Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר

Published: November 2, 2014 doi: 10.3791/52101
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Biological Sciences Platform, Sunnybrook Research Institute, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Toronto, 3Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Summary

הדמיה חיה של שבלול האוזן של יונקים העובריים היא מאתגרת, כי התהליכים התפתחותיים ביד פועלים על שיפוע זמני על עשרה ימים. כאן אנו מציגים שיטה culturing ולאחר מכן ההדמיה רקמות explant השבלול עוברית שנלקחו מעכבר כתב ניאון בחמישה ימים.

Abstract

כאן אנו מציגים שיטה להדמית הזמן לשגות ארוך טווח של explants שבלול עכבר העוברי בשידור חי. תכנית התפתחותית אחראית על בניית מבנה הורה מאוד, מורכב מתמורת השבלול של יונקים לכעשרה ימים. על מנת ללמוד את השינויים בביטוי הגנים על פני תקופה זו ותגובתם לתרופות או מניפולציה גנטית, הדמיה לטווח ארוך יש צורך. בעבר, הדמיה חיה יש בדרך כלל מוגבלת על ידי יכולת הקיום של רקמת explanted בתא humidified על גבי מיקרוסקופ רגיל. קושי בשמירה על תנאים אופטימליים לצמיחת תרבות בכל קשור ללחות וטמפרטורה יש להציב מגבלות על האורך של ניסויי הדמיה. מיקרוסקופ המשולב בתרבית רקמת חממה שונה מספק סביבה מצוינת להדמיה לטווח ארוכה וחי. בשיטה זו אנו מדגימים כיצד להקים explants שבלול עכבר עוברי וכיצד להשתמש במיקרוסקופ חממה לנהל imagi הזמן לשגותng באמצעות שני שדה בהיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לבחון את התנהגותו של יום עוברי טיפוסי (E) 13 explant שבלול וSox2, סמן של תאי prosensory של השבלול, מעל 5 ימים.

Introduction

השבלול של היונקים הוא איבר מורכב הורה מאוד. בעכבר, בין הופעתה של האוזן הפנימית הפרימיטיבית משלפוחית ​​otic ביום E11 והשלמת התכנית התפתחותית בשלבי לידה מוקדמים, גלים רבים של איתות תא ושינויים מתואמים בביטוי גנים יתקיימו. פועל מבסיס לקודקוד צינור השבלול הוא הצליל זיהוי האפיתל חושית, או איבר של קורטי. פיתוח של האיבר של קורטי נשלט להפליא כך שעד סוף הפיתוח, זה יהיה מורכב משורה אחת של תאי שיער פנימיים, שלוש שורות של תאי שיער חיצוניים וביניהם חמש שורות של תאי תומכים (שתי שורות של תאי עמוד, שלוש שורות של התאים 'Deiters) 1. סטייה מתוצאות סדר המדויקת הזה בירידה בשמיעה, heighlighting חשיבות studye הצטברו בראשית ודפוסים של epithemlium החושי 2.

בתרבית במבחנה של coch העכבר העוברילאה היא כלי חיוני בחקר המנגנונים של התפתחות של האיבר של קורטי. טכניקה זו הוקמה בשנת 1974 ובמשך 40 השנים האחרונות, נעשתה שימוש כדי להבהיר רבים מהמנגנונים שבאמצעותם האפיתל החושית מצוינת והאיבר של הקורט הוקמו 3. השבלול הוא איבר מורכב עם תהליכים התפתחותיים דינמיים; מניפולציה עשויה להימשך עוד כשבעה ימים כדי להגשים 1. לדוגמא, בעת הוספת מעכבי 3β GSK לתרבות explant שבלול בE13, תקופת הדגירה האופטימלית להתבונן השפעה חזקה של המתחם היא שישה ימים 4.

הדמיה חיה של שבלול הפיתוח מאפשרת חקירת שינויים במורפולוגיה של האיבר של קורטי, שינויים בביטוי גנים, מעקב נודד, מתרבים או למות תאים, וזה מאפשר התבוננות בזמן אמת של התוצאות של סוכני תרופות ושיבוש האיתות מסלולים. עד עכשיו, לחיות הדמיה של השבלולבעיקר שבוצע באמצעות מיקרוסקופ confocal לאזורים קטנים תמונה של האיבר של קורטי על פני תקופות זמן קצרות 5-8, אבל טכניקה זו יש מגבלות בשל כדאיות explant. בהדמיה של ההשפעות של מניפולציות לטווח ארוך יותר על תהליכים ההתפתחותיים איטיים, סביבת ההדמיה היא קריטית. בדרך כלל מערכת הדמיה חיה confocal משתמשת קופסא פלסטיק humidified שיושב על המיקרוסקופ. חום ולחות יכולים לברוח דרך הפערים בתיבה דוגרות במפגש שולחן מיקרוסקופ, דרך חלונות הגישה, דרך פתחי צירים ודרך הפערים סביב חלקים שונים של microscope- כגון אובייקטיבי או מקור האור. זה לא אופטימלי לשמירת explants הבריא יותר מימים או שלוש.

אנו מגדירים "מיקרוסקופ חממה 'כמיקרוסקופ הפוכה אטומה בתוך CO 2 באינקובטור סטנדרטי, ולא חממה שנבנתה סביב מיקרוסקופ. לשעבר מיקרוסקופ החממהנוטה החיים של הניסוי כזה שלא הדמיה על שניים או שלושה ימים, ניתן הדמיה דגימות לתקופה של עד שבועיים. מיקרוסקופ חממה מספק סביבה מצוינת לצמיחה והתמיינות של תאים, עם הפרעה מינימאלית לexplant תרבויות ותנאים סטנדרטיים מבוקר. במחקרים שיתקיימו במשך ימים רבים זה מקובל לפנות לדגימות הדמיה על בסיס יומי על ידי הוצאתם מהחממה ונשא אותם למיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. בעוד גישה זו יכולה לעבוד, הסרת המנות מהחממה גורמת ללחץ על רקמת הפיתוח רגישה. שינויים בחומציות של מדיום התרבית ותנודות טמפרטורה בשל ההסרה מן החממה יכולים לגרום להתפתחות תת אופטימלית ורקמות בריאים. הדמיה באותו האזור באותו מישור המוקד ובאותו כיוון בכל נקודת זמן היא מאוד מאתגרת. על ידי שימוש במערכת אוטומטית בתוך חממה, ניתן לשמור על בריאותרקמה, כדי לאסוף תמונות הנמצאות בנקודתי זמן ולהבטיח כי אותו האזור שנתפס בכל מסגרת. בשנים האחרונות כמה חממות רקמת מיקרוסקופ משולבות פותחו, אלה היו שימושיים לא רק בפרקטיקה קלינית 9 אלא גם בתאי גזע וסרטן מחקר 10,11.

כאן אנו מציגים פרוטוקול להדמיה לחיות לטווח הארוך של explants שבלול עכבר העוברי. אנו משתמשים במערכת מיקרוסקופיה אוטומטית בתוך חממת CO 2 סטנדרטית שיש לו את היכולת ללכוד תמונות של דגימות מרובות בנקודות זמן מוגדר. המערכת מורכבת ממיקרוסקופ הפוך להגדיר בתוך חממה. דגימות ממוקמות בבמה מסתובבת המאפשרת הדמיה של דגימות מרובות בכל נקודת זמן. תאורה, לכידת תמונה, והסיבוב של הבמה נשלטות על ידי מערכת אוטומטית המופעלת באמצעות תוכנת Metamorph. על ידי הגדרה שגרתית הדמיה באמצעות תוכנת ההפעלה אנו יכולים להגדיר ניסוי כדי לרוץ עד TWשבועות o עם התערבות אנושית מינימאלית. בדוגמא זו אנו משתמשים הן שדה הקרינה בהירים להציג צמיחה בקנה מידה גדולה וסידור מחדש של השבלול, ובאופן ספציפי, באזור prosensory. בניסוי זה, cochleae יהיה גזור מעכברי כתב Sox2 EGFP ביום עוברי E13. תרבויות במבחנה תוקמנה ולאחר מכן צילם במשך חמישה ימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

רקמת העכבר הייתה שנקטפו מן Sox2 EGFP -reporter עכברי 12 נשמרו ומורדמים בבהתאם להחלטת מועצה קנדית על הנחיות טיפול בבעלי חיים לטיפול ולשימוש בחיות מעבדה.

1. Culturing עוברי Cochleae

  1. להשלים הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) על ידי ערבוב 8.89 מיליליטר של DMEM, 1 מיליליטר של סרום שור העובר (FBS), של 100x תוספת N2 100 μl, ו -10 μl של 10 מ"ג / מיליליטר ציפרופלוקסצין. תוספת מלח הפתרון מאוזן של האנק (HBSS) על ידי ערבוב 495 מיליליטר HBSS עם 5 מיליליטר של HEPES 100%.
  2. הכן מנות תרבות תחתית זכוכית:
    1. בזרימה למינרית, resuspend 200 מצע תמצית קרום במרתף μl ב 5 מיליליטר DMEM. הכן מנות תרבות תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ עם 10 בארות מ"מ. פיפטה מצע / DMEM 150 μl למרכזו של כל כוס תחתית צלחת. ניתן להשתמש בכלים אלה לאחר דגירה 40 דקות, או יכולים לאחסן בCO 2 הערה: זכוכית תחתית מנות משמשות מהסיבות הבאות: כדי להבטיח כי הבסיס של המנה הוא שקוף ומתאים להדמיה, כדי ליצור גם במרכז הצלחת, המאפשרת explants להתיישב באזור הממוקם בקלות ובסופו של דבר כך שלאחר ניסוי המדגם יכול להיות מעובד לimmunostaining וניתוח שלאחר מכן.
  3. הכן את תחנת העבודה וכלים:
    1. הפעל את הספסל הנקי הזרימה למינרית, ולרסס למטה עם 70% EtOH ליצור מרחב עבודה נקי. משרים מלקחיים, כפות, וצלחת שחורה 184 אלסטומר סיליקון (תערובת של אלסטומר 184 סיליקון (10 חלקים), סוכן ריפוי (חלק 1) ואבקת פחם (2.5 גר ')) בEtOH 70%.
  4. בתחנת העבודה נקייה, עוברי קציר לצורך הניסוי. איסוף עובר מההריון המתאים בקרח HBSS הקר בתוספת 1% HEPES.
    1. לקבוע איבר חיצוני או גלוי שידגיםפעילות וכתב לבחון את העוברים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו ניאון. לאסוף את העוברים שתערוכת פעילות עיתונאית בקרח HBSS הקר בתוספת HEPES 1% כמו אלה הם הנושא של הניסוי.
  5. לאסוף עצמות זמניות:
    1. עבודה במהירות, תוך שימוש במקור אור מגניב ומלקחיים בסדר, לאסוף את ראשי הגורים. דואג לקליפ בחוליות הצוואר ומתחת ללסת כדי למנוע נזק לעצמות הזמניות.
    2. לפתוח בזהירות את הגולגולת. הסר את המוח, לקצץ את החלק הקדמי של הראש, ולהעביר את הגולגולת האחורית לHBSS קרח הטרי הקר בתוספת HEPES% 1 בצלחת נקייה. לנתח בזהירות העצמות הזמניות צורת הבוטן מקפידים לשמור על מערכת שיווי המשקל בטקט.
  6. לנתח את השבלול:
    1. העבר את העצמות הזמניות לצלחת מצופה אלסטומר סיליקון השחור בקרח HBSS הקר בתוספת 1% HEPES, להצמיד אזור שיווי המשקל של העצם. הכנס סיכות חרקים בזווית אלכסונית כדי לייצב את העצם הטמפורלית וליצור מקום למלקחיים. נעיצה היא צעד מכריע בתהליך כאילו העצם הטמפורלית מותר לנוע יותר מדי קשה מאוד למסוק שבלול בשלמותה.
    2. מוציא בזהירות את הסחוס המקיף את שבלול האוזן. הכנס שן אחד המלקחיים לתוך הסחוס בקצה החיצוני של הבסיס של השבלול וקליפ חור בסחוס.
    3. קליפ דש בצד, להכניס את שן של המלקחיים ובעדינות להפריד את הגג של הצינור מהסחוס. קליפ אופקי לרוחב החלק העליון ואלכסון, והרימו בזהירות מהחלק הקדמי של הקפסולה. הכנס שיניים של המלקחיים בין הסחוס שנותר ואת הצינור בעדינות קליפ מהחלק האחרון. משטח הפסגה של השבלול נחשף עכשיו.
    4. החל בבסיס, לתפוס את האזור שבו הגג של הצינור עומד באפיתל השבלול ולפתוח את צינור השבלול. לקלף בעדינות מהגג, זמירהבעת צורך, עד להסרה מוחלטת. חתוך את כל חלקים של קרום שנותר בצד המדיאלי של הצינור. נקה את הצינור של רקמת mesenchymal עודפת ולנתק את הצינור ממערכת שיווי המשקל.
  7. תרבות explants:
    1. הנח explant, משטח עד לומינל, במרכז צלחת תרבות תחתית זכוכית מצופה מצע, בזהירות לצייר את כל הנוזלים ולהשאיר למשך שתי דקות. להוסיף 150 μl בתוספת DMEM הירידה מבחינת לexplant, נזהר שלא להפריע לו. צריך explant לצוף חופשי, למקם מחדש עם מלקחיים, אבל דואג שexplant ישקע לתחתית הצלחת, כך שהוא יכול לצרף המצע.
    2. הנח את צלחות זכוכית תחתונה בצלחת פטרי בקוטר 12 סנטימטר עמוקה, עם מנה קטנה של מים סטריליים כדי לשמור על לחות. שים התרבויות לC חממת 35 ° לילה על מנת שexplant לצרף את המצע ולשטח.

2. לגור מתאר לעצמיing

  1. בחר דגימות explant. השתמש במיקרוסקופ סטריאו ניאון כדי להעריך את מצבו של כל שבלול explanted. לבחור רק explants בי הצינור שלם ומחובר לכוס מבסיס לקודקוד.
  2. הגדר את החממה ב 35 ° C עם 5% CO 2 לרקמת שבלול התרבות. שים תרבויות למיקרוסקופ החממה:
    1. לשאוב בעדינות את DMEM בתוספת ולהחליף עם לפחות 500 μl תקשורת טרי. עבור הדמיה עד 6 ימים, 1-1.5 מיליליטר הוא טוב יותר. במקרים בהם explants הם מחוברים באופן רופף, פיפטה טבעת של תקשורת סביב הקצה של המנה. נוזל נוסף זה יגרום "תא humidified 'זעיר מבלי להפריע explant בזמן שהוא ממשיך לצרף למטריצה.
      1. לחלופין, שימוש צירים צלחת מכסה כדי לפתוח את המכסים ואילו במנה נשאר בשלה ראוי במיקרוסקופ אם ריאגנטים צריכים להיות מוחלפים בהפסקות בין אוספי תמונות. כיסויי צלחת צירים לאפשר המכסים להיותנפתח מבלי להפריע דוגמאות או הסרת המנות מההגדרות שלהם. זה שומר את המיקום המדויק שלהם ללוכדים תמונה שלאחר מכן.
    2. הכנס את הכלים מזכוכית תחתונה המכילים דגימות מתאימות לבעל צלחת מדגם. מיקרוסקופ בדוגמא זו יש פלטפורמה מסתובבת שמחזיקה שמונה מנות מדגם 35 מ"מ.
    3. תחת מכסה המנוע הזרימה למינרית להחליף את מכסי פלסטיק עם מכסי זכוכית והכנס את המנות לבעל צלחת מדגם. הנח את בעל צלחת מדגם בתוך מטפל חממה שלא לעקור את explants מהחלק התחתון של המנה או להפריע לתקשורת.
  3. הגדר את שגרת ההדמיה:
    1. לעבור על המיקרוסקופ, מנורת UV ומצלמה ופתח את תוכנת ההדמיה.
    2. אתר את הדגימות, לאסוף אזור הדמיה, מטוס של מוקד ולהתאים זמני חשיפה לכל מנה ברצף. בחר המטוס של מוקד תלוי לא רק במבט של explant בעת ההתחלה, אבל אלכך בהתחשב באופן שבו הרקמה תעבור וכמה זמן כמובן הזמן ירוץ.
    3. להגדיר ערימת Z שבמרכזו מישור המוקד הנבחר בערוץ הקרינה. הגדר את התדירות ואורך הדגימה לצורך הניסוי. תדירות הדגימה תהיה מוגבלת על ידי הזמן שנדרש כדי לאסוף תמונות, כך זה צריך להיקבע לאחר בחירת שדות מבט והגדרת ערימת Z. במקרה זה דגימה מתקיימת בכל 30 דקות על פני חמישה ימים. משך הניסוי יכול להיות עד 14 יום.
  4. צור סרט:
    1. בתום תקופת הזמן לשגות לפתוח את קבצי תמונה. במקרה זה תוכנת Metamorph שנפתחה נקודות איסוף רציפות משמשת. פריים אחר פריים לבחור את מישור המוקד הטוב ביותר להצגת אוכלוסיית התא של עניין.
    2. המרת תמונות אלה לקובץ .avi, או לייצא אותם כמונטאז 'כדי ליצור סט של תמונות שניתן לפתוח ונותחו בתוכנת עיבוד תמונה או להמרה לפורמה מרובהTS באמצעות תוכנת עיבוד וידאו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאן אנו מראים מונטאז '(איור 1) וסרט (איור 2) המדגים כיצד explant שבלול organotypic טיפוסי יגדל אם מצופה על E13.5. עכבר כתב Sox2 שימש כדי להמחיש את אזור prosensory. הסרט ממחיש כי השבלול עובר צמיחה והתכנסות וסיומת, לא נראים התאים באזור הלטרלי של תחום Sox2 הירוק לחלק כמו הרקמה המקיפה אותה מתרחב. זהו מאפיין של האיבר של קורטי; על E13 האפיתל החושית הפוטנציאלי יוצאת מחזור התא, והוא ידוע בהמשך כאזור של אי-הפצה 13. ניסוי הזמן לשגות שני המתמקד בבסיס באמצע של explant שבלול שונה (איורים 3 ו -4) מוכיח כי כפי שהוא מרחיב, אזור prosensory מצמצם. שימו לב שלאחר שלושה ימים בתרבות הרקמות שטוחות במידה ניכרת כך שאפשר לדמיין indiviתאי fluorescing כפולים, ואילו בתחילת יש אזורים שבם השתקפות הפנימית של האור בשל עובי רקמה מאפשר לזהות אזורים של ביטוי, אבל תאים לא בודדים.

איור 1
איור 1:. זמן - תמונות לשגות של רקמת שבלול כתב Sox2 שנאסף במשך חמישה ימים מונטאז 'זה מראה את ההתקדמות של גידול explant מתחיל ביום אפס וסיומה ביום חמש, דגימת כל 30 דקות באמצעות מטרת 10X. Explant הוקמה על E13 ותרבותי במשך הלילה לפני ההדמיה. כexplant מתבגר זה גם גדל ועובר תנועות הרחבה מתכנסת. () תמונות רציפות המציגות את היקף צמיחת שבלול ב 12 מרווחי שעה. ערוץ אור הנראה ועליהן גן GFP הקרינהעל פי דירוג של כתב EGFP Sox2. ערוץ GFP הקרינה (ב) בלבד. סרגל קנה מידה מתאים ל200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:. אנימציה זמן לשגות של רקמת שבלול כתב Sox2 שנאסף במשך 5 ימים זה אותו ניסוי explant מצויינים באיור 1, מסגרות זמן זה נבחרו במרווחי זמן של 30 דקות על פני 5 ימים ומשולבים כקובץ .avi ליצור סרט.

איור 3
איור 3:. בסיס אמצע עובר תנועות CE ומשטח Sequentiתמונות אל מראים כי אפיתל prosensory של אמצע הבסיס (EGFP) מצמצם, מרחיב ומשתטח במהלך 5 ימים. חצים מצביעים על אזור שהולך וצר. מסגרות שנבחרו מתוך רצף הזמן לשגות 5 יום ב 12 מרווחי שעות באמצעות מטרת 10X. סרגל קנה מידה מתאים ל200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: אנימציה זמן לשגות של בסיס אמצע עובר תנועות CE ומשטח את רצף הזמן לשגות אנימציה מראה התכנסות והרחבה של האפיתל החושית שמוצגת באיור 3 עם מסגרות שנבחרו במרווחי זמן של 30 דקות..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנן מספר נקודות טכניות לשקול בעת תרבויות הוקמו ובהקמת מיקרוסקופ הזמן לשגות במטרה להדמיה לטווח ארוך.

אנו משתמשים במטריצת קרום במרתף כמצע לculturing explants שבלול, אבל המצע צריך להיות מותאם לסוג התא. לדוגמא, לתרבויות עצביות תמונה, זה יכול להיות טוב יותר כדי לספק ציפוי פיברונקטין. צריכה להיות גם נבחרו טמפרטורת דגירה ובהרכב גז בהתאם לסוג רקמה. בחירת גיל explant חשובה. אנחנו מתחילים בE13 בבית המוקדם, כי על E12 כיוון הצמיחה הוא פחות צפוי. כפי שהוא חיוני כי explants בתרבית לאורך הלילה לצרף את המצע, יש לתכנן ניסויים להתחיל את היום הבא. אם ניסוי הוא להתחיל בE15 או מבוגר, יש להקי תרבויות על E13 כלאורך זמן הרקמה משתטחת ומתפשטת כל כך התאים קלים יותר לתמונה (ראה איור 3). אם האיבר של קורטי הוא להיות צילם, זה חיוני כי השבלול הוא גזור בזהירות רבה. ניקס בקצה הלטרלי של explant לשבור את המתח הפנימי של הרקמה, ולכן כאשר השבלול עובר שחלופים מורפולוגיים, "לשפוך" תאים דרך הדמעה יוצרת 'וי' בצורת בליטת protrusion.This יכול להזיז את האזור של עניין מחוץ לתצוגה . בנוסף, יש להקפיד להסיר כמה שיותר הגג של הצינור בצד המדיאלי ככל האפשר. רקמה זו ממשיכה להתרבות כexplant מתרחב ויכול לגדול מעל לאזור של עניין והסתר אותו מתצוגה.

בעת ההגדרה השגרתית ההדמיה, הצמיחה ושינויים במורפולוגיה של השבלול יש לשקול בזהירות. יש לבחור האובייקטיבי מבוסס לא רק על גודלו של האזור להיות צילם, אלא גם לקחת בחשבון אם כי האזור יהיה להעביר או להרחיב. תאים באזור המדיאלישל השבלול (איור 1 ו -2) הפרד ולנוע בתוך אזור מוגבל, ולכן הגדלה גבוהה יכולה לשמש (20X, 40X, 60x). תאים באיבר של קורט או אפיתל לרוחב, לעומת זאת, יעברו כexplant גדל; הגדלה נמוכה (10X או 20X) היא טובה יותר, כפי שהסיכוי שהתאים יישארו בשדה הראייה גבוה יותר. הדמיה של אזורים נייחים של השבלול היא אפשרית בהגדלה גבוהה. בחרנו להשתמש במטרת 10X בסעיף תוצאות הנציג כי אנחנו רוצים להראות לכל explant, וכי תנועת הרקמה היא דינמית בשלבים מוקדמים.

הבא הוא לשקול המטוס של מוקד. בהתחשב בכך שexplant יגדל כלפי חוץ ולשטח, סביר להניח כי את מישור המוקד ישתנה באופן דרמטי במהלך הזמן. אם האזור של עניין הוא האיבר של קורטי או אפיתל לרוחב, מצפה זה ומתמקד בתאים הנודדים מexplant יכול לעזור. זהו אלכך טענה לשימוש ביעדי ההגדלה הנמוכות. ניתן להגדיר ערימות Z לשתי הקרינה ודסק"ש. אם התאים של ריבית עלולים לצאת מפוקוס, הקמת ערימת Z של 3-5 מיקרומטר לכל צעד יכול לנטרל את זה, במיוחד אם השלב האחרון הוא במישור של מכסה הזכוכית. זה יכול להיות קשה לבחור את המטוס הנכון בעת ​​הצגת תרבויות ביום אחד, כמו הצפיפות של אריזה של התאים ואור המשתקף מרקמות יכולה למנוע תצוגה ברורה. בעת בדיקת המסגרות ליצירת סרט או מונטאז 'מאוחר יותר, בחירה זהירה של Z-מטוסים גם מאפשרת מעקב אחר תנועות תא בשלושה ממדים. הניסוי יכול להיות מושהה בכל נקודה על מנת להתאים את הגדרות הפוקוס אם המדגם נע מחוץ לטווח.

הדמיה חיה של explant שבלול יותר משבוע מוסיפה ממד חדש להבנת התפתחות של השבלול שישלים הדמיה חיה confocal. זוהי שיטה מצוינת לשימוש בעת ארוך רחב איברבדיקת -term היא הכרחית, אך לא תחליף הדמיה confocal הגדלה גבוהה ללימודים בתא בודד לטווח קצר. בחירה של טכניקה תלויה בסוג של רקמה להיות צילם וההקשר של הניסוי. טכניקה זו תאפשר לחוקרים לבחון את השינויים במרחב ובזמן בביטוי עיתונאי גן, התפשטות תאים והגירה בזמן אמת ומאפשרים לימוד של תגובת גן הכתב לסוכנים ולכדאיות תרופות של תאים בפירוט רב יותר מאשר בעבר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש לי המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

תודה לך וילי שמש לקבלת סיוע טכני וד"ר קריס Gellynck על הערות מועילות ושלושה מבקרים האנונימיים על העצה הבונה. עבודה זו מומנה על ידי יוזמת התחדשות השמיעה Sunnybrook

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle media Gibco 12430 Multiple brands manufacture this
Basement membrane extract  Corning 354230 Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.
http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29
Fetal bovine serum Gibco 16000044 Multiple brands manufacture this
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
HEPES Gibco 5630080 Multiple brands manufacture this
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
100 x N2 supplement Gibco 17502-048 Multiple brands manufacture this
http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete=
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850-5G-F Multiple brands manufacture this
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&region=CA
Hank's balanced salt solution Gibco 14170161 Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.
http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s
Fine Forceps Fine Science tools 11254-20 Size number 5
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29
Curette  Fine Science Tools 10080-05 size 1 mm 
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118
Insect Pins Fine Science Tools 26001-35 Must be stainless Steel
http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124
50 mm plastic dishes Corning/Falcon 351006 Multiple brands manufacture this
charcoal Sigma Aldrich 05105-250G Multiple brands manufacture similar items
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&region=CA
184 silicone elastomer Dow/Corning  SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT Dishes are home made several weeks in advance.  Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291
Glass bottom dishes MatTek P35G-0-10-C The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.  35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.
http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2
Stereomicroscope Zeiss  495101-9804-000  Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html
Cold Light Source Zeiss 000000-1063-182 Multiple brands manufacture similar items
http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html
Fluorescent Stereomicroscope  Leica microsystems Contact Leica microsystems Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items
http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/
Incubator Microscope +imaging software Olympus Contact Olympus Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.
http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0
Clean bench Thermo Scientific 51029701 Multiple brands manufacture similar items
http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html
CO2 incubator Thermo Scientific 3310 Multiple brands manufacture similar items
http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html
Laminar Flow hood Thermo Scientific 51026651 Multiple brands manufacture similar items
http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
  2. Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
  3. Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
  4. Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
  5. Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
  6. Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
  7. Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
  8. Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
  9. Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
  10. Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
  11. Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
  12. Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
  13. Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 93 חי-הדמיה זמן לשגות שבלול אוזן עכבר כתב פיתוח מיקרוסקופ חממה Sox2
לטווח ארוך זמן פקיעת הדמיה של Explants שבלול העכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mulvaney, J. F., Dabdoub, A.… More

Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants. J. Vis. Exp. (93), e52101, doi:10.3791/52101 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter