الفيلم أن القوقعة يخضع النمو والتقارب والإرشاد، لا يبدو أن الخلايا في المنطقة الجانبية من المجال Sox2 الأخضر لتقسيم الأنسجة المحيطة بها كما أنها توسع. هذا هو سمة من سمات جهاز كورتي. على E13 الظهارة الحسية المحتملين يخرج دورة الخلية، وعرفت فيما بعد باسم منطقة عدم الانتشار 13. تجربة الوقت الفاصل بين الثانية تركز على قاعدة من منتصف النباتى قوقعة مختلف (أرقام 3 و 4) يدل على أن لأنها تمتد، يضيق المنطقة prosensory. ملاحظة أنه بعد ثلاثة أيام في الثقافة وسوت الأنسجة مثل هذا كثيرا أنه من الممكن تصور indiviخلايا الاستشعاع المزدوجة، بينما في بداية هناك مناطق حيث التأمل الداخلي للضوء نظرا لسماكة الأنسجة يجعل من الممكن تحديد مناطق التعبير ولكن الخلايا لا الفردية.
الرقم 1: الزمان - صور مضي مراسل Sox2 الأنسجة القوقعة التي تم جمعها على مدى خمسة أيام ويظهر هذا المونتاج التقدم النمو النباتى بدأت في يوم الصفر وتنتهي في اليوم خمس، وأخذ العينات كل 30 دقيقة باستخدام الهدف 10X. تأسست النباتى على E13 ومثقف أكثر من ليلة قبل التصوير. كما ازدراع ينضج على حد سواء ينمو ويخضع حركات تمديد متقاربة. (A) صور متتابعة تظهر مدى نمو القوقعة في فترات 12 ساعة. قناة الضوء المرئي مضافين مع الجين GFP مضانقام بتقييمه مراسل EGFP Sox2. (ب) GFP قناة مضان فقط. يتوافق شريط النطاق إلى 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : الوقت الفاصل بين الرسوم المتحركة مراسل Sox2 النسيج قوقعة جمعها على مدى 5 أيام وهذا هو نفس التجربة النباتى هو مبين في الشكل 1، يتم تحديد الأطر الزمنية هذه في 30 دقيقة فترات أكثر من 5 أيام ويضم كملف افي لتوليد الفيلم.
الرقم 3: قاعدة منتصف تمر الحركات CE وتسطيح Sequentiصور آل تبين أن ظهارة prosensory القاعدة منتصف (EGFP) يضيق، ويسطح تمتد على مدى 5 أيام. السهام تشير إلى المنطقة التي يضيق. الإطارات المحددة من تسلسل مرور الوقت 5 أيام بواقع 12 ساعة فترات باستخدام الهدف 10X. يتوافق شريط النطاق إلى 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4 : الوقت الفاصل بين الرسوم المتحركة للقاعدة منتصف تمر الحركات CE وتسطيح المتحركة تسلسل الوقت الفاصل يظهر التقارب وتمديد الظهارة الحسية هو مبين في الشكل (3) مع الإطارات المحددة في 30 دقيقة فترات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هناك العديد من النقاط الفنية التي يجب مراعاتها عند إنشاء والثقافات ووضع المجهر مرور الزمن من أجل التصوير على المدى الطويل.
نستخدم مصفوفة غشاء الطابق السفلي باعتبارها الركيزة لزراعة قوقعة إإكسبلنتس، ولكن ينبغي أن يقابل الركيزة إلى نوع من الخلايا. على سبيل المثال، أن الصورة الثقافات العصبية، قد يكون من الأفضل توفير طلاء فبرونيكتين. كما ينبغي اختيار درجة حرارة الحضانة وتكوين الغازات وفقا لنوع الأنسجة. اختيار عمر النباتى هو المهم. نبدأ على E13 في أقرب وقت ممكن لأنه على E12 اتجاه نمو أقل قابلية للتنبؤ. كما أنه من الضروري أن إإكسبلنتس يتم استزراع أكثر من ليلة لنعلق على الركيزة، وينبغي التخطيط لبدء التجارب في اليوم التالي. إن التجربة هي أن تبدأ في E15 أو أكثر، وينبغي إنشاء الثقافات على مر الزمن كما E13 الأنسجة يسطح وينتشر حتى الخلايا هي أسهل للصورة (انظر الشكل 3). إذا كان جهاز كورتي هو الواجب تصويرها، فمن الضروري أن القوقعة يتم تشريح بعناية فائقة. النكات في الحافة الجانبية للازدراع كسر حدة التوتر الداخلي في الأنسجة، وبالتالي عندما يخضع القوقعة إعادة ترتيب المورفولوجية، وخلايا "تسرب" من خلال المسيل للدموع تشكيل "V" على شكل نتوء protrusion.This يمكن ان تتحرك في المنطقة ذات الاهتمام من الرأي . بالإضافة إلى ذلك، يجب الحرص على إزالة أكبر قدر من سقف القناة على الجانب الأنسي ممكن. استمرت هذه الأنسجة لتتكاثر مع توسع النباتى ويمكن أن تنمو فوق الجزء العلوي من المنطقة ذات الاهتمام حجب ذلك عن الأنظار.
عند إعداد روتين التصوير، يجب النظر بعناية في النمو والتغييرات في مورفولوجية القوقعة. وينبغي اختيار الهدف يستند ليس فقط على حجم المنطقة المراد تصويرها، ولكن مع الأخذ في الاعتبار أيضا ما إذا كانت تلك المنطقة ستتحرك أو توسيع. الخلايا في منطقة وسطيمن القوقعة (الشكل 1 و 2) الانقسام والتحرك داخل منطقة محصورة، لذلك التكبير عالية يمكن استخدام (20X، 40X، 60X). الخلايا في جهاز كورتي أو ظهارة الجانبية، مع ذلك، سوف يتحرك مع نمو النباتى. التكبير السفلي (10X 20X أو) هو أفضل، وفرص أن الخلايا سيبقى في مجال الرؤية هي أعلى. التصوير من المناطق الثابتة من القوقعة هو ممكن في تكبير عالية. اخترنا لاستخدام الهدف 10X في قسم نتائج ممثلة لأننا تمنى لإظهار النباتى كله، ولأن الحركة الأنسجة الحيوية في مراحل مبكرة.
المقبل للنظر هو أن الطائرة من التركيز. بالنظر إلى أن يزدرع سينمو إلى الخارج وتتسطح، فمن المرجح أن البؤري سوف تتغير بشكل كبير على مدار الساعة. إذا كانت المنطقة ذات الاهتمام هي جهاز كورتي أو ظهارة الجانبية، وتوقع هذا، والتركيز على الخلايا المهاجرة خارج النباتى يمكن أن تساعد. هذا هو اللهلذلك حجة لاستخدام التكبير أهداف أقل. فمن الممكن وضع أكوام Z لكل من مضان ومدينة دبي للإنترنت. إذا كانت الخلايا من الفائدة من المرجح أن تنتقل من التركيز، وإقامة Z كومة من 3-5 ميكرون في خطوة يمكن مواجهة ذلك، خاصة إذا كانت الخطوة الأخيرة في الطائرة من الزجاج غطاء. يمكن أن يكون من الصعب اختيار الطائرة الصحيحة عند عرض الثقافات في يوم واحد، وكثافة التعبئة للخلايا وينعكس الضوء من الأنسجة المحيطة يمكن أن تمنع رؤية واضحة. عند استعراض الأطر لتوليد فيلم أو المونتاج في وقت لاحق، الاختيار الدقيق للZ-الطائرات كما يسمح تتبع تحركات خلية في ثلاثة أبعاد. يمكن توقفت التجربة في أي لحظة لضبط إعدادات التركيز إذا تحرك العينة خارج النطاق.
تصوير حي لالنباتى قوقعة أكثر من أسبوع يضيف بعدا جديدا لفهم تطور القوقعة التي من شأنها أن تكمل تصوير حي متحد البؤر. هذا هو وسيلة ممتازة لاستخدامها عند الجهاز طويلة واسعةفحص الاجل ضروري، ولكن لن تحل محل عالية التكبير التصوير مبائر للدراسات خلية واحدة على المدى القصير. اختيار الأسلوب يعتمد على نوع النسيج المراد تصويرها وسياق التجربة. وهذه التقنية تسمح للمحققين لدراسة التغيرات المكانية والزمانية في التعبير الجيني مراسل، تكاثر الخلايا والهجرة في الوقت الحقيقي، وتسمح بدراسة استجابة مراسل الجين إلى وكلاء الأدوية وبقاء خلايا بمزيد من التفصيل عن ذلك ممكنا سابقا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
شكرا ليلي الشمس للحصول على المساعدة الفنية والدكتور كريس Gellynck للتعليقات مفيدة وثلاثة المراجعين المجهولين للحصول على المشورة البناءة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل مبادرة التجديد السمع سونيبروك
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
References
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
- Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
- Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
- Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
- Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
- Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
- Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
- Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
- Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
- Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).
